966 resultados para |Nested-PCR
Resumo:
A leishmaniose tegumentar (LT) encontra-se em expanso no Estado do Par, Brasil. Juruti um dos 143 municpios desse Estado e atualmente cenrio de grandes transformaes ambientais devido minerao de bauxita, o que poder influenciar o padro de transmisso. Objetivo: Este estudo buscou elucidar aspectos epidemiolgicos relevantes para o controle da LT em Juruti. Materiais e Mtodos: A frequncia de LT e o perfil dos pacientes no hospital municipal "Francisco Barros" foram determinados de janeiro a dezembro/2007. Espcies de flebotomneos silvestres existentes no entorno de uma rea de prospeco da bauxita foram tambm descritas, durante levantamento entomolgico em janeiro/2008 (armadilha Shannon/18h s 20h/2 noites). Em 21 indivduos, portadores de leso cutnea suspeita de LT, bipsias de pele foram realizadas entre fevereiro e junho de 2007. Neste grupo procedeu-se ao diagnstico parasitolgico (esfregao corado e cultura), molecular e teste intradrmico de Montenegro. Utilizaram-se sondas de DNA ribossomal (PCR-SSUrDNA) gnero especficas (S4, S12; S17, S18) e de G6PD, para distinguir o subgnero Viannia (ISVC, ISVA: ISVC, ISVG) e a espcie L. (V.) braziliensis (ISVC, ISVA; ISVC, ISVB). Resultados: No ano de 2007 foram confirmados 42 casos novos de LT, com mdia mensal inferior a quatro (3,5 0,8), maior frequncia em julho (11) e menor em junho e novembro (0). A maioria dos pacientes foi de homens (41/42, 98%) com menos de 20 anos (<10 anos: 30%; 10-20: 57%; 20-40: 12%). A maioria tambm residia em localidades rurais (33/42, 79%), incluindo reas impactadas pela minerao (19/42, 45%), e exercia atividades de risco (28/42, 67%). Doze eram funcionrios de empresas (29%). A anlise molecular das 21 amostras identificou 12 resultados positivos para o gnero Leishmania (57%), sendo 11 (52%) parasitologicamente confirmados. A PCRG6PD identificou 75% das amostras como sendo L. (V.) braziliensis. As demais (3/12, 25%) no hibridizaram com os oligonucleotdeos da PCR-G6PD e, por isso, os produtos da reao de nested-PCR SSUrDNA foram clonados e sequenciados, confirmando que se tratavam de Leishmania (Viannia) sp. Apenas 9/12 (75%) casos confirmados pelos mtodos parasitolgico e/ou olecular tiveram reaes de hipersensibilidade tardia em resposta ao antgeno de Montenegro, cujos dimetros variaram de 7 a 40mm (16,3 3,2). Capturaram-se 105 flebotomneos de 13 espcies nas seguintes frequncias: 1- Lutzomyia (Ps.) geniculata (23, 22%), 2- Lutzomyia (Ps.) paraensis (21, 20%), 3- Lutzomyia (Ps.) complexa (18, 17%), 4-Lutzomyia (Ps.) davisi (10, 10%), 5- Lutzomyia (N.) flaviscutellata (13, 13%) e outras oito espcies (20, 18%). Discusso: Espcies de Leishmania do subgnero Viannia, sobretudo L. (V.) braziliensis predominam em Juruti, o que compatvel com o extenso dimetro das reaes cutneas observadas ao antgeno de Montenegro e com os relatos comuns de persistncia e recidiva, apesar do tratamento especfico. Entre os flebotomneos antropfilos destacam-se L. (Ps.) complexa (17%) e L. (Ps.) flaviscutellata (13%) por serem vetores de L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis respectivamente, associadas s formas severas da LT humana. Concluso: Medidas de controle em Juruti devem priorizar a reduo da morbidade, diagnstico precoce, busca ativa de LT humana, vigilncia entomolgica e de microambientes no entorno da rea de impacto de minerao.
Resumo:
Uma das principais caractersticas do Vrus da imunodeficincia humana (HIV) sua grande diversidade gentica. O presente trabalho tem como objetivo descrever a epidemiologia molecular do HIV-1 circulante na cidade Macap, Amap, assim como os fatores associados aquisio da infeco e correlacionar estes com os subtipos virais encontrados e as informaes epidemiolgicas da populao examinada. Amostras de sangue de 48 indivduos portadores do HIV foram colhidas no Servio de Assistncia Especializada (SAE) da cidade de Macap, no perodo de junho de 2003 a junho de 2004. Aps a extrao do DNA, foi realizada a amplificao de 297 pb da protease (gene pro) por meio da tcnica de Nested PCR, sendo seqenciadas, posteriormente, para a determinao dos subtipos virais. Foram identificados os subtipos B (93,7%) e F (6,3%) na cidade de Macap, que so os mais prevalentes no Brasil, no tendo sido observada associao entre os subtipos do HV-1 circulantes nesta cidade e a preferncia sexual. No entanto, uma parcela significativa da populao examinada possui um baixo grau de escolaridade, caracterstica esta que reflete a maior parcela populao infectada pelo HIV no Brasil.
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A infeco pelo HTLV-1/2 j foi investigada em diversas populaes, mostrando prevalncia varivel conforme a rea geogrfica, grupos tnicos e subpopulaes analisadas. Em estudos brasileiros foi observada uma maior prevalncia nos Estados da Bahia e do Par. O presente estudo teve como objetivo avaliar a prevalncia do HTLV em mulheres grvidas na cidade de Belm, Par, por meio de tcnicas sorolgicas e moleculares. Foram coletadas 1.027 amostras de sangue e alquotas de plasmas foram testadas para a presena de anticorpos anti-HTLV-1/2, utilizando o mtodo imunoenzimtico do tipo ELISA. A confirmao da infeco e diferenciao dos tipos e subtipos virais foi realizada por meio da Reao em Cadeia mediada pela Polimerase em duas etapas (Nested PCR) atravs da amplificao gnica das regies pX, env e 5LTR seguido da anlise de RFLP e seqenciamento. Foram detectados seis (0,58%) casos de sororreatividade para o HTLV que posteriormente foram confirmados pela amplificao de um fragmento de 159 pb da regio pX. A anlise de RFLP com a enzima TaqI mostrou que quatro (66,7%) amostras eram positivas para HTLV-1 e duas (33,3%) para HTLV-2. Uma das amostras HTLV-2 teve o fragmento de 630 pb do gene env amplificado. A anlise com a endonuclease XhoI mostrou a presena de um perfil de RFLP caracterstico dos subtipos HTLV-2a/2c. Duas amostras HTLV-1 e uma HTLV-2 tiveram a regio 5LTR amplificada e seqenciada. Por meio da anlise filogentica foi possvel classificar as amostras HTLV-1 como Cosmopolita Transcontinental e a HTLV-2 como pertencente ao subtipo HTLV-2c. Esse estudo mostra a relevncia de se introduzir o teste para HTLV na triagem pr-natal, a fim de reduzir transmisso vertical e horizontal em nosso estado.
Resumo:
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)
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Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)
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Introduction: This study confirmed the absence of natural infection with Xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV) or XMRV-related disease in human populations of the Brazilian Amazon basin. We demonstrated that 803 individuals of both sexes, who were residents of Belem in the Brazilian State of Par, were not infected with XMRV. Methods: Individuals were divided into 4 subgroups: healthy individuals, individuals infected with human immunodeficiency virus, type 1 (HIV-1), individuals infected with human T-lymphotrophic virus, types 1 or 2 (HTLV-1/2), and individuals with prostate cancer. XMRV infection was investigated by nested PCR to detect the viral gag gene and by quantitative PCR to detect pol. Results: There was no amplification of either gag or pol segments from XRMV in any of the samples examined. Conclusions: This study supports the conclusions of the studies that eventually led to the retraction of the original study reporting the association between XMRV and human diseases.
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O vrus Influenza o responsvel pela gripe, uma doena que ocasiona milhes de mortes e hospitalizaes todos os anos. Nas infeces severas, especialmente em pessoas com risco para complicaes, os antivirais tornam-se os principais meios para o manejo clnico, merecendo especial destaque os inibidores da neuraminidase (INAs). De fato, na pandemia de 2009 a Organizao Mundial da Sade (OMS) recomendou o uso do oseltamivir para o tratamento dos doentes. Porm, devido evoluo gentica viral, surgiram cepas com mutaes no gene codificador da neuraminidase (NA) responsveis por substituies aminoacdicas que levam resistncia aos frmacos INAs. Assim, a OMS passou a recomendar a vigilncia de resistncia genotpica para os vrus Influenza. Este trabalho teve como objetivos verificar a ocorrncia de mutaes no gene codificador da NA dos vrus Influenza A (H1N1) pandmico que possam estar relacionadas resistncia aos INAs em cepas circulantes na mesorregio metropolitana de Belm no perodo de maio de 2009 a maio de 2012 e analisar, atravs da modelagem de protenas, as substituies aminoacdicas da NA que possam estar influenciando na conformao protica. Durante o perodo de estudo, foram recebidas no Laboratrio de Vrus Respiratrios 2619 amostras clnicas de pacientes que apresentavam sinais e sintomas de infeco respiratria aguda com at cinco dias de evoluo. Para a deteco do genoma viral foi feita a extrao do RNA viral, seguida de RT-PCR em tempo real utilizando marcadores especficos para Influenza A H1N1pdm, resultando em 744 (28,4%) positivas. Parte das amostras positivas foram ento inoculadas em clulas MDCK. Para as amostras isoladas em cultura de clulas, foi feita uma nova extrao do RNA viral seguida de uma RT-PCR e semi-nested (PCR) utilizando iniciadores especficos para o gene NA, e posterior anlise em sequenciador automtico ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems). A modelagem molecular da NA foi realizada atravs dos softwares SWISS-MODEL, MODELLER 9.10, PROCHECK, VERIFY3D e PYMOL. A anlise parcial das sequncias da neuraminidase nas amostras sequenciadas mostrou que no houve a circulao de cepas de vrus H1N1pdm com a mutao H275Y, a principal envolvida na resistncia ao oseltamivir. Porm, em duas amostras foi identificada a substituio D199N que j foi relatada em vrios estudos mostrando uma possvel associao com o aumento da resistncia ao oseltamivir. As amostras de 2012 apresentaram duas substituies (V241I e N369K) que esto relacionadas com um possvel papel na compensao dos efeitos negativos causados pela mutao H275Y. A modelagem molecular mostrou que na mutao D199N houve uma alterao na estrutura da protena NA prxima ao stio de ligao ao antiviral. A anlise filogentica revelou que as amostras de 2012 formaram um cluster isolado, demonstrando uma variao muito mais temporal do que geogrfica. Este representa o primeiro estudo de resistncia dos vrus Influenza H1N1pdm na mesorregio metropolitana de Belm, representando um importante instrumento para que os profissionais de sade adotem estratgias mais eficazes no manejo da doena e no desenvolvimento de novos frmacos anti-influenza.
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Os vrus entricos so importantes agentes de doenas de veiculao hdrica. Entre esses, os adenovirus humanos (HAdV) assumiram importncia por serem um dos principais causadores de gastrenterite em crianas menores de cinco anos e pela sua maior resistncia a fatores fsicos e qumicos em detrimento a outros vrus no ambiente. Vrias pesquisas tm demonstrado ausncia de relao entre a presena de bactrias indicadoras e vrus. Diante disso, diversos autores tm sugerido a incluso desses agentes como potenciais indicadores de contaminao viral e fecal da gua. O objetivo desse trabalho foi detectar a presena de HAdV em amostras de gua e esgoto no tratado oriundas de diversos ecossistemas aquticos da cidade de Belm-PA. Foram selecionados seis pontos de amostragem, dentre eles um esgoto no tratado: Esgoto do UNA e cinco colees hdricas: Porto do Aa, Ver-o-Peso, Igarap Tucunduba, Lago Bolonha e Lago gua Preta. Foi feita uma coleta mensal de dois litros de gua em cada ponto durante 24 meses consecutivos, de nov/2008 a out/2010, totalizando 144 amostras. Foi utilizada gua destilada autoclavada para controle negativo de cada ponto em todos os testes utilizados. As amostras foram concentradas pelo mtodo de adsoro-eluio e posteriormente centrifugadas para a obteno de dois mL. O DNA foi extrado pelo kit comercial Qiagen. Para a deteco molecular foram empregadas a Reao em Cadeia Mediada pela Polimerase (PCR convencional) e a PCR em tempo real, sendo utilizados iniciadores e sondas especficos que amplificam um gene do hexon de 301 e 96 pb, respectivamente. Visando-se melhorar o produto amplificado para sequenciamento genmico, algumas amostras positivas pela PCR convencional foram submetidas Nested-PCR com a utilizao de mais um par de iniciadores que amplificam uma regio interna de 171 pb. Amostras de gua e esgoto foram sequenciadas, analisadas e comparadas a outras obtidas no GeneBank. Os HAdV foram detectados em 59% (85/144) das amostras de gua superficial e esgoto no tratado, sendo que a positividade obtida pela PCR convencional foi de 22,9% (33/144) e pela PCR em tempo real de 58,7% (84/143). A primeira detectou o agente apenas nas amostras do igarap Tucunduba (62,5%) e do esgoto do UNA (75%) e a segunda em amostras provenientes dos seis pontos de coleta (com uma variao de 25 a 100%). O agente foi detectado em todos os 24 meses do estudo, estando presentes em pelo menos dois pontos, mensalmente. A PCR em tempo real se mostrou mais sensvel nesse estudo, tendo encontrado o agente em 36,4% (52/143) das amostras no detectadas pela PCR convencional. Das oito amostras genotipadas todas pertencem espcie F, sendo quatro referentes ao sorotipo 40 e quatro ao 41. Nossos resultados confirmam a alta circulao desse patgeno nas guas superficiais e esgoto da cidade, sugerindo a incluso dos HAdV como bons indicadores de contaminao viral e fecal da gua. A pesquisa desses vrus em ambientes aquticos pioneira em Belm e tais resultados so de relevante importncia para as polticas de sade pblica e ambiental, servindo como base para estudos complementares nessa rea.
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Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP)
Resumo:
Ps-graduao em Medicina Veterinria - FMVZ
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In Brazil there are few studies on the occurrence of the feline immunodeficiency virus (FIV) infection and its subtypes, which are essential for the development of vaccines and new diagnostic tests. The present study investigated the occurrence of the FIV infection between 2010 and 2011 in domestic cats submitted to medical attendance in the city of Pelotas and nearby area. Total blood samples of seventy cats, suspected (28) or not (42) of infection by FIV were analyzed by nested PCR in order to perform a diagnosis. The results pointed to a FIV infection frequency of 15.7% (11/70) and the analysis of the risk factors related to infection (sex, age and clinical condition) evidenced a greater occurrence in cats up to 10 years of age with chronic and recurrent infections. Eight samples found positive by nested PCR were submitted to DNA sequencing indicating that only the subtype B was detected in the studied region.
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Chlamydophila psittaci is a bacterium that causes respiratory or systemic disease in birds and humans. Owing to the risk of transmission from asymptomatic birds to humans, the objective of this study was to detect the presence of Chlamydophila spp. in asymptomatic birds. Four hundred and three fecal samples or cloacal swabs were collected from domestic, wild or exotic birds. The 403 samples were examined by real time PCR specific for the 16S subunit of rRNA gene using SsoFastEvaGreenSupermixTM (Bio-Rad) and melting curve analysis. Hemi-nested PCR specific for the OMP-A gene, accomplished in real-time PCR positive samples, was followed by sequencing of the amplified fragments to determine the genotype of C. psittaci. Real-time PCR was positive in 17 (4.21%) samples. Hemi-nested PCR revealed positivity in two samples previously positive by real-time PCR. Sequencing of the fragment amplified by hemi-nested PCR allowed for the identification of genotype A of C. psittaci in one sample. The results of this experiment show that the real-time PCR targeting the 16S rRNA gene followed by melting curve analysis can be used for diagnosis of Chlamydophila sp. in fecal samples of asymptomatic birds. The classification of the Chlamydophila species and the genotype of C. psittaci must be accomplished by PCR targeting the ompA gene and sequencing of the amplified fragments.
Resumo:
Ps-graduao em Medicina Veterinria - FCAV
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Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq)
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The aim of this study was to characterise the methylation pattern in a CpG island of the IGF2 gene in cumulus cells from 1-3 mm and a parts per thousand yenaEuro parts per thousand 8.0 mm follicles and to evaluate the effects of in vitro maturation on this pattern.Genomic DNA was treatment with sodium bisulphite. Nested PCR using bisulphite-treated DNA was performed, and DNA methylation patterns have been characterised.There were no differences in the methylation pattern among groups (P > 0.05). Cells of pre-IVM and post-IVM from small follicles showed methylation levels of 78.17 +/- 14.11 % and 82.93 +/- 5.86 %, respectively, and those from large follicles showed methylation levels of 81.81 +/- 10.40 % and 79.64 +/- 13.04 %, respectively. Evaluating only the effect of in vitro maturation, cells of pre-IVM and post-IVM COCs showed methylation levels of 80.17 +/- 12.01 % and 81.19 +/- 10.15 %.In conclusion, the methylation levels of the cumulus cells of all groups were higher than that expected from the imprinted pattern of somatic cells. As the cumulus cells from the pre-IVM follicles were not subjected to any in vitro manipulation, the hypermethylated pattern that was observed may be the actual physiological methylation pattern for this particular locus in these cells. Due the importance of DNA methylation in oogenesis, and to be a non-invasive method for determining oocyte quality, the identification of new epigenetic markers in cumulus cells has great potential to be used to support reproductive biotechniques in humans and other mammals.
