Micromolar concentration of pentoxifylline improves development in vitro of hamster 8-cell embryos: conrmation of biological viability by embryo transfer

The inßuence of the sperm motility stimulant pentoxifylline (PF) on preimplantation embryo development in hamsters was evaluated. Eight-cell embryos were cultured in hamster embryo culture medium (HECM)-2, with or without PF (0· 0233·6 mM). There was 90%, 37% and 29% inhibition of blastocyst development by 3·6 (used for human sperm), 0·9 and 0 ·45 mM PF, respectively. However, 23 µM PF (exposed to hamster oocytes during IVF) signicantly (P < 0·05) improved blastocyst development (63· 6% v. 51· 8%); morulae development was, however, not curtailed by 0·45 mM or 0·9 mM PF (51·8%±6·0 or 50·5%±11·3, respectively). Post-implantation viability of PF-treated embryos was assessed by embryo transfer; 43% of 80 PF-treated embryos implanted compared with 40% of 79 control embryos. Of the 9 recipients, 6 females delivered pups (19, i.e. 16% of transferred embryos or 53% of implanted embryos). These data show that in hamsters, continuous presence of PF at 0·45-3·6 mM is detrimental to 8-cell embryo development whereas 23 µM PF improves the development of embryos to viable blastocysts which produce live offspring.

Expression of glucose transporter isoforms and the insulin receptor during hamster preimplantation embryo development

During preimplantation development, embryos of many species are known to express up to five isoforms of the facilitative glucose transporter proteins (GLUT). Development of hamster blastocysts is inhibited by glucose. We therefore investigated GLUT isoform and insulin receptor (IR) expression in hamster preimplantation embryos cultured in glucose-free medium from the 8-cell stage onwards. We show that GLUT1, 3 and 8 mRNA are constitutively expressed from the 8-cell to the blastocyst stage. The IR is expressed from the morula stage onwards. Messenger RNA of the insulin-responsive GLUT4 was not detected at any stage. GLUT1 and 3 were localised by immunocytochemistry. GLUT1 was expressed in both embryoblast and trophoblast, in the latter, mainly in basal and lateral membranes directed towards the blastocoel. and embryoblast. GLUT3 was exclusively localised in the apical. membrane of trophoblast cells. We show that hamster preimplantation embryos express several GLUT isoforms thus closely resembling embryos of other mammalian species. Despite endogenous IR expression, the insulin-sensitive isoform GLUT4 was not expressed, indicating that the insulin-mediated glucose uptake known from classical insulin target cells may not be relevant for hamster blastocysts.

A microcomputer program to analyze the CD spectrum of proteins and nucleic acids—Use of LOTUS 1-2-3 spread sheet

A user friendly interactive computer program, CIRDIC, is developed which calculates the molar ellipticity and molar circular dichroic absorption coefficients from the CD spectrum. This, in combination with LOTUS 1-2-3 spread sheet, will give the spectra of above parameters vs wavelength. The code is implemented in MicroSoft FORTRAN 77 which runs on any IBM compatible PC under MSDOS environment.

Use of a specific aromatase inhibitor for determining whether there is a role for oestrogen in follicle/oocyte maturation, ovulation and preimplantation embryo development

The specific role of oestrogen in follicular maturation, ovulation and early embryonic development was investigated using Fadrozole (CGS 16949A), a non-steroidal aromatase inhibitor, to block oestrogen synthesis specifically and effectively in experimental animals. Induced and normal cyclical follicular maturation as well as normal and hCG/LH-induced ovulation were relatively unaffected by significantly depleting oestrogen in all animals (hamsters, rabbits, monkeys) studied other than rats. Fadrozole treatment significantly reduced the number of healthy antral follicles produced and the ovulatory response to exogenous hCG of immature rats primed with pregnant mares' serum gonadotrophin. The effect was specific, in that exogenously administered oestrogen reversed the blockade. Depletion of oestrogen, starting early in pro-oestrus in hamsters, had no effect on ovulation, oocyte maturation and fertilization, as normal implantation sites were seen on day 6 after coitus. In rabbits, oestrogen depletion during the periovulatory phase affected oviductal morphology and function. Although fertilization was not impaired, early embryo development did not appear to be normal. In monkeys, oestrogen depletion during the follicular phase did not lead to a block of follicular maturation or ovulation but resulted in a significant reduction in secretion of cervical mucus. Administration of either Fadrozole or Tamoxifen during the early luteal phase in cyclic monkeys that were allowed to mate prevented implantation and this appears to be due to impaired fertilization or faulty embryo development. These results suggest that, although there is a clear requirement for oestrogen to support the reproductive cycle in the female, the need for oestrogen in regulating specific events is species dependent.

Secretion of endocrine signals by the primate embryo during the peri-implantation period

Development of preimplantation embryos and blastocyst implantation are critical early events in the establishment of pregnancy. In primates, embryonic signals, secreted during the peri-implantation period, are believed to play a major role in the regulation of embryonic differentiation and implantation. However, only limited progress has been made in the molecular and functional characterization of embryonic signals, partly due to severe paucity of primate embryos and the lack of optimal culture conditions to obtain viable embryo development. Two embryonic (endocrine) secretions, i.e. chorionic gonadotrophin (CG) and gonadotrophin releasing hormone (GnRH) are being studied. This article reviews the current status of knowledge on the recovery and culture of embryos, their secretion of CG, GnRH and other potential endocrine signals and their regulation and physiological role(s) during the peri-implantation period in primates, including humans.

NMR studies of preimplantation embryo metabolism in human assisted reproductive techniques: a new biomarker for assessment of embryo implantation potential

There has been growing interest in understanding energy metabolism in human embryos generated using assisted reproductive techniques (ART) for improving the overall success rate of the method. Using NMR spectroscopy as a noninvasive tool, we studied human embryo metabolism to identify specific biomarkers to assess the quality of embryos for their implantation potential. The study was based on estimation of pyruvate, lactate and alanine levels in the growth medium, ISM1, used in the culture of embryos. An NMR study involving 127 embryos from 48 couples revealed that embryos transferred on Day 3 (after 72 h in vitro culture) with successful implantation (pregnancy) exhibited significantly (p < 10(-5)) lower pyruvate/alanine ratios compared to those that failed to implant. Lactate levels in media were similar for all embryos. This implies that in addition to lactate production, successfully implanted embryos use pyruvate to produce alanine and other cellular functions. While pyruvate and alanine individually have been used as biomarkers, the present study highlights the potential of combining them to provide a single parameter that correlates strongly with implantation potential. Copyright (C) 2012 John Wiley & Sons, Ltd.

Influencia de las condiciones del estrés salino sobre un cultivar resistente y un cultivar susceptible de Lotus tenuis al estado vegetativo

Resumen: Lotus tenuis es una leguminosa perenne, naturalizada en los campos bajos de la Cuenca del Salado. Es una especie alógama y presenta una alta variabilidad genética (Andrés A., and Rosso 2007), que le permite crecer y desarrollarse en distintas condiciones ambientales (Goldberg, E.E. et al 2010). Son pocas las especies de relevancia agrícola capaces de crecer bajo condiciones que combinan inundación y salinidad (Escaray 2007). Se ha demostrado la existencia de poblaciones de L. tenuis con diferentes niveles de tolerancia a distintos niveles de inundación y salinidad (Teakle, N.L. et al 2010; Striker et al. 2012). La tolerancia a la salinidad se define como la habilidad de una planta para crecer y completar su ciclo de vida en un medio que contiene altas concentraciones de sal. Debido a esto surgió mi interés por profundizar en el estudio de esta especie y su posible adaptación a suelos con problemas de salinidad. Se trabajo con dos familias de medios hermanos (FMH) de L. tenuis caracterizadas como tolerantes o susceptibles a salinidad provenientes del programa de mejoramiento genético del INTA Pergamino. Se utilizaron 550 plantas de cada genotipo que fueron sometidas a dos tratamientos salinos. Las plantas se colocaron de a cinco en macetas (20 cm. de diámetro) en invernáculo, se las dividió en: dosis 1 (9 repeticiones), fueron regadas con una solución 75mM de cloruro de sodio (NaCl), dosis 2 (9 repeticiones) regadas con una solución 150 mM NaCl, y un grupo testigo control para cada genotipo (4 repeticiones) regado sin NaCl. El tratamiento salino se aplicó durante 62 días hasta la aparición de la primera flor. Se determinó producción de biomasa de parte aérea (tallos mas hojas). También se determinó porcentaje de materia seca, por secado a 65ºC hasta peso constante de tallo más hojas, corona más raíz, longitud de tallo y raíz, y número de ramificaciones del tallo. Los resultados analizados muestran que la FMH 490 o tolerante posee mayor desarrollo en todas las variables analizadas y en todas las condiciones ensayadas excepto en longitud de raíz y corona. Pero, al sufrir el estrés los porcentajes de reducción en esta FMH que se observan son similares a los porcentajes de reducción observados en la FMH 2241 e incluso, para algunas variables el genotipo susceptible 2241 presentaba menores pérdidas frente al estrés recibido (MS por planta corona y raíz, Biomasa por planta corona y raíz, largo de tallo y Grs de tallo por planta.). El efecto de la salinidad fue igual o similar entre ambas isolíneas, por lo que la que presentaba mayor crecimiento produjo mayor biomasa en condiciones de estrés salino que la de menor crecimiento. La tolerancia al estrés salino fue similar en ambos genotipos, solo que una presentó más desarrollo que la otra. El análisis de las variables estudiadas mostró que en este ensayo el crecimiento de las plantas tiende a disminuir al aumentar la dosis de NaCl y que, a igualdad de dosis, los parámetros de crecimiento evaluados fueron mayores en el genotipo tolerante.

Efecto de las frecuencias de pastoreo sobre un pastizal natural con presencia de Lotus tenuis en el partido de Olavarría, provincia de Buenos Aires

Resumen: La Pampa deprimida bonaerense está considerada la zona de cría más importante del país; el 85% de su superficie está cubierta por pastizales naturales, siendo éstos la principal fuente de alimento para la ganadería local. La productividad del pastizal natural, puede ser mejorada aplicando tecnología de procesos, al utilizar pastoreos en forma rotacional, en lugar del usual pastoreo continuo. El objetivo del presente trabajo, es evaluar el efecto en la producción bruta de materia seca del pastizal natural en un ambiente de un bajo dulce, en donde Lolium multiflorum y Lotus tenuis constituyen especies indicadoras, y cuya frecuencia en el tapiz vegetal es alta. Este ensayo se realizó en el establecimiento “El Fortín” ubicado en la Estación Pourtalé (Partido de Olavarría), durante un año, desde Mayo del 2014 hasta Mayo del 2015. Se utilizó un diseño experimental de bloques completamentes aleatorizados (DCBA), con dos tratamientos: frecuencia de 45 días y frecuencia de 90 días. Aleatorizados en tres bloques que corresponden al número de parcelas existentes dentro del potrero. Se realizaron en total 11 muestreos midiendo la producción de materia seca, siendo esta la variable en estudio. El análisis estadístico se realizó mediante un análisis de varianza, utilizando como software el programa Infostat. Los resultados sobre la producción en promedio, sostienen que existen diferencias significativas entre ambos tratamientos: de 45 días y de 90 días. La materia seca acumulada y anualizada, fue de 3306,7kg.MS ha-1 para el tratamiento de 45 días y de 3190,0 kg.MS ha-1 para el tratamiento de 90 días, entre pastoreos sucesivos. Mientras que la producción promedio acumulada entre cortes para cada tratamiento fue de 472,4kg.MS ha-1 para el tratamiento de 45 días y de 797,5 kg.MS ha-1 para el tratamiento de 90 días.

Influencia de las condiciones del estrés salino sobre parámetros de crecimiento de un cultivar tolerante y un cultivar susceptible de Lotus tenuis al estado vegetativo : ciclo 2013

Resumen: Lotus tenuis es una valiosa leguminosa forrajera naturalizada en la Pampa Deprimida. Presenta una reconocida tolerancia al anegamiento y a la salinidad, postulándose como una especie clave para la producción ganadera de la zona. El objetivo del trabajo fue evaluar la influencia del estrés salino en el crecimiento vegetativo de dos familias de medios hermanos de L. tenuis, una reconocida como tolerante a la salinidad y la otra como susceptible. El ensayo se realizó bajo invernáculo en macetas con cinco plantas cada una. Se llevaron a cabo tres tratamientos, uno control y dos salinos con 75mM y 150mM NaCl desde la cuarta hoja pentafoliada desplegada hasta la aparición de la primera flor. Se tomaron datos de temperatura, actividad eléctrica del suelo y radiación. En total se analizaron ocho variables (% de materia seca (MS) en tallo y hoja, y en corona y raíz; MS de tallo y hoja, y de corona y raíz; MS de tallo y de hoja; relación MS aérea/MS radicular y MS tallo/MS hoja) a través de análisis de varianzas y LSD Fisher (p < 0,05) comparando entre genotipos y entre dosis. Se encontró interacción entre los factores en dos variables, % MS en corona y raíz, y en MS de tallo. Con respecto a las dosis se encontraron diferencias significativas para todas las variables, mientras que para el genotipo solo ocurrió en tres variables, MS de tallos y hojas, relación MS aérea/MS radicular, y MS de hojas. Frente a las dosis salinas se redujo la producción de MS y solo aumentó el % de MS. Para evaluar la performance de cada genotipo frente al estrés salino, se calculó expresando en porcentaje, la respuesta de cada uno en las dosis salinas frente a los tratamientos testigos. Evaluando la performance de estos genotipos, se considera que se deberían buscar líneas con un mejor comportamiento frente a la salinidad para los programas de mejoramiento forrajero de esta especie.

Estudio de genes de la familia MYB relacionados con la tolerancia al estrés salino en Lotus spp

Resumen: El género Lotus comprende alrededor de 100 especies anuales y perennes distribuidas en todo el mundo. Algunas de las especies de Lotus muestran un gran potencial para la adaptación a estreses abióticos. Entre estas especies se encuentra Lotus tenuis, especie herbácea, que se encuentra naturalizada en los bajos salinos alcalinos de la Pampa Deprimida hace más de 50 años y es muy valorada como forrajera en los sistemas ganaderos. Como características principales se encuentra la variabilidad genética de sus poblaciones, la plasticidad genotípica de las plantas, su tolerancia al anegamiento y a la salinidad. Teniendo en cuenta la importancia de los daños causados por el estrés en las plantas, sería de gran utilidad comprender cuales son los mecanismos moleculares a través de los cuales las plantas detectan el estrés y transducen la señal dentro de las células para generar respuestas adaptativas y de esta manera poder diseñar estrategias que permitan mejorar la tolerancia al estrés de los cultivos. Uno de los mecanismos de la regulación de la expresión génica es a través de los factores de transcripción (FT). Estos, entre otras funciones, regulan las respuestas adaptativas, por eso sería importante conocer cuáles son los genes involucrados en estas respuestas. Varias familias de FT se encuentran involucradas en la respuesta al estrés abiótico en plantas, una de ellas es la familia de proteínas MYB, siendo esta una de las más numerosas en las plantas. El objetivo de este trabajo es identificar FT tipo MYB en L. tenuis y evaluar su relación con la respuesta adaptativa al estrés salino. Para este experimento se extrajo ADN de hojas de plantas que crecieron en condiciones normales y ARN de raíces de plántulas que permanecieron bajo condiciones de salinidad por 8 y 24 horas, de dos familias de medio hermano (FMH) de L. tenuis, una susceptible y otra tolerante a la salinidad. Se realizaron varias reacciones de PCR y RT-PCR, que arrojaron como resultado amplificación del fragmento genómico y del transcrito con el tamaño esperado. Una vez secuenciados estos fragmentos se determinó la presencia de FT tipo MYB en L. tenuis. Analizando los resultados preliminares de la expresión relativa de los genes MYB estudiados bajo condiciones de estrés salino, se observó expresión bajo condiciones de salinidad como en condiciones normales de crecimiento, lo que sugiere que estos genes no solo responden al estrés salino sino también a otros estreses o factores. Para el gen MYB 102_1420 se observó mayor expresión del tratamiento con solución salina a las 24 horas que a las 8 horas. Al comparar ambas FMH vemos que el comportamiento es similar. Para el gen MYB 102_950 se observó que la FMH susceptible bajo condiciones de salinidad a las 8 horas presenta mayor expresión que a las 24 horas, con la FMH tolerante sucede todo lo contrario. El estudio de la capacidad de adaptación y tolerancia a los distintos estreses y el control de las respuestas adaptativas por medio de los FT en L. tenuis permitirá contribuir a mejorar su adaptación en la Pampa Deprimida, y de esta manera poder identificar poblaciones aptas para ser cultivadas en suelos salinos.

Respuesta a la fertilización fosforada en campo natural con presencia de Lotus tenuis en el partido de Olavarría, Cuenca del Salado, provincia de Buenos Aires

Resumen: La pampa deprimida bonaerense (región denominada Cuenca del Salado) es considerada la zona de cría más importante del país y su principal recurso forrajero son los pastizales naturales. Allí se encuentra Lotus tenuis como especie herbácea naturalizada y muy valorada por su aporte a la oferta forrajera de los sistemas ganaderos de la región. En condiciones de campos naturales en bajos dulces (con horizonte superficial de pH cercano a la neutralidad) el agregado de fósforo mediante la fertilización incrementaría la presencia de leguminosas, mejorando la receptividad y calidad de los forrajes y por ende, la producción de carne. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la respuesta del pastizal natural, medida como producción de materia seca, utilizando distintas dosis de fertilización fosforada (NPK 5-40-0). Se realizó un ensayo en un establecimiento ubicado en las cercanías de la ciudad de Olavarría, en el paraje rural Pourtalé, Provincia de Buenos Aires, utilizando un diseño de bloques al azar con tres repeticiones. Los tratamientos fueron 0, 50 y 120 kg.ha-1 realizándose cinco muestreos luego de la fertilización en el transcurso de un año, en los cuales se determinó la producción de materia seca como estimación de la disponibilidad forrajera. La producción acumulada promedio para el tratamiento con 0kg.ha-1 fue de 2793kgMS.ha-1, con 50kg.ha-1 fue de 5159 kgMS.ha-1 y con 120kg.ha-1 fue de 7206 kgMS.ha-1. Para analizar estadísticamente los resultados, se realizó un análisis de varianza mediante un software estadístico (Infostat), donde se pudo observar diferencias significativas entre el testigo y el tratamiento con 120kg ha-1 (p-valor<0,05).

Variabilidad molecular en una población de lotus tenuis tolerante a la salinidad

Resumen: Lotus tenuis Waldst et Kit (ex Lotus glaber Mill) (2n=2x=12), es una leguminosa perenne, utilizada como forrajera, que se introdujo en suelos salinoalcalinos de la Pampa Deprimida de la Provincia de Buenos Aires. L. tenuis presenta variabilidad genética para caracteres asociados a la tolerancia a salinidad que esta siendo explorada y explotada en programas de mejoramiento. El estudio de la variabilidad molecular en esta especie permitirá ayudar a los programas de mejoramiento a incrementar la adaptación de la especie en la Pampa Deprimida, permitiendo identificar poblaciones aptas para lograr alta productividad en los suelos salinos de la región. Mediante este trabajo se buscó cuantificar la variabilidad molecular de una población de L. tenuis tolerante a alta salinidad, para lo cual se extrajo ADN de 23 plantas y se utilizaron 8 marcadores ISSRs (Inter Secuencias Simples Repetidas) con la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Con el uso de los programas de análisis molecular Structure (Pritchard et al., 2000), PowerMarker (Liu et al., 2005) y Arlequín (Excoffier et al., 2010), se estimó la estructura genética, varianza, medidas de diversidad y de distancia genética. A su vez se realizó a modo de complemento una comparación entre la población tolerante y otra población de L. tenuis susceptible a salinidad, para estimar la variabilidad genética entre poblaciones e identificar bandas especificas asociadas a la tolerancia a salinidad. El número obtenido de bandas presentes en la población tolerante fue de 73, que permitió realizar un estudio de la variabilidad molecular. La estructura genética representada por Structurama y Structure arrojó un K=1, observándose a las 23 plantas tolerantes agrupadas en una misma población. El uso de los 8 marcadores seleccionados permitieron estudiar la variabilidad molecular y la estructura genética de las poblaciones de L. tenuis, identificándose un total de 117 bandas totales. El análisis de la estructura poblacional reveló la existencia de una mayor homogeneidad en los individuos de la población tolerante que en la población susceptible. Los marcadores ISSRs desarrollados en este trabajo podrán ser utilizados en otros programas de mejoramiento genético de L. tenuis, para evaluar la variabilidad molecular presente en otras poblaciones de la especie

Embryo-damage induced nucleation of microcracks in an aluminum-alloy under impact loading

The nucleation of microdamage under dynamic loading was investigated through planar impact experiments accomplished with a light gas gun. The microscopic observation of recovered and sectioned specimens showed that microcracks were nucleated only by cracking of brittle particles inside material. However, for comparison the in situ static tensile tests on the same material conducted with a scanning electron microscope showed that the microcracks were nucleated by many forms those were fracture of ductile matrix, debonding particles from matrix and cracking of brittle particles. The quantitative metallographic observations of the specimens subjected to impact loading showed that most of the cracked particles were situated on grain boundaries of the aluminium matrix. These facts suggested the concept of critical size and incubation time of submicroscopic cavities in the dynamic case and the mechanism of embryo-damage induced nucleation by fracture of brittle particles in the aluminium alloy under impact loading was proposed.