Sviluppo e caratterizzazione di scaffolds polimerici a base di gelatina e nanocellulosa per la rigenerazione dei tessuti

L’ingegneria tissutale rappresenta oggi una delle tematiche più importanti di ricerca in ambito medico-ingegneristico. Questa disciplina si pone come obiettivo di far fronte alla mancanza, sostituzione o riparazione di tessuto attraverso lo sviluppo di scaffolds opportunamente ottimizzati. I polimeri naturali rappresentano una classe di materiali particolarmente indicata per soddisfare i requisiti richiesti soprattutto per la biocompatibilità che spesso li caratterizza. La gelatina è uno dei materiali che si presta alla realizzazione di scaffolds innovativi ad altissima biocompatibilità nonostante le scarse proprietà meccaniche e la facilità di degradazione. Proprio per questo è possibile migliorarne le prestazioni attraverso l’ottimizzazione di processi di blending con altri polimeri, in questo caso le nanofibre di cellulosa e l’impiego di agenti reticolanti. Lo scopo di questo lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ceramici (ISTEC-CNR) di Faenza, è la progettazione, lo sviluppo e la caratterizzazione di scaffolds polimerici porosi a base di gelatina e nanocellulosa opportunamente reticolati per un ampio range di applicazioni nell’ambito dell’ingegneria tissutale. A questo scopo, sono stati sviluppati cinque dispositivi 3D porosi, ottenuti tramite liofilizzazione, che differiscono per il tipo di processo reticolante applicato. Il progetto ha previsto una prima fase di ricerca bibliografica che ha permesso di conoscere lo stato dell’arte sull’argomento trattato. Si è potuto così procedere alla realizzazione degli scaffolds e a una prima caratterizzazione di carattere chimico-fisico e morfologico. A questo punto, sulla base dei dati ottenuti, sono stati scelti i campioni su cui effettuare ulteriori caratterizzazioni meccaniche. In ultimo, sono stati analizzati e rielaborati tutti i risultati.

Caratterizzazione proteomica di fluidi e tessuti in diverse condizioni fisio-patologiche

This thesis has been focused on the proteomic characterization of human saliva from donors of different ages, starting from birth up to adult age, and pediatric brain tumor tissues. The first study has been performed in order to compare the acid-insoluble fraction of saliva from preterm with at-term newborns and adults and establish if differences exist. In the second study medulloblastoma and pilocytic astrocytoma pediatric brain tumor extracts have been compared. In both studies 2- DE analysis was coupled with high resolution tandem mass spectrometry (MS/MS). The proteomic characterization of the acid-insoluble fractions of saliva from preterm newborns allowed to integrate data previously obtained on the acid-soluble fraction by HPLC-electrospray ionization (ESI)-mass spectrometry (MS), and to evidence several differences between preterm newborns, at-term newborns and adults. Spots differentially expressed between the three groups, according to image analysis of the gels, were submitted to in-gel tryptic digestion and the peptide mixture analyzed by high performance HPLC-ESI-MS/MS for their characterization. By this strategy, we identified three over-expressed proteins in atterm newborns with respect to preterm newborns and adults (BPI fold-containing family A member 1, two proteoforms of annexin A1, and keratin type 1 cytoskeletal 13), and several over-expressed proteins in adults (fatty acid-binding protein, S100A6, S100A7, two proteoforms of S100A9, several proteoforms of prolactin-inducible protein, Ig kappa chain, two proteoforms of cystatin SN, one proteoform of cystatin S and several proteoforms of α-amylase 1). Moreover, for the first time, it was possible to assign by MS/MS four spots of human saliva 2-DE, already detected by other authors, to different proteoforms of S100A9. The strategy applied used a sequential staining protocol to the 2-DE gels, first with Pro-Q Diamond, that allows specific detection of phosphoproteins, and successively with total protein SYPRO Ruby stain. In the second study, proteomic analysis of two pediatric brain tumor tissues pointed out differences between medulloblastoma, the prevalent malignant tumor in childhood, and pilocytic astrocytoma, the most common, that only rarely shows a malignant progression. Due to the limited availability of bioptic tissue, the study was performed on pooled tumor tissues, and was focused on acid-insoluble fraction to integrate the characterization performed by a group of colleagues in Rome on the acid-soluble fraction by high performance HPLC-ESI-MS/MS. The results indicated that the two tumors exhibit different proteomic profiles and evidenced interesting differential expression of several proteins. Among them, peroxiredoxin- 1, peptidyl-prolyl cis–trans isomerase A, heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, mitochondrial isoform of malate dehydrogenase, nucleoside diphosphate kinase A, glutathione S-transferase P and fructose bisphosphate aldolase A resulted significantly over-expressed in medulloblastoma while glial fibrillary acidic protein, serotransferrin, α crystallin B chain, ferritin light chain, annexin A5, fatty acid-binding protein (brain), sorcin and apolipoprotein A-I resulted significantly over-expressed in pilocytic astrocytoma. In conclusion, the work done allowed to evidence the usefulness of using an integrated bottom-up/top-down approach, based on 2-DE-MS analysis and high performance MS in order to obtain a complete characterization of the proteome under investigation, revealing and identifying, not only peptides and small proteins, but also proteins with higher MW, that often it is not possible to identify by using exclusively a top-down ESI-MS approach.

La matematica fuzzy nell'ingegneria dei materiali. Applicazioni alla durevolezza e alla conservazione dei materiali in opera nei siti archeologici

La ricerca presentata è un’ampia esplorazione delle possibili applicazioni di concetti, metodi e procedure della Fuzzy Logic all’Ingegneria dei Materiali. Tale nuovo approccio è giustificato dalla inadeguatezza dei risultati conseguiti con i soli metodi tradizionali riguardo alla reologia ed alla durabilità, all’utilizzo di dati di laboratorio nella progettazione e alla necessità di usare un linguaggio (informatizzabile) che consenta una valutazione congiunta degli aspetti tecnici, culturali, economici, paesaggistici della progettazione. – In particolare, la Fuzzy Logic permette di affrontare in modo razionale l’aleatorietà delle variabili e dei dati che, nel settore specifico dei materiali in opera nel costruito dei Beni Culturali, non possono essere trattati con i metodi statistici ordinari. – La scelta di concentrare l’attenzione su materiali e strutture in opera in siti archeologici discende non solo dall’interesse culturale ed economico connesso ai sempre più numerosi interventi in questo nuovo settore di pertinenza dell’Ingegneria dei Materiali, ma anche dal fatto che, in tali contesti, i termini della rappresentatività dei campionamenti, della complessità delle interazioni tra le variabili (fisiche e non), del tempo e quindi della durabilità sono evidenti ed esasperati. – Nell’ambito di questa ricerca si è anche condotto un ampio lavoro sperimentale di laboratorio per l’acquisizione dei dati utilizzati nelle procedure di modellazione fuzzy (fuzzy modeling). In tali situazioni si è operato secondo protocolli sperimentali standard: acquisizione della composizione mineralogica tramite diffrazione di raggi X (XRD), definizione della tessitura microstrutturale con osservazioni microscopiche (OM, SEM) e porosimetria tramite intrusione forzata di mercurio (MIP), determinazioni fisiche quali la velocità di propagazione degli ultrasuoni e rotoviscosimetria, misure tecnologiche di resistenza meccanica a compressione uniassiale, lavorabilità, ecc. – Nell’elaborazione dei dati e nella modellazione in termini fuzzy, la ricerca è articolata su tre livelli: a. quello dei singoli fenomeni chimico-fisici, di natura complessa, che non hanno trovato, a tutt’oggi, una trattazione soddisfacente e di generale consenso; le applicazioni riguardano la reologia delle dispersioni ad alto tenore di solido in acqua (calci, cementi, malte, calcestruzzi SCC), la correlazione della resistenza a compressione, la gelività dei materiali porosi ed alcuni aspetti della durabilità del calcestruzzo armato; b. quello della modellazione della durabilità dei materiali alla scala del sito archeologico; le applicazioni presentate riguardano i centri di cultura nuragica di Su Monte-Sorradile, GennaMaria-Villanovaforru e Is Paras-Isili; c. quello della scelta strategica costituita dalla selezione del miglior progetto di conservazione considerando gli aspetti connessi all’Ingegneria dei Materiali congiuntamente a quelli culturali, paesaggistici ed economici; le applicazioni hanno riguardato due importanti monumenti (Anfiteatro e Terme a Mare) del sito Romano di Nora-Pula.

Biomimetica per l'ingegneria tissutale dell'osso

Reconstruction of bone is needed for high bone loss due to congenital deformities, trauma or neoplastic diseases. Commonly, orthopaedic surgical treatments are autologus or allogenic bone implant or prosthetic implant. A choice to the traditional approaches could be represented by tissue engineering that use cells (and/or their products) and innovative biomaterials to perform bone substitutes biologically active as an alternative to artificial devices. In the last years, there was a wide improvement in biology on stem cells potential research and in biomedical engineering through development of new biomaterials designed to resemble the physiological tissues. Tissue engineering strategies and smart materials aim together to stimulate in vivo bone regeneration. This approaches drive at restore not only structure integrity and/or function of the original tissue, but also to induce new tissue deposition in situ. An intelligent bone substitute is now designed like not only a scaffold but also as carrier of regeneration biomolecular signals. Biomimetics has helped to project new tissue engineered devices to simulate the physiological substrates architecture, such extracellular matrix (ECM), and molecular signals that drive the integration at the interface between pre-existing tissue and scaffold. Biomimetic strategies want to increase the material surface biological activity with physical modifications (topography) o chemical ones (adhesive peptides), to improve cell adhesion to material surface and possibly scaffold colonization. This study evaluated the effects of biomimetic modifications of surgical materials surface, as poly-caprolattone (PCL) and titanium on bone stem cells behaviour in a marrow experimental model in vitro. Two biomimetic strategies were analyzed; ione beam irradiation, that changes the surface roughness at the nanoscale, and surface functionalization with specific adhesive peptides or Self Assembled Monolayers (SAMs). These new concept could be a mean to improve the early (cell adhesion, spreading..) and late phases (osteoblast differentiation) of cell/substrate interactions.

La salute come promessa. Ingegneria genetica e biotecnologie fra biopolitica, diritto e criminalità

La tesi di dottorato di Carlo Antonio Gobbato prende in considerazione e sviluppa, secondo una prospettiva rigorosamente sociologica, i temi e i problemi che discendono dai progressi delle bioscienze e delle biotecnologie con particolare riferimento alla programmazione degli esseri umani con precise caratteristiche. Muovendo dalla riflessione di Jurgen Habermas sui caratteri della genetica liberale, sono stati, innanzi tutto, ripresi alcuni temi fondamentali della storia del pensiero politico e giuridico sviluppatisi in età moderna, considerando con particolare attenzione la ricostruzione epistemologica operata da Michel Foucault in merito alla nozione di biopolitica, ovvero sia al modo con cui si è cercato, a partire dal XVIII secolo, di razionalizzare i problemi posti dalla pratica governamentale nei confronti delle persone (pratiche concernenti la salute, il controllo sociale, l’igiene, la mortalità, le razze, ecc.). La biopolitica è una categoria gnoseologica di spiegazione dell’idea di sviluppo presente nell’età moderna, dove sono iscritti vari saperi e pratiche governamentali, risultando così un concetto storicamente determinato da costruzioni produttive e tecnologiche che consentono, oppure obbligano, la vita ad entrare nella storia. D’altra parte, la biopolitica non produce letteralmente la vita, ma interviene direttamente sulla vita consentendone le condizioni di mantenimento e sviluppo. Se la biopolitica ha determinato l’instaurazione del dominio della specie umana sulla materia inerte, la rivoluzione scientifica in atto, anche in ragione dell’intensità con cui procede lo sviluppo delle bioscienze e delle biotecnologie, sta determinando l’affermazione del dominio sulla materia vivente Il progressivo affrancamento delle bioscienze e delle biotecnologie dal sistema sociale e dal sotto sistema sanitario sta comportando un’intensa proliferazione legislativa e normativa di cui la bioetica è parte, assieme alla costituzione ed allo sviluppo di un polo di apparati tendenzialmente autonomo, anche in ragione delle grandi quantità di trasferimenti finanziari, pubblici e privati, specificatamente dedicati e del nuovo mercato dei brevetti sulla vita. Sono evidenti le preoccupazioni degli organismi internazionali e nazionali, ai loro massimi livelli, per un fenomeno emergente, reso possibile dai rapidi progressi delle bioscienze, che consente la messa a disposizione sul mercato globale di “prodotti” ricavati dal corpo umano impossibili da reperire se tali progressi non si fossero verificati. Si tratta di situazioni che formano una realtà giuridica, sociale e mercantile che sempre più le bioscienze contribuiscono, con i loro successi, a rappresentare e costruire, anche se una parte fondamentale nell’edificazione, cognitiva ed emozionale, di tali situazioni, che interagiscono direttamente con l’immaginario soggettivo e sociale, è costituita dal sistema dell’informazione, specializzata e non, che sta con intensità crescente offrendo notizie e riproduzioni, vere o verosimili, scientificamente fondate oppure solo al momento ipotizzate, ma poste e dibattute, che stanno oggettivamente alimentando nuove attese individuali e sociali in grado di generare propensioni e comportamenti verso “oggetti di consumo” non conosciuti solo fino a pochi anni fa. Propensioni e comportamenti che possono assumere, in ragione della velocità con cui si succedono le scoperte delle bioscienze e la frequenza con cui sono immessi nel mercato i prodotti biotecnologici (indipendentemente dalla loro vera o presunta efficacia), anche caratteri di effervescenza anomica, fino alla consumazione di atti gravemente delittuosi di cui la stessa cronaca e le inchieste giudiziarie che si stanno aprendo iniziano a dare conto. La tesi considera criticamente la nuova realtà che emerge dai progressi delle bioscienze e, dopo aver identificato nella semantica dell’immunità e nel dominio sul movimento del corpo gli orientamenti concettuali che forniscono il significato essenziale alla biopolitica di Foucault, cerca di definire secondo una prospettiva propriamente sociologica la linea di separazione fra le pratiche immunitarie ed altre pratiche che non possono essere fatte rientrare nelle prime o, anche, il limite del discorso di Foucault davanti alle questioni poste da Habermas ed inerenti la programmazione genetica degli esseri viventi. Le pratiche genetiche, infatti, non sono propriamente immunitarie e, anzi, la stessa logica discorsiva intorno al gene non ha carattere immunitario, anche se può apportare benefici immunitari. La logica del gene modifica la forma del corpo, è generativa e rigenerativa, può ammettere ed includere, ma anche negare, la semantica biopolitica, i suoi oggetti e i suoi nessi. Gli oggetti della biopolitica sono ogni giorno di più affiancati dagli oggetti di questa dimensione radicalmente originale, per significati e significanti, dimensione che, con un neologismo, si può definire polisgenetica, ovvero sia una pratica governamentale sui generis, con importanti riflessi sul piano socio – criminologico. L’ultima parte della tesi riporta i risultati di recenti ricerche sociologiche sulla percezione sociale dell’ingegneria genetica e delle biotecnologie, nonché presenta i risultati dell’elaborazione delle interviste effettuate per la tesi di ricerca.

Ingegneria di sistemi auto‐organizzanti con il paradigma multiagente

Self-organisation is increasingly being regarded as an effective approach to tackle modern systems complexity. The self-organisation approach allows the development of systems exhibiting complex dynamics and adapting to environmental perturbations without requiring a complete knowledge of the future surrounding conditions. However, the development of self-organising systems (SOS) is driven by different principles with respect to traditional software engineering. For instance, engineers typically design systems combining smaller elements where the composition rules depend on the reference paradigm, but typically produce predictable results. Conversely, SOS display non-linear dynamics, which can hardly be captured by deterministic models, and, although robust with respect to external perturbations, are quite sensitive to changes on inner working parameters. In this thesis, we describe methodological aspects concerning the early-design stage of SOS built relying on the Multiagent paradigm: in particular, we refer to the A&A metamodel, where MAS are composed by agents and artefacts, i.e. environmental resources. Then, we describe an architectural pattern that has been extracted from a recurrent solution in designing self-organising systems: this pattern is based on a MAS environment formed by artefacts, modelling non-proactive resources, and environmental agents acting on artefacts so as to enable self-organising mechanisms. In this context, we propose a scientific approach for the early design stage of the engineering of self-organising systems: the process is an iterative one and each cycle is articulated in four stages, modelling, simulation, formal verification, and tuning. During the modelling phase we mainly rely on the existence of a self-organising strategy observed in Nature and, hopefully encoded as a design pattern. Simulations of an abstract system model are used to drive design choices until the required quality properties are obtained, thus providing guarantees that the subsequent design steps would lead to a correct implementation. However, system analysis exclusively based on simulation results does not provide sound guarantees for the engineering of complex systems: to this purpose, we envision the application of formal verification techniques, specifically model checking, in order to exactly characterise the system behaviours. During the tuning stage parameters are tweaked in order to meet the target global dynamics and feasibility constraints. In order to evaluate the methodology, we analysed several systems: in this thesis, we only describe three of them, i.e. the most representative ones for each of the three years of PhD course. We analyse each case study using the presented method, and describe the exploited formal tools and techniques.

Sviluppo e caratterizzazione di impianti e membrane polimeriche per la medicina rigenerativa

Nell’ambito di questa Tesi sono state affrontate le fasi di progettazione, sviluppo e caratterizzazione di materiali biomimetici innovativi per la realizzazione di membrane e/o costrutti 3D polimerici, come supporti che mimano la matrice extracellulare, finalizzati alla rigenerazione dei tessuti. Partendo dall’esperienza di ISTEC-CNR e da un’approfondita conoscenza chimica su polimeri naturali quali il collagene, è stata affrontata la progettazione di miscele polimeriche (blends) a base di collagene, addizionato con altri biopolimeri al fine di ottimizzarne i parametri meccanici e la stabilità chimica in condizioni fisiologiche. I polimeri naturali chitosano ed alginato, di natura polisaccaridica, già noti per la loro biocompatibilità e selezionati come additivi rinforzanti per il collagene, si sono dimostrati idonei ad interagire con le catene proteiche di quest’ultimo formando blends omogenei e stabili. Al fine di ottimizzare l’interazione chimica tra i polimeri selezionati, sono stati investigati diversi processi di blending alla base dei quali è stato applicato un processo complesso di co-fibrazione-precipitazione: sono state valutate diverse concentrazioni dei due polimeri coinvolti e ottimizzato il pH dell’ambiente di reazione. A seguito dei processi di blending, non sono state registrate alterazioni sostanziali nelle caratteristiche chimiche e nella morfologia fibrosa del collagene, a riprova del fatto che non hanno avuto luogo fenomeni di denaturazione della sua struttura nativa. D’altro canto entrambe le tipologie di compositi realizzati, possiedano proprietà chimico-fisiche peculiari, simili ma non identiche a quelle dei polimeri di partenza, risultanti di una reale interazione chimica tra le due molecole costituenti il blending. Per entrambi i compositi, è stato osservato un incremento della resistenza all’attacco dell’enzima collagenasi ed elevato grado di swelling, quest’ultimo lievemente inferiore per il dispositivo contenente chitosano. Questo aspetto, negativo in generale per quanto concerne la progettazione di impianti per la rigenerazione dei tessuti, può avere aspetti positivi poiché la minore permeabilità nei confronti dei fluidi corporei implica una maggiore resistenza verso enzimi responsabili della degradazione in vivo. Studi morfologici al SEM hanno consentito di visualizzare le porosità e le caratteristiche topografiche delle superfici evidenziando in molti casi morfologie ibride che confermano il buon livello d’interazione tra le fasi; una più bassa omogeneità morfologica si è osservata nel caso dei composti collagene-alginato e solo dopo reidratazione dello scaffold. Per quanto riguarda le proprietà meccaniche, valutate in termini di elasticità e resistenza a trazione, sono state rilevate variazioni molto basse e spesso dentro l’errore sperimentale per quanto riguarda il modulo di Young; discorso diverso per la resistenza a trazione, che è risultata inferiore per i campione di collagene-alginato. Entrambi i composti hanno comunque mostrato un comportamento elastico con un minore pre-tensionamento iniziale, che li rendono promettenti nelle applicazioni come impianti per la rigenerazione di miocardio e tendini. I processi di blending messi a punto nel corso della ricerca hanno permesso di ottenere gel omogenei e stabili per mezzo dei quali è stato possibile realizzare dispositivi con diverse morfologie per diversi ambiti applicativi: dispositivi 2D compatti dall’aspetto di membrane semitrasparenti idonei per rigenerazione del miocardio e ligamenti/tendini e 3D porosi, ottenuti attraverso processi di liofilizzazione, con l’aspetto di spugne, idonei alla riparazione/rigenerazione osteo-cartilaginea. I test di compatibilità cellulare con cardiomioblasti, hanno dimostrato come entrambi i materiali compositi realizzati risultino idonei a processi di semina di cellule differenziate ed in grado di promuovere processi di proliferazione cellulare, analogamente a quanto avviene per il collagene puro.