Efeito da deficiência de potássio sobre as atividades de glutamato desidrogenase e glutamato sintase em feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)

Foi estudado o efeito da deficiência de potássio sobre as atividades da glutamato desidrogenase (EC. 1.4.1.2) e glutamato sintase (EC. 2.6.1.53) em folhas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). Os resultados mostraram que a atividade específica da glutamato desidrogenase aumentou nas plantas deficientes em potássio nos dois cultivares estudados. Foi detectada redução na atividade de glutamato sintase nas plantas deficientes em potássio.

Crescimento e nodulação de Acacia mangium, Enterolobium contortisiliquum e Sesbania virgata em solo contaminado com metais pesados

Um dos desafios atuais da pesquisa é encontrar plantas e microssimbiontes tolerantes e que possibilitem a revegetação de áreas degradadas por excesso de metais pesados. Este experimento foi realizado no período de agosto a dezembro de 1998, em casa de vegetação do Departamento de Ciência do Solo da UFLA, Lavras (MG), com o objetivo de avaliar a tolerância a metais pesados e a capacidade de estabelecimento de simbiose de rizóbio de diferentes origens com Enterolobium contortisiliquum (tamboril), Acacia mangium (acácia) e Sesbania virgata (sesbânia), em misturas de solos, que continham proporções de solo contaminado (PSC): (0, 15, 30, 45 e 60% v/v) com Zn, Cd, Pb e Cu (18.600, 135, 600 e 596 mg dm-3, extraídos por aqua regia, respectivamente), diluído em Latossolo Vermelho distrófico. Estirpes recomendadas (E) e isolados de solo contaminado (ISC) e de solo não contaminado (ISNC), cuja tolerância a Cu, Cd e Zn foi determinada previamente "in vitro", foram inoculados. O aumento da PSC nas misturas inibiu o crescimento vegetativo, a produção de matéria seca e a nodulação das três espécies. A simbiose tamboril-BR4406 foi a mais tolerante e acácia-BR3617 a mais sensível à contaminação do solo. Os ISC que foram mais tolerantes "in vitro" formaram nódulos eficientes em solo sem contaminação, mas foram ineficientes em solos contaminados. Na PSC 15% (Zn = 750; Cd = 22,1; Pb = 65,1 e Cu = 111 mg dm-3 extraídos por DTPA) a atividade específica da nitrogenase aumentou 5 e 10 vezes em relação ao solo sem contaminação para as simbioses sesbânia-BR5401 e tamboril-BR4406, respectivamente. A tolerância de rizóbio a metais "in vitro" não correspondeu à tolerância da simbiose em solo contaminado.

Crescimento e acumulação de nitrogênio de plantas de feijoeiro originadas de sementes com alto teor de molibdênio

Sementes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) com alto teor de molibdênio podem garantir o suprimento adequado desse nutriente para a cultura. Foram realizados dois experimentos em casa de vegetação, com o objetivo de avaliar o efeito de sementes enriquecidas com Mo, obtidas em plantas que receberam adubação foliar, no crescimento e acumulação de N do feijoeiro. O substrato foi horizonte A de Argissolo em vasos de 3,5 kg, que receberam calagem e nutrientes, exceto Mo. O primeiro experimento teve arranjo fatorial 3 x 2 x 2 com cinco repetições: três cultivares de feijoeiro, duas concentrações de Mo na semente e duas épocas de coleta. Plantas originadas de sementes com alto teor de Mo, dos três cultivares, apresentaram maior acumulação de biomassa e N na parte aérea, nas duas épocas de coleta. Sementes com alto teor de Mo aumentaram a massa de nódulos dos cultivares Manteigão e Rio Tibagi aos 30 dias pós-emergência (DAE), mas reduziram a massa e o número de nódulos dos cultivares Carioca e Manteigão aos 45 DAE. O maior teor de Mo nas sementes aumentou a atividade da nitrogenase aos 30 DAE e a atividade específica da nitrogenase aos 45 DAE. O segundo experimento teve arranjo fatorial 2 x 2 x 4 com cinco repetições: dois cultivares, dois níveis de Mo na semente e quatro épocas de coleta. Plantas oriundas de sementes com alto teor de Mo apresentaram maior massa de parte aérea aos 47 e 59 DAE, e maior acumulação de N na parte aérea aos 59 DAE. O maior teor de Mo nas sementes não afetou a nodulação até os 45 DAE, mas reduziu o número de nódulos aos 59 DAE. A redução na nodulação no estádio de enchimento de vagens observada nos dois experimentos, nas plantas oriundas de sementes com alto teor de Mo, pode ser atribuída ao maior crescimento dessas plantas, que teria antecipado a translocação de assimilados para as vagens. Pode-se concluir que sementes enriquecidas com Mo, colhidas em plantas que receberam adubação foliar, podem estimular a atividade da nitrogenase e aumentar a acumulação de biomassa e N do feijoeiro.

Interdependência na absorção e redistribuição de fósforo entre planta mãe e filha de bananeira

Apesar da importância do conhecimento da interdependência entre planta mãe e filha da bananeira, para adoção de manejos adequados, pouco tem sido pesquisado no Brasil. Foi montado um experimento, medindo a redistribuição de 32P entre mãe e filha, cultivadas por 2; 4 e 6 meses, adubadas ou não com P, aplicando-se 32P no solo. As plantas cresceram até a última colheita, com mais massa na mãe (1450 g) que na filha (900 g), sem resposta à adubação. Os rizomas tinham as maiores biomassas (53-68%) a as velas as menores (2-4%), enquanto o inverso ocorreu com os teores de P (1,4-2,6 e 3,3-5,4 mg kg-1). Em todas as épocas, houve redistribuição da mãe para a filha e vice-versa, mas a mãe reteve a maior proporção do 32P, embora declinante (95 a 78%), enquanto a filha dividiu igualmente com a mãe, até os seis meses, quando reteve uma proporção maior (60%). Mais 32P dirigiu-se para os rizomas e pseudocaules, e menos para as velas, com folhas e raízes em posições intermediárias, mas as concentrações por unidade de massa ou de P total foram maiores nas velas. Portanto, mãe e filha mantiveram-se interdependentes, com ampla distribuição do 32P absorvido, embora com preferência para as velas.

Tratamento térmico na manutenção da coloração de lichias

O objetivo do trabalho foi avaliar a influência do tratamento térmico na coloração de frutos de lichia. Os frutos foram tratados por 0; 5; 10; 15; 20 e 25 minutos de imersão em água a 45ºC, embalados em bandejas de poliestireno expandido e filme de policloreto de vinila 0,020mm e armazenados em B.O.D. a 5ºC e 90±5 % de UR. O delineamento experimental foi em esquema inteiramente casualizado, com 6 tempos de armazenamento para as análises de coloração e enzimática, e até atingirem o limite de comercialização para a análise da vida útil, sendo os frutos analisados a cada 3 dias, com 3 repetições e 10 frutos por unidade experimental. Os parâmetros avaliados foram: análise visual do escurecimento, coloração e atividade específica da polifenol oxidase e da peroxidase. Os tratamentos usando 5 e 10 minutos de imersão foram os que apresentaram melhores resultados na manutenção da coloração dos frutos e na diminuição da atividade enzimática.

Determinação espectrofotométrica por injeção em fluxo de compostos fenólicos em águas residuárias empregando peroxidase de abobrinha (Cucurbita pepo)

Empregou-se nesse trabalho alguns vegetais como fonte de peroxidase. Após a determinação de proteína total, atividade e atividade específica, selecionou-se o extrato bruto da abobrinha (Cucurbita pepo) como fonte dessa enzima para ser empregado em um sistema de análise por injeção em fluxo com detecção espectrofotométrica para a determinação de diversos compostos fenólicos (e.g. fenol, catecol, 2,4-diclorofenol, 4-cloro-3-metilfenol, 4-acetamidofenol, 4-clorofenol, 2,4,6-triclorofenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol e hidroquinona). Após a otimização desse sistema em fluxo, o mesmo foi empregado na determinação de compostos fenólicos em águas residuárias de indústrias da região de São Carlos-SP, no intervalo de concentração de 2,0x10-4 a 4,0x10-3 mol L-1, com LD de 8,0x10-5 mol L-1 e freqüência analítica de 58 h-1. A recuperação de fenol em 3 amostras variou de 98,3 a 106, 2% e o RSD foi menor que 1,2% para soluções de fenol nas concentrações de 6,0x10-4 e 8,0x10-4 mol l-1 (n=10).

Caracterização de alfagalactosidase e sua relação com a germinação das sementes de Caesalpinia peltophoroides (Leguminosae Caesalpinioideae)

Sementes de Caesalpinia peltophoroides (Leguminosae Caesalpinioideae) - sibipiruna - foram colocadas para embebição por 144 h, sendo retiradas amostras para análise de proteína, quantificações da atividade de alfagalactosidase e de açúcares presentes na micrópila. A germinação iniciou-se com 96 h de embebição, sem que fossem detectadas modificações na parede celular da micrópila. Nesta, observou-se maior proporção de arabinose, que mostrou tendência de aumento com o decorrer da embebição. A atividade específica da alfagalactosidase foi detectada em sementes secas, tanto no eixo embrionário quanto nos cotilédones, aumentando no primeiro a partir de 24 h de embebição. O aumento da atividade nos cotilédones foi mais lento, sendo mais acentuado a partir de 120 h de embebição. O teor de proteína decresceu continuamente no eixo embrionário a partir de 24 horas de embebição, enquanto se manteve estável nos cotilédones. A atividade da alfagalactosidase foi máxima nas temperaturas de 55 e 50 ºC para o eixo embrionário e para os cotilédones, respectivamente. O pH que mais estimulou a atividade da enzima foi na faixa de 5,5 a 6,0 para o eixo embrionário e na de 4,5 a 5,0 para os cotilédones. As alfagalactosidase do eixo embrionário e dos cotilédones foram inibidas por SDS, CuSO4, galactose e melibiose. Não houve efeito estimulante sobre a atividade da alfagalactosidase do eixo embrionário por nenhum dos efetores, enquanto o mercaptoetanol estimulou a atividade da enzima dos cotilédones. Os K M para o substrato ro-NPGal para a alfagalactosidase do eixo embrionário e dos cotilédones foram de 1,74 e 2,64 mM, respectivamente.

Hidrólise enzimática do óleo de pescado

O óleo de pescado tem sido alvo de várias pesquisas em função dos benefícios nutricionais dos ácidos graxos poliinsaturados. Esse fato pode ser comprovado pelos estudos epidemiológicos que relacionam a baixa incidência de doenças cardiovasculares com o consumo de ácidos graxos n-3 (EPA-eicosapentaenóico e DHA-docosahexaenóico) provenientes de peixes marinhos. A obtenção de ácidos graxos poliinsaturados n-3 pode ser realizada por hidrólise enzimática. A hidrólise enzimática de óleos e gorduras, ou lipólise, é bem conhecida e vem sendo estudada para produzir ácidos graxos e modificar as gorduras por esterificação, transesterificação e interesterificação. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de ácidos graxos poliinsaturados por hidrólise enzimática do óleo de pescado industrial. A hidrólise de 1262,81 µmoles de óleo de pescado com lipase pancreática porcina (concentração de extrato enzimático de 7,647 mg.mL-1), 60 minutos, 38 °C, pH 8, tampão NH4Cl-NH4OH. Os produtos da hidrólise foram separados por cromatografia em coluna e caracterizados por cromatografia em camada delgada (TLC) e gasosa (GLC). A enzima apresentou uma atividade específica de 10,14 ± 0,15 UE.mg de proteínas-1 e com 60 minutos de reação se obteve 44,45% de hidrólise com 1865,76 ± 41,15 µmols de ácidos graxos. Foram identificados ácidos graxos livres, mono-acilgliceróis, di-acilgliceróis e tri-acilgliceróis. Na fração dos tri-acilgliceróis verificou-se um aumento de 46,14% e 40,23% de ácido araquidônico e eicosapentaenóico (EPA) respectivamente, enquanto que na fração monoacilglicerol um acréscimo de 96,96% e 52,55% de DPA e DHA.

Imobilização de lipases produzidas por fermentação em estado sólido utilizando Penicillium verrucosum em suportes hidrofóbicos

O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à sua forma livre. Aliado ao potencial biotecnológico que as lipases apresentam, a aplicação destas em nível industrial requer a investigação de técnicas viáveis para reutilização e aumento da estabilidade, conferindo relevância aos processos de imobilização. Neste trabalho investigou-se a imobilização da lipase produzida por fermentação em estado sólido utilizando Penicillium verrucosum em dois suportes hidrofóbicos; Accurel EP 1000 e Carvão Ativo. Para a imobilização das lipases foi adicionado 1 g de suporte a 50 mL de uma solução enzimática, estes permaneceram em contato por 2 horas em banho de gelo. Depois de decorrido este tempo, a solução foi filtrada e a enzima imobilizada colocada em dessecador por 48 horas e então feita a medida da atividade lipásica, proteína e cálculo da atividade específica. Através dos resultados obtidos, verificou-se que lipase imobilizada em carvão ativo apresentou valores de atividade específica superiores aos obtidos quando da utilização de Accurel EP 1000 como suporte. Utilizando carvão ativo como suporte, a atividade específica foi de 1533422,5 U/mg de proteína, rendimento de 30,4% e retenção de 382,5%.

Caracterização de alfa-galactosidase em embrião e cotilédones de sementes de Platymiscium pubescens Micheli, var. pubecens (tamboril-da-mata)

Sementes de Platymiscium pubescens foram colocadas para embeber em água, sendo retiradas amostras para as caracterizações bioquímica e cinética da enzima alfa-galactosidase do eixo embrionário e dos cotilédones. A atividade específica no eixo embrionário aumenta de zero até o tempo de 96 horas de embebição, estabilizando em seguida. A atividade da enzima dos cotilédones mostrou pequeno incremento durante esse mesmo tempo. A alfa-galactosidase do eixo embrionário apresentou atividade máxima no intervalo de pH de 4,5 a 6,0. Por outro lado, para a enzima proveniente dos cotilédones, a maior atividade foi detectada na faixa de 4,0 a 6,0. A temperatura de 55ºC foi a que mais estimulou as atividades da alfa-galactosidase do eixo embrionário e dos cotilédones. As enzimas do eixo embrionário e dos cotilédones mostraram-se termotolerantes, não se alcançando a meia vida na temperatura de 40ºC, no período de 1.500 minutos. A atividade da alfa-galactosidase do eixo embrionário foi inibida por melibiose, CuSO4 e SDS, enquanto a dos cotilédones foi por todos os efetores, exceto com SDS, CuSO4 e galactose que tiveram efeito neutro sobre a atividade da alfa-galactosidase dos cotilédones. Os valores de K M para as alfa-galactosidases do embrião e para o cotilédone foram 3,37 e 0,26 mM, respectivamente.

Alterações nas atividades das enzimas alfa-galactosidase e poligalacturonase e nas reservas de carboidratos de sementes de Schizolobium parahyba (vell.) Blake (guapuruvú) durante a germinação

A retomada do metabolismo do embrião durante a germinação é realizada por processos metabólicos que culminam na protrusão da radícula e no fornecimento de energia para o desenvolvimento inicial da plântula. O objetivo deste trabalho foi estudar as variações nas atividades das enzimas alfa-galactosidase e poligalacturonase e nas reservas de mono e oligossacarídeos em sementes de guapuruvú durante a germinação. Para tanto, as sementes foram colocadas para germinar e as reservas do eixo embrionário e cotilédones, avaliadas periodicamente. Os teores de galactose no eixo embrionário diferiram significativamente somente entre a testemunha e o oitavo dia, muito embora houvesse aumento contínuo até o quarto dia. Somente no sexto dia de germinação houve aumento no teor de galactose nos cotilédones. Houve tendência de aumento nos teores de arabinose, manose e glicose no eixo embrionário, não sendo detectada a presença de xilose no oitavo dia. Nos cotilédones os mesmos açúcares não foram originalmente detectados no tempo zero, mas apresentaram valores mais altos nas amostras do oitavo dia. Os teores de galactose oscilam tanto no eixo embrionário, quanto nos cotilédones durante o período de germinação de sementes de guapuruvu. Os teores de sacarose aumentam e os de rafinose decrescem nos cotilédones e no eixo embrionário. Os teores de estaquiose permanecem aproximadamente estáveis no eixo e nos cotilédones, com decréscimo no eixo, no oitavo dia. A enzima alfa-galactosidase é pré-formada, tendo clara redução na sua atividade específica, no segundo dia, permanecendo constante até o oitavo. A atividade nos cotilédones apresenta aumento no quarto dia, decrescendo posteriormente. A enzima polygalacturonase é tambem pré-formada, com maior atividade inicial no eixo. A atividade nos cotilédones aumenta até o sexto dia, alcançando maiores valores que o do eixo embrionário e, em seguida, decresce para valores menores do que aqueles.

Identificação das características cinéticas, expressão e localização das ecto-nucleotidases em cultura de astrócitos e linhagens de gliomas

Nucleotídeos extracelulares são envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Astrócitos são a maior fonte de nucleotídeos extracelulares da adenina no cérebro e também importantes alvos para as ações desses nucleotídeos via receptores purinérgicos P2. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ecto-nucleotidases, que incluem membros da família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase), ecto-5’-nucleotidase (ecto- 5’N) e ecto-adenosina deaminase (ADA). Culturas de astrócitos preparadas de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos foram capazes de rapidamente converter ATP extracelular a ADP, que foi então hidrolizado a AMP. Os nucleosídeos tri-fosfatados foram hidrolisados preferencialmente aos difosfatados em todas as estruturas cerebrais. A análise cinética sugere que varias ecto-nucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Análises preliminares de mRNA por PCR indicaram que astrócitos expressam múltiplos membros da família das NTPDases (NTPDase1 a NTPDase3 e NTPDase5/6). Por RT-PCR quantitativo (Real-time PCR), nós identificamos a NTPDase2 (CD39L1) como a NTPDase predominante expressa por astrócitos de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos. Astrócitos do cerebelo apresentaram um padrão diferente para a hidrólise do AMP, com uma atividade específica 7 vezes maior, quando comparada com astrócitos de hipocampo e córtex. Uma maior expressão da ecto-5’N por RT-PCR foi identificada nessa estrutura. Não houve acúmulo de adenosina extracelular em todas as estruturas estudadas, indicando a presença de uma alta atividade ecto-adenosina deaminase em astrócitos. Dipiridamol aumentou significativamente os níveis de inosina no meio extracelular de astrócitos de hipocampo e córtex, mas não em astrócitos de cerebelo. Essas diferenças observadas podem indicar heterogeneidade funcional dos nucleotídeos no cérebro. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos como indicadoras da invasividade e agressividade dos gliomas malignos, nós avaliamos a degradação dos nucleotídeos extracelulares em cinco linhagens de gliomas diferentes e comparamos com astrócitos. Todas as linhagens de gliomas examinadas apresentaram baixas razões de hidrólise quando comparadas com astrócitos. Resultados preliminares sugerem que a falta de expressão da NTPDase1 e 2 possam ser responsáveis pela baixa hidrólise de ATP nas linhagens de gliomas. Considerando que o ATP é reconhecido como um fator mitogênico que induz a proliferação em células de gliomas, a substancial diminuição na hidrólise de ATP e ADP observadas em gliomas, sugere que alterações na via das ecto-nucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna desse tipo de tumor.

Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Isolamento de bactérias resistentes a cromo hexavalente e purificação parcial da enzima redutora de cromo do Bacillus sp. ES29

A redução do Cr(VI) para Cr(III) diminui a toxidade deste metal no ambiente uma vez que, o Cr(III) é insolúvel às membranas biológicas. Assim a redução microbiana do Cr(VI) é uma alternativa para reduzir os impactos ambientais causados por este metal, utilizado em diversos processos industriais. O objetivo deste trabalho foi selecionar microrganismos a partir de solo contaminado com cromo, caracterizar sua capacidade de redução do Cr(VI) durante o crescimento celular e purificar parcialmente a enzima cromo redutase do Bacillus sp. ES29, através da precipitação com sulfato de amônio (45-75%), cromatografia de gel filtração (Sephadex G-25) e cromatografia de interação hidrofóbica (Octyl Sepharose). A atividade de redução do Cr(VI) pelos isolados foi quantificada com o reagente de s-difenilcarbazida. No isolamento, foram obtidas 20 bactérias resistentes a cromo(VI). Seis destas foram capazes de reduzir 100 mg L-1 Cr(VI) em 24 horas. Um dos isolados foi identificado, através de testes bioquímicos, como pertencete ao gênero Bacillus, sendo tolerante a 750 mg L-1 Cr(VI) e reduzindo mais de 40% do Cr(VI) durante o crescimento celular. Na purificação parcial da enzima foi obtido um fator de purificação de 11,2, aumentando a atividade específica da enzima acima de 11 vezes, porém se faz necessário mais passos de purificações para obtenção desta enzima pura. As bactérias selecionadas e a enzima parcialmente purificada, foram eficientes na redução do Cr(VI) e apresentam potencial para outros estudos, visando a aplicação em processos de biorremediação.