Prospective phase II trial of extended treatment with rituximab in patients with B-cell post-transplant lymphoproliferative disease.

BACKGROUND AND OBJECTIVES The elective treatment of patients with post-transplant lymphoproliferative disorders is controversial. The purpose of this trial was to evaluate the efficacy of treatment with extended doses of rituximab adapted to the response in patients with post-transplant lymphoproliferative disorders after solid organ transplantation. DESIGN AND METHODS This was a prospective, multicenter, phase II trial. Patients were treated with reduction of immunosuppression and four weekly infusions of rituximab. Those patients who did not achieve complete remission (CR) received a second course of four rituximab infusions. The primary end-point of the study was the CR rate. RESULTS Thirty-eight patients were assesable. One episode of grade 4 neutropenia was the only severe adverse event observed. After the first course of rituximab, 13 (34.2%) patients achieved CR, 8 patients did not respond, and 17 patients achieved partial remission. Among those 17 patients, 12 could be treated with a second course of rituximab, and 10 (83.3%) achieved CR, yielding an intention-to-treat CR rate of 60.5%. Eight patients excluded from the trial because of absence of CR were treated with rituximab combined with chemotherapy, and six (75%) achieved CR. Event-free survival was 42% and overall survival was 47% at 27.5 months. Fourteen patients died, ten of progression of their post-transplant lymphoproliferative disorder. INTERPRETATION AND CONCLUSIONS These results confirm that extended treatment with rituximab can obtain a high rate of CR in patients with post-transplant lymphoproliferative disorders after solid organ transplantation without increasing toxicity, and should be recommended as initial therapy for these patients.

Biosensor para el diagnóstico y seguimiento de inmunodeficiencias

La infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) y el Síndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) afecta a millones de personas en todo el mundo, y constituye una amenaza a la salud y la vida de muchas otras más, sobre todo en países en vías de desarrollo. Existe un gran interés en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para el diagnóstico de dicha enfermedad de forma rápida, económica y fuera del ámbito del laboratorio por personal no especializado. Los biosensores son dispositivos ideales para cubrir esta demanda analítica facilitando la toma de decisiones y permitiendo un uso racional de técnicas analíticas confirmatorias más costosas. Se plantea el diseño de una estrategia magneto-ELISA con detección óptica así como un dispositivo magneto biosensor electroquímico para el diagnóstico de SIDA a través del recuento de células marcadoras de la enfermedad presentes en la sangre. Ambas estrategias se basan en la captura inmunomagnética de linfocitos T CD4+ con partículas magnéticas modificadas con anticuerpos monoclonales específicos (anti-CD3). La detección de las células capturadas se realiza con un anticuerpo primario anti-CD4 marcado con biotina (antiCD4-biotina) y con un conjugado de estreptavidina y de la enzima HRP (peroxidasa de rábano picante). La unión de esta enzima al anticuerpo primario se realiza a través del complejo biotina/estreptavidina. Se proponen dos tipos de sistemas de detección: óptico y electroquímico. Esto se logra mediante la elección adecuada del sustrato para cada sistema planteado. El dispositivo biosensor basados en un transductor electroquímico renovable y magnético acoplado a partículas magnéticas específicas para las células marcadoras de la enfermedad, consigue la simplificación metodológica y facilita la transferencia de la tecnología hacia la fabricación de un biokit diagnóstico en el ámbito clínico. La potencial aplicación de los dispositivos analíticos propuestos en este trabajo tienen un interés social elevado por su idoneidad para realizar análisis, rápidos, económicos y en el ámbito de la propia consulta médica.

Off-label uses of anti-TNF therapy in three frequent disorders: Behçet's disease, sarcoidosis, and noninfectious uveitis.

Tumoral necrosis factor α plays a central role in both the inflammatory response and that of the immune system. Thus, its blockade with the so-called anti-TNF agents (infliximab, etanercept, adalimumab, certolizumab pegol, and golimumab) has turned into the most important tool in the management of a variety of disorders, such as rheumatoid arthritis, spondyloarthropatties, inflammatory bowel disease, and psoriasis. Nonetheless, theoretically, some other autoimmune disorders may benefit from these agents. Our aim is to review these off-label uses of anti-TNF blockers in three common conditions: Behçet's disease, sarcoidosis, and noninfectious uveitis. Due to the insufficient number of adequate clinical trials and consequently to their lower prevalence compared to other immune disorders, this review is mainly based on case reports and case series.

Rituximab in treatment-resistant CIDP with antibodies against paranodal proteins.

OBJECTIVE To describe the response to rituximab in patients with treatment-resistant chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP) with antibodies against paranodal proteins and correlate the response with autoantibody titers. METHODS Patients with CIDP and IgG4 anti-contactin-1 (CNTN1) or anti-neurofascin-155 (NF155) antibodies who were resistant to IV immunoglobulin and corticosteroids were treated with rituximab and followed prospectively. Immunocytochemistry was used to detect anti-CNTN1 and anti-NF155 antibodies and ELISA with human recombinant CNTN1 and NF155 proteins was used to determine antibody titers. RESULTS Two patients had a marked improvement; another patient improved slightly after 10 years of stable, severe disease; and the fourth patient had an ischemic stroke unrelated to treatment and was lost to follow-up. Autoantibodies decreased in all patients after rituximab treatment. CONCLUSIONS Rituximab treatment is an option for patients with CIDP with IgG4 anti-CNTN1/NF155 antibodies who are resistant to conventional therapies. CLASSIFICATION OF EVIDENCE This study provides Class IV evidence that rituximab is effective for patients with treatment-resistant CIDP with IgG4 anti-CNTN1 or anti-NF155 antibodies.

Response to Infliximab in Crohn's Disease: Genetic Analysis Supporting Expression Profile.

Substantial proportion of Crohn's disease (CD) patients shows no response or a limited response to treatment with infliximab (IFX) and to identify biomarkers of response would be of great clinical and economic benefit. The expression profile of five genes (S100A8-S100A9, G0S2, TNFAIP6, and IL11) reportedly predicted response to IFX and we aimed at investigating their etiologic role through genetic association analysis. Patients with active CD (350) who received at least three induction doses of IFX were included and classified according to IFX response. A tagging strategy was used to select genetic polymorphisms that cover the variability present in the chromosomal regions encoding the identified genes with altered expression. Following genotyping, differences between responders and nonresponders to IFX were observed in haplotypes of the studied regions: S100A8-S100A9 (rs11205276* G/rs3014866* C/rs724781* C/rs3006488* A; P = 0.05); G0S2 (rs4844486* A/rs1473683* T; P = 0.15); TNFAIP6 (rs11677200* C/rs2342910* A/rs3755480* G/rs10432475* A; P = 0.10); and IL11 (rs1126760* C/rs1042506* G; P = 0.07). These differences were amplified in patients with colonic and ileocolonic location for all but the TNFAIP6 haplotype, which evidenced significant difference in ileal CD patients. Our results support the role of the reported expression signature as predictive of anti-TNF outcome in CD patients and suggest an etiological role of those top-five genes in the IFX response pathway.

Biological treatments in Behçet's disease: beyond anti-TNF therapy.

Behçet's disease (BD) is universally recognized as a multisystemic inflammatory disease of unknown etiology with chronic course and unpredictable exacerbations: its clinical spectrum varies from pure vasculitic manifestations with thrombotic complications to protean inflammatory involvement of multiple organs and tissues. Treatment has been revolutionized by the progressed knowledge in the pathogenetic mechanisms of BD, involving dysfunction and oversecretion of multiple proinflammatory molecules, chiefly tumor necrosis factor- (TNF-) α, interleukin- (IL-) 1β, and IL-6. However, although biological treatment with anti-TNF-α agents has been largely demonstrated to be effective in BD, not all patients are definite responders, and this beneficial response might drop off over time. Therefore, additional therapies for a subset of refractory patients with BD are inevitably needed. Different agents targeting various cytokines and their receptors or cell surface molecules have been studied: the IL-1 receptor has been targeted by anakinra, the IL-1 by canakinumab and gevokizumab, the IL-6 receptor by tocilizumab, the IL12/23 receptor by ustekinumab, and the B-lymphocyte antigen CD-20 by rituximab. The aim of this review is to summarize all current experiences and the most recent evidence regarding these novel approaches with biological drugs other than TNF-α blockers in BD, providing a valuable addition to the actually available therapeutic armamentarium.

Individualized Therapy with Ranibizumab in Wet Age-Related Macular Degeneration.

Individualized treatment regimens may reduce patient burden with satisfactory patient outcomes in neovascular age-related macular degeneration. Intravitreal anti-VEGF drugs are the current gold standard. Fixed monthly injections offer the best visual outcome but this regimen is not commonly followed outside clinical trials. A PRN regimen requires monthly visits where the patient is treated in the presence of signs of lesion activity. Therefore, an early detection of reactivation of the disease with immediate retreatment is crucial to prevent visual acuity loss. Several trials suggest that "treat and extend" and other proactive regimens provide a reasonable approach. The rationale of the proactive regimens is to perform treatment anticipating relapses or recurrences and therefore avoid drops in vision while individualizing patient followup. Treat and extend study results in significant direct medical cost savings from fewer treatments and office visits compared to monthly treatment. Current data suggest that, for one year, PRN is less expensive, but treat and extend regimen would likely be less expensive for subsequent years. Once a patient is not a candidate to continue with treatment, he/she should be sent to an outpatient unit with adequate resources to follow nAMD patients in order to reduce the burden of specialized ophthalmologist services.

Natalizumab-related anaphylactoid reactions in MS patients are associated with HLA class II alleles.

OBJECTIVES We aimed to investigate potential associations between human leukocyte antigen (HLA) class I and class II alleles and the development of anaphylactic/anaphylactoid reactions in patients with multiple sclerosis (MS) treated with natalizumab. METHODS HLA class I and II genotyping was performed in patients with MS who experienced anaphylactic/anaphylactoid reactions and in patients who did not develop infusion-related allergic reactions following natalizumab administration. RESULTS A total of 119 patients with MS from 3 different cohorts were included in the study: 54 with natalizumab-related anaphylactic/anaphylactoid reactions and 65 without allergic reactions. HLA-DRB1*13 and HLA-DRB1*14 alleles were significantly increased in patients who developed anaphylactic/anaphylactoid reactions (p M-H = 3 × 10(-7); odds ratio [OR]M-H = 8.96, 95% confidence interval [CI] = 3.40-23.64), with a positive predictive value (PPV) of 82%. In contrast, the HLA-DRB1*15 allele was significantly more represented in patients who did not develop anaphylactic/anaphylactoid reactions to natalizumab (p M-H = 6 × 10(-4); ORM-H = 0.2, 95% CI = 0.08-0.50), with a PPV of 81%. CONCLUSIONS HLA-DRB1 genotyping before natalizumab treatment may help neurologists to identify patients with MS at risk for developing serious systemic hypersensitivity reactions associated with natalizumab administration.

Allergens Induce the Release of Lactoferrin by Neutrophils from Asthmatic Patients.

BACKGROUND Despite the evidence that Lactoferrin (Lf) is involved in allergic asthma processes, it is unknown whether neutrophils can be one of the main cellular sources of this key inflammatory mediator directly in response of an IgE mediated stimulus. The present study was undertaken to analyze this question. METHODS Neutrophils from healthy subjects (n = 34) and neutrophils from allergic asthmatic patients (n = 102) were challenged in vitro with specific allergens to which the patients were sensitized, PAF, or agonist mAbs against IgE-receptors, and the levels of Lf were measured in the culture supernatant. The levels of serum IgE together with the severity of symptoms were also analyzed. RESULTS Lf was released into the culture supernatant of neutrophils from allergic asthmatic patients in response to allergens and PAF. This response was highly allergen-specific, and did not happen in neutrophils from healthy donors. Allergen effect was mimicked by Abs against FcεRI and galectin-3 but not by FcεRII. The levels of released Lf correlated well with the levels of serum specific IgE and severity of asthma symptoms. These observations represent a novel view of neutrophils as an important source of Lf in allergic asthma. Importantly, the levels of released Lf by neutrophils could therefore be used to evaluate disease severity in allergic asthmatic patients.

Periodontitis crónica del adulto y alteraciones inmunitarias

El hecho de que las alteraciones inmunitarias están implicadas en la enfermedad periodontal está ampliamente recogido en la literatura. No obstante la naturaleza exacta y la implicación de las mismas no está clara. Por otro lado el empleo de la citometría de flujo ha posibilitado un avance importante en las técnicas de investigación biomédica y en el caso concreto que nos ocupa la posibilidad de determinar diferentes marcadores monoclonales en la línea celular linfocítica. Estudiamos los marcadores monoclonales (CD4, CDB, CD3 y CD19) en 15 pacientes afectados de enfermedad periodontal avanzada. Los resultados obtenidos se encuentran dentro de los límites de normalidad. Si bien no hemos obtenido datos significativos creemos que la muestra es pequeña y sería útil realizar estudios más amplios y a ser posible a nivel local. No obstante pensamos que lo novedoso es el estudio de anticuerpos monoclonales en relacióncon la enfermedad periodontal, datos que no hemos encontrado en la literatura.

Resultados de la terapia antiangiogenica con Ranibizumab en retinopatia del prematuro: revisión sistemática.

Introducción: La retinopatía del prematuro (ROP) se presenta hasta en el 73% de los neonatos pretérmino por debajo de la semana 27, los agentes antiangiogénicos se presentan como una herramienta para su tratamiento con resultados prometedores. En el presente estudio se pretendió evaluar los resultados de la terapia antiangiogénica con ranibizumab en pacientes con retinopatía del prematuro según la evidencia descrita hasta la fecha. Metodología: se realizó una revisión sistemática de literatura con componente meta-analítico de los datos sociodemográficos y clínicos, incluyendo todos los artículos sobre el tema sin límite de fecha de publicación. Se usó una estrategia de búsqueda en diferentes bases de datos, todos los estudios relacionados con el pronóstico de la enfermedad fueron elegibles. Resultados: Se encontraron un total de 13 artículos que cumplieron criterios de elegibilidad para su inclusión, que incluyeron 75 pacientes en total (133 ojos evaluados). La edad promedio al nacimiento fue 23.6 semanas, la edad al momento de aplicación de tratamiento fue 36.3 semanas. 11/13 artículos reportaron que el tratamiento con ranibizumab fue satisfactorio en términos de resolución completa de la enfermedad sin efectos secundarios (64 pacientes) Discusión: Los resultados de la terapia con ranibizumab para retinopatía del prematuro según la evidencia hasta la fecha permiten recomendar el uso de terapia antiangiogénica con el fin de mejorar la salud visual a mediano y largo plazo y por ende disminución en la prevalencia de ceguera por esta causa.

Cambio para optimizar la calidad de las prestaciones del Programa Oncológico Provincial

Considerando el alto costo farmacológico de los tratamientos oncológicos actuales y de los anticuerpos monoclonales pautados para diferentes terapias que están apareciendo y que serán prácticamente lo único que se use en el futuro para diferentes diagnósticos, el Programa Oncológico Provincial cubre sin cargo alguno las necesidades de los pacientes atendidos en Hospitales Estatales, cumpliendo una función social, dispensando los medicamentos solicitados por el médico tratante, en forma confiable, segura, y con equidad para recibir el tratamiento adecuado en el momento oportuno. Los recursos que pueden ser destinados al gasto farmacéutico son limitados, por lo que es necesario racionalizar el consumo y priorizar en la asignación de estos recursos a las opciones que presentan mayores ventajas económicas, basada en mantener una mejor relación costo/beneficio, repercutiendo de manera directa en los enfermos y en la sociedad en general. En este trabajo, se analiza el sistema de adquisición de drogas oncológicas usado por el Programa Oncológico Provincial realizando una comparación entre el sistema de compras original y el adoptado por el Programa en el año 2005. Se evalúa el periodo 2001-2007, en base a diversos indicadores y datos estadísticos, para determinar si ha mejorado la calidad de las prestaciones, si ha disminuido la demanda contenida y si se ha logrado mejorar la relación costo / beneficio, controlando así el gasto sanitario global lo que constituiría una inversión rentable para el sistema de salud. Los resultados indican que el nuevo sistema adoptado por el Programa Provincial de Oncología ha mejorado la provisión de medicamentos y garantiza mayor calidad en las prestaciones, pero estos resultados pueden ser superados. También muestra la gravedad del problema de la utilización de los nuevos fármacos monoclonales.

Podredumbre parda del melocotonero (Monilinia spp.) : detección, identificación de especies y contribución a la epidemiología de la enfermedad

Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena y M. fructicola) causa marchitez en brotes y flores, chancros en ramas y podredumbre de la fruta de hueso provocando pérdidas económicas importantes en años con climatología favorable para el desarrollo de la enfermedad, particularmente en variedades tardías de melocotonero y nectarino. En estos huéspedes en España, hasta el momento, la especie predominante es M. laxa y, en menor proporción, M. fructigena. La reciente introducción en Europa de la especie de cuarentena M. fructicola hace necesaria una detección e identificación rápida de cada una de las especies. Además, hay diversos aspectos de la etiología y epidemiología de la enfermedad que no se conocen en las condiciones de cultivo españolas. En un primer objetivo de esta Tesis se ha abordado la detección e identificación de las especies de Monilinia spp. causantes de podredumbre parda. El estudio de las bases epidemiológicas para el control de la enfermedad constituye el fin del segundo objetivo. Para la detección del género Monilinia en material vegetal por PCR, diferenciándolo de otros hongos presentes en la superficie del melocotonero, se diseñaron una pareja de cebadores siguiendo un análisis del ADN ribosomal. La discriminación entre especies de Monilinia se consiguió utilizando marcadores SCAR (región amplificada de secuencia caracterizada), obtenidos después de un estudio de marcadores polimórficos de ADN amplificados al azar (RAPDs). También fue diseñado un control interno de amplificación (CI) basado en la utilización de un plásmido con secuencias de los cebadores diferenciadores del género, para ser utilizado en el protocolo de diagnóstico de la podredumbre parda con el fin de reconocer falsos negativos debidos a la inhibición de PCR por componentes celulares del material vegetal. Se disponía de un kit comercial que permitía distinguir Monilinia de otros géneros y M. fructicola del resto de especies mediante anticuerpos monoclonales utilizando la técnica DAS-ELISA. En esta Tesis se probaron diferentes fuentes de material como micelio ó conidias procedentes de cultivos en APD, o el micelio de la superficie de frutas o de momias frescas, como formas de antígeno. Los resultados obtenidos con ELISA se compararon con la identificación por métodos morfológico-culturales y por PCR con los cebadores desarrollados en esta Tesis. Los resultados demostraron la posibilidad de una detección temprana en frutas frescas por este método, realzando las posibilidades de una diagnosis temprana para una prevención más eficaz de M. fructicola en fruta de hueso. El estudio epidemiológico de la enfermedad comenzó con la determinación de las principales fuentes de inóculo primario y su importancia relativa en melocotoneros y nectarinos del valle del Ebro. Para ello se muestrearon 9 huertos durante los años 2003 a 2005 recogiendo todas las momias, frutos abortados, gomas, chancros, y brotes necróticos en los árboles. También se recogieron brotes aparentemente sanos y muestras de material vegetal situados en el suelo. En estas muestras se determinó la presencia de Monilinia spp. Los resultados mostraron que la fuente principal de inóculo son las momias que se quedan en los árboles en las que la supervivencia del hongo tras el invierno es muy alta. También son fuentes de inóculo las momias del suelo y los brotes necróticos. De aquí se deriva que una recomendación importante para los agricultores es que deben eliminar este material de los huertos. Un aspecto no estudiado en melocotonero o nectarino en España es la posible relación que puede darse entre la incidencia de infecciones latentes en los frutos inmaduros a lo largo del cultivo y la incidencia de podredumbre en los frutos en el momento de la recolección y en postcosecha. Esta relación se había observado previamente en otros frutales de hueso infectados con M. fructicola en diversos países del mundo. Para estudiar esta relación se realizaron ensayos en cinco huertos comerciales de melocotonero y nectarino situados en el Valle del Ebro en cuatro estados fenológicos durante los años 2000-2002. No se observaron infecciones latentes en botón rosa, dándose la máxima incidencia en precosecha, aunque en algunos huertos se daba otro pico en el endurecimiento del embrión. La especie prevaleciente fue M. laxa. Se obtuvo una correlación positiva significativa entre la incidencia de infecciones latentes y la incidencia de podredumbre en postcosecha. Se desarrolló también un modelo de predicción de las infecciones latentes en función de la temperatura (T) y el periodo de humectación (W). Este modelo indicaba que T y W explicaban el 83% de la variación en la incidencia de infecciones latentes causadas por Monilinia spp. Por debajo de 8ºC no se predecían latentes, necesitándose más de 22h de W para predecir la ocurrencia de latentes con T = 8ºC, mientras que solo se necesitaban 5h de W a 25ºC. Se hicieron también ensayos en condiciones controladas para determinar la relación entre la incidencia de las infecciones latentes, las condiciones ambientales (T y W), la concentración de inóculo del patógeno (I) y el estado de desarrollo del huésped (S) y para validar el modelo de predicción desarrollado con los experimentos de campo. Estos ensayos se llevaron cabo con flores y frutos de nectarino procedentes de un huerto comercial en seis estados fenológicos en los años 2004 y 2005, demostrándose que la incidencia de podredumbre en postcosecha y de infecciones latentes estaba afectada por T, W, I y S. En los frutos se producían infecciones latentes cuando la T no era adecuada para el desarrollo de podredumbre. Una vez desarrollado el embrión eran necesarias más de 4-5h de W al día y un inóculo superior a 104 conidias ml-1 para que se desarrollase o podredumbre o infección latente. La ecuación del modelo obtenido con los datos de campo era capaz de predecir los datos observados en estos experimentos. Para evaluar el efecto del inóculo de Monilinia spp. en la incidencia de infecciones latentes y de podredumbre de frutos en postcosecha se hicieron 11 experimentos en huertos comerciales de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro durante 2002 a 2005. Se observó una correlación positiva entre los números de conidias de Monilinia spp. en la superficie de los frutos y la incidencia de infecciones latentes De los estudios anteriores se deducen otras dos recomendaciones importantes para los agricultores: las estrategias de control deben tener en cuenta las infecciones latentes y estimar el riesgo potencial de las mismas basándose en la T y W. Deben tener también en cuenta la concentración de esporas de Monilinia spp. en la superficie de los frutos para disminuir el riesgo de podredumbre parda. El conocimiento de la estructura poblacional de los patógenos sienta las bases para establecer métodos más eficaces de manejo de las enfermedades. Por ello en esta Tesis se ha estudiado el grado de diversidad genética entre distintas poblaciones de M. laxa en diferentes localidades españolas utilizando 144 marcadores RAPDs (59 polimórficos y 85 monomórficos) y 21 aislados. El análisis de la estructura de la población reveló que la diversidad genética dentro de las subpoblaciones (huertos) (HS) representaba el 97% de la diversidad genética (HT), mientras que la diversidad genética entre subpoblaciones (DST) sólo representaba un 3% del total de esta diversidad. La magnitud relativa de la diferenciación génica entre subpoblaciones (GST) alcanzaba 0,032 y el número estimado de migrantes por generación (Nm) fue de 15,1. Los resultados obtenidos en los dendrogramas estaban de acuerdo con el análisis de diversidad génica. Las agrupaciones obtenidas eran independientes del huerto de procedencia, año o huésped. En la Tesis se discute la importancia relativa de las diferentes fuentes evolutivas en las poblaciones de M. laxa. Finalmente se realizó un muestreo en distintos huertos de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro para determinar la existencia o no de aislados resistentes a los fungicidas del grupo de los benzimidazoles y las dicarboximidas, fungicidas utilizados habitualmente para el control de la podredumbre parda y con alto riesgo de desarrollar resistencia en las poblaciones patógenas. El análisis de 114 aislados de M. laxa con los fungicidas Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), e Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), mostró que ninguno era resistente en las dosis ensayadas. Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena and M. fructicola) cause bud and flower wilt, canker in branches and stone fruit rot giving rise important economic losses in years with appropriate environmental conditions, it is particularly important in late varieties of peach and nectarine. Right now, M. laxa is the major species for peach and nectarine in Spain followed by M. fructigena, in a smaller proportion. The recent introduction of the quarantine organism M. fructicola in Europe makes detection and identification of each one of the species necessary. In addition, there are different aspects of disease etiology and epidemiology that are not well known in Spain conditions. The first goal of this Thesis was the detection and identification of Monilinia spp. causing brown rot. Study of the epidemiology basis for disease control was the second objective. A pair of primers for PCR detection was designed based on the ribosomal DNA sequence in order to detect Monilinia spp. in plant material and to discriminate it from other fungi colonizing peach tree surface. Discrimination among Monilinia spp. was successful by SCAR markers (Sequence Characterized Amplified Region), obtained after a random amplified polymorphic DNA markers (RAPDs) study. An internal control for the PCR (CI) based on the use of a mimic plasmid designed on the primers specific for Monilinia was constructed to be used in diagnosis protocol for brown rot in order to avoid false negatives due to the inhibition of PCR as consequence of remained plant material. A commercial kit based on DAS-ELISA and monoclonals antibodies was successfully tested to distinguish Monilinia from other fungus genera and M. fructicola from other Monilinia species. Different materials such as micelium or conidias from APD cultures, or micelium from fresh fruit surfaces or mummies were tested in this Thesis, as antigens. Results obtained by ELISA were compared to classical identification by morphologic methods and PCR with the primers developed in this Thesis. Results demonstrated the possibility of an early detection in fresh fruits by this method for a more effective prevention of M. fructicola in stone fruit. The epidemiology study of the disease started with the determination of the main sources of primary inoculum and its relative importance in peach trees and nectarines in the Ebro valley. Nine orchards were evaluated during years 2003 to 2005 collecting all mummies, aborted fruits, rubbers, cankers, and necrotic buds from the trees. Apparently healthy buds and plant material located in the ground were also collected. In these samples presence of Monilinia spp. was determined. Results showed that the main inoculum sources are mummies that stay in the trees and where fungus survival after the winter is very high. Mummies on the ground and the necrotics buds are also sources of inoculum. As consequence of this an important recommendation for the growers is the removal of this material of the orchards. An important issue not well studied in peach or nectarine in Spain is the possible relationship between the incidence of latent infections in the immature fruits and the incidence of fruit rot at harvesting and postharvesting. This relationship had been previously shown in other stone fruit trees infected with M. fructicola in different countries over the world. In order to study this relationship experiments were run in five commercial peach and nectarine orchards located in the Ebro Valley in four phenologic states from 2000 to 2002. Latent infections were not observed in pink button, the maxima incidence arise in preharvest, although in some orchards another increase occurred in the embryo hardening. The most prevalence species was M. laxa. A significant positive correlation between the incidence of latent infections and the incidence of rot in postharvest was obtained. A prediction model of the latent infections based on the temperature (T) and the wetness duration (W) was also developed. This model showed that T and W explained 83% of the variation in latent infection incidence caused by Monilinia spp. Below 8ºC latent infection was not predicted, more than 22h of W with T = 8ºC were needed to predict latent infection occurrence of, whereas at 25ºC just 5h of W were enough. Tests under controlled conditions were also made to determine the relationship among latent infections incidence, environmental conditions (T and W), inoculum concentration of the pathogen (I) and development state of the host (S) to validate the prediction model developed on the field experiments. These tests were made with flowers and fruits of nectarine coming from a commercial orchard, in six phenologic states in 2004 and 2005, showing that incidence of rot in postharvest and latent infections were affected by T, W, I and S. In fruits latent infections took place when the T was not suitable for rot development. Once developed the embryo, more than 4-5h of W per day and higher inoculums (104 conidia ml-1) were necessary for rot or latent infection development. The equation of the model obtained with the field data was able to predict the data observed in these experiments. In order to evaluate the effect of inoculum of Monilinia spp. in the incidence of latent infections and of rot of fruits in postharvest, 11 experiments in commercial orchards of peach and nectarine of the Ebro Valley were performed from 2002 to 2005. A positive correlation between the conidial numbers of Monilinia spp. in the surface of the fruits and the incidence of latent infections was observed. Based on those studies other two important recommendations for the agriculturists are deduced: control strategies must consider the latent infections and potential risk based on the T and W. Spores concentration of Monilinia spp. in the surface of fruits must be also taken in concern to reduce the brown rot risk. The knowledge of the population structure of the pathogens determines the bases to establish more effective methods of diseases handling. For that reason in this Thesis the degree of genetic diversity among different M. laxa populations has been studied in different Spanish locations using 144 RAPDs markers (59 polymorphic and 85 monomorphics) on 21 fungal isolates. The analysis of the structure of the population revealed that the genetic diversity within the subpopulations (orchards) (HS) represented 97% of the genetic diversity (HT), whereas the genetic diversity between subpopulations (DST) only represented a 3% of the total of this diversity. The relative magnitude of the genic differentiation between subpopulations (GST) reached 0.032 and the considered number of migrantes by generation (Nm) was of 15.1. The results obtained in dendrograms were in agreement with the analysis of genic diversity. The obtained groupings were independent of the orchard of origin, year or host. In the Thesis the relative importance of the different evolutionary sources in the populations from M. laxa is discussed. Finally a sampling of resistant isolates in different orchards from peach and nectarine of Ebro Valley was made to determine the existence of fungicide resistance of the group of benzimidazoles and the dicarboximidas, fungicides used habitually for the control of rot brown and with high risk of resistance developing in the pathogenic populations. The analysis of 114 isolated ones of M. laxa with the fungicides Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), and Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), showed no resistant in the doses evaluated.

Molécula HLA-G y su importancia en la inmunorregulación de la unidad feto-materna. Aplicaciones en inmunoterapia celular

OBJETIVOS El objetivo principal de esta tesis doctoral consiste en determinar la presencia de la proteína HLA-G en la superficie celular de células madre CD34/CD133, células dendríticas mieloides y plasmacitoides, células dendríticas derivadas de células CD34/CD133 y derivadas de monocitos de sangre de cordón umbilical y sangre periférica materna, por técnicas de citometría de flujo y la expresión de la proteína HLA-G soluble en plasma de sangre de cordón umbilical por técnicas de ELISA. MATERIALES Y METODOS Se obtuvo un total de 35 unidades de sangre de cordón umbilical y 35 muestras de sangre periférica de gestantes a término que acudieron al Servicio de Ginecología y Obstetricia del Hospital Clínico Universitario San Carlos con cesáreas programadas, según aprobación de Comité Ético. Se realizaron técnicas de cultivo celular, citometría de flujo, Elisa y anticuerpos monoclonales, según protocolo, para la obtención de las células madre CD34+, células dendríticas mieloides y plasmacitoides del cordón umbilical y células dendríticas derivadas de células madre CD34+, y determinación de la molécula HLA-G, isoformas, nuevos alelos y polimorfismos...

Efecto del tratamiento con bacilo de calmette-guérin sobre un modelo in vitro 3D de carcinoma escamoso de cabeza y cuello

Tesis inédita presentada en la Universidad Europea de Madrid. Facultad de Ciencias Biomédicas. Programa de Doctorado en Biomedicina y Ciencias de la Salud