Identificação de xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e x. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans através da técnica de pcr

Este trabalho teve por objetivo verificar a viabilidade de utilização da técnica de PCR, usando primers considerados específicos, para identificação de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) e x. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf), visando criar bases para sua utilização em diagnose rotineira e em programas de certificação de sementes. Foram incluídos no estudo 42 isolados da bactéria provenientes de locais distintos, além de outros gêneros, espécies e patovares, para ser verificada a especificidade dos primers. Os resultados obtidos permitem concluir que os primers utilizados são adequados para identificação de Xap e Xapf, embora dois isolados patogênicos não tenham sido amplificados. Foi observada também a amplificação de uma banda fraca para X. axonopodis pv. vitians, com o mesmo número de pares de bases, o que sugere existir homologia entre estes patovares, na região amplificada.

Termoterapia via calor seco no tratamento de sementes de tomate: eficiência na erradicação de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria e efeitos sobre a semente

Sementes infetadas constituem fonte primária de inóculo para epidemias da mancha bacteriana do tomate (Lycopersicon esculentum)que sob condições favoráveis podem resultar em rápido desenvolvimento da doença e severas perdas. O presente trabalho objetivou avaliar a eficiência do tratamento térmico a 70 ºC por 96 h na erradicação de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria de sementes de tomate e seu efeito sobre a qualidade fisiológica e estrutura das sementes, por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Realizaram-se dois ensaios, e utilizando-se sementes inoculadas pelo método a vácuo com o isolado ENA 4463 a 10(7) ufc/ml em NaCl (0,85%). No primeiro ensaio compararam-se quatro tratamentos: sementes inoculadas (1), sementes inoculadas e tratadas a 70 ºC/96 h em estufa com circulação forçada de ar (2), sementes não inoculadas e não tratadas (3) e sementes não inoculadas e tratadas (70 ºC/96 h) (4). No segundo ensaio, apenas os tratamentos (1), (2) e (3) foram comparados. As amostras foram avaliadas quanto à qualidade fisiológica e recuperação da fitobactéria por meio de extração a vácuo seguido de riscagem em meios semi-seletivos, além de observações em MEV. Constatou-se eficiência de 100% e 99,96% na erradicação da bactéria no primeiro e segundo ensaio, respectivamente. Não houve nenhum efeito do tratamento térmico sobre a germinação. Observações ao MEV, revelaram alterações na estrutura superficial das sementes, com remoção, quebra e fusão de tricomas, além de danos à integridade das células bacterianas associadas à superfície do tegumento.

Genetic linkage map of Phaseolus vulgaris and identification of QTLs responsible for resistance to Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

Common bean (Phaseolus vulgaris) cultivars with a high degree of resistance to Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) are not available in Brazil. Despite many studies, a low degree of resistance to Xap continues to exist due to its complex genetic inheritance, which is not well known. The objectives of this research were to complement a common bean genetic map based on the cross between a susceptible genotype 'HAB-52' and a resistant genotype 'BAC-6', and to map and analyze genomic regions (quantitative trait loci – QTLs) related to Xap resistance. Eleven linkage groups were determined using 143 RAPD markers, covering 1,234.5 cM of the genome. This map was used to detect QTLs associated with Xap resistance on leaves and pods. The averages of disease severity on leaves (represented by the transformed disease index – TDI) and pods (represented by the diameter of lesion on pods – DLP) were added to the data of the linkage map. Five TDI QTLs and only one LDP QTL were detected. The TDI QTLs were placed in the A, B, G and J linkage groups, with phenotypic variations ranging from 12.7 to 71.6%. The DLP QTL explained 12.9% of the phenotypic variation and was mapped in a distinct linkage group. These results indicate that there are different genes involved in the control of resistance on leaves and pods.

Componentes da resistência à mancha-bacteriana e crescimento de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, raça T2, em genótipos de tomateiro

Componentes da resistência e crescimento da população bacteriana de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), raça T2, foram quantificados em genótipos de tomateiro (Lycopersicon esculentum) resistentes ('Ohio 8245', 'Agrocica 30' e 'Hawaii 7998') e suscetíveis ('CNPH 401-08'e 'CNPH 416.81.01.02'). A população bacteriana de Xcv evoluiu diferentemente em genótipos resistentes e suscetíveis, atingindo valor até 100 vezes maior no genótipo suscetível 'CNPH 401-08', sete dias após a inoculação. Os componentes de resistência avaliados foram tamanho de lesão, número de lesões, área lesionada e período latente. Os genótipos resistentes e suscetíveis diferiram estatisticamente entre si para todos os componentes avaliados, exceto para o diâmetro da lesão, onde somente o genótipo 'CNPH 416.81.01.02' diferiu dos genótipos resistentes. O período latente foi significativamente diferente em genótipos resistentes e suscetíveis no campo, casa de vegetação e câmara de crescimento, e variou entre seis e 11 dias. Tamanho de lesão não foi um bom indicador para separar genótipos quanto à resistência, por ser um caráter bastante influenciado pelo ambiente. O número de lesões e o período latente apresentaram-se como caracteres fáceis e rápidos de serem avaliados; estes componentes explicam, em grande parte, a resistência observada nos genótipos avaliados pelo sistema de notas.

Molecular characterization of Brazilian strains of Xanthomonas campestris pv. viticola by rep-PCR fingerprinting

Bacterial canker of grapevine (Vitis vinifera), caused by Xanthomonas campestris pv. viticola was first detected in Brazil in 1998, affecting grapevines in the São Francisco river basin, state of Pernambuco. The disease was also reported in Juazeiro, Bahia and later in Piauí and Ceará. Due to its limited geographical distribution and relatively recent detection in Brazil, very little is known about the pathogen's biology and diversity. Repetitive DNA based-PCR (rep-PCR) profiles were generated from purified bacterial DNA of 40 field strains of X. campestris pv. viticola, collected between 1998 and 2001 in the states of Pernambuco, Bahia and Piauí. Combined analysis of the PCR patterns obtained with primers REP, ERIC and BOX, showed a high degree of similarity among Brazilian strains and the Indian type strain NCPPB 2475. Similar genomic patterns with several diagnostic bands, present in all strains, could be detected. Fingerprints were distinct from those of strains representing other pathovars and from a yellow non-pathogenic isolate from grape leaves. The polymorphism observed among the Brazilian strains allowed their separation into five subgroups, although with no correlation with cultivar of origin, geographic location or year collected.

Sobrevivência e viabilidade de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão armazenadas sob condições controladas

O estabelecimento de bancos de sementes para conservação ex situ de germoplasma vegetal é largamente utilizado, mas a contaminação das mesmas por fitopatógenos pode comprometer sua integridade. Este trabalho teve por objetivo monitorar a sobrevivência de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, em um lote de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris) cv. Roxão)submetido a três condições de temperatura, durante 60 meses de armazenamento: -18 e 5 ºC, condições preconizadas para a conservação de material genético vegetal a longo e médio prazo, respectivamente, e à temperatura ambiente (20-30 ºC). A sobrevivência da bactéria foi avaliada pela percentagem de sementes contaminadas e a viabilidade pela manutenção da patogenicidade dos isolados. A população de X. axonopodis pv. phaseoli nas sementes foi quantificada ao final de cinco anos de armazenamento. Os resultados mostraram que a percentagem de sementes contaminadas decresceu de 64 para 36-37% nos primeiros seis meses, para os três tratamentos. A partir de 30 meses observou-se que as sementes conservadas a -18 e 5 ºC apresentaram níveis de contaminação (58 e 72%) que diferiram significativamente das conservadas à temperatura ambiente (20%), e aos 60 meses taxas de 46%, 46% e 8%, respectivamente. A temperatura mais propícia à sobrevivência da bactéria foi 5 ºC em que se encontrou uma população máxima de 1,2 x 10(8) ufc/semente. Constatou-se, igualmente, a manutenção do poder infetivo dos isolados durante todo o armazenamento. Pode-se concluir que as condições ótimas para a conservação de sementes são as mesmas para a manutenção da longevidade de X. axonopodis pv. phaseoli.

Métodos de preservação e crescimento de Xanthomonas campestris pv. viticola em meio de cultura variando temperatura, pH e concentração de NaCl

A bactéria fitopatogênica Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) causa o cancro bacteriano da videira (Vitis vinifera), que ocasiona grandes prejuízos à viticultura no Brasil. Os métodos de dessecação em papel de filtro (DPF), repicagens periódicas (RP), água destilada esterilizada (ADE) e folhas herborizadas (FH) foram utilizados para preservar duas estirpes de Xcv durante 12 meses. As variáveis viabilidade e patogenicidade foram avaliadas mensalmente e estimadas pela obtenção de crescimento bacteriano e área abaixo da curva de incidência da doença (AACID). Tanto o método de DPF como o de ADE propiciaram viabilidade constante de 100% durante 11 meses e os maiores valores de AACID. No método de RP não houve crescimento das estirpes já aos 30 dias, enquanto que, em FH, Xcv foi isolada até cinco meses. o crescimento das estirpes de Xcv em meio de cultura líquido variando temperatura (0, 5, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40 e 45 °C), pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 e 9,0) e concentração de NaCl (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7%) foi avaliado em fotocolorímetro. O crescimento de Xcv foi observado no intervalo de 5 até 35 °C, enquanto que o crescimento ótimo ocorreu de 27 a 29 °C. A Xcv não cresceu a zero e 40 °C. O pH ótimo para o crescimento desta bactéria foi 7,5. O crescimento de Xcv decresceu a partir de 3,0% de NaCl, com concentração letal de 6,0%.

Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão em meio de cultura semi seletivo

Para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em extratos de sementes inteiras e moídas de feijão, naturalmente contaminadas e sadias foram utilizados os meio de cultura semi-seletivos XCP1 e MT e o não seletivo 523 de Kado & Hesket. Os extratos de sementes foram também inoculados em folhas primárias de feijoeiro. O meio de cultura semi-seletivo XCP1 foi o mais eficiente na quantificação e detecção de Xap em extratos de sementes inteiras de feijão. Os extratos de sementes contaminadas, inoculados nas folhas primárias de feijoeiro produziram sintomas do crestamento bacteriano comum.

Natural variability in Arabidopsis thaliana germplasm response to Xanthomonas campestris pv. campestris

This work aimed to study the interaction between the model plant Arabidopsis thaliana and Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), the pathogen responsible for black rot of crucifers. The response of 32 accessions of A. thaliana to the Brazilian isolate of Xcc CNPH 17 was evaluated. No immunity-like response was observed. "CS1308", "CS1566" and "CS1643" grown in continuous light were among the accessions that showed strongest resistance when inoculated with 5 x 10(6) CFU/mL. In contrast, "CS1194" and "CS1492" were among the most susceptible accessions. Similar results were obtained when plants were grown under short-day conditions. To quantify the differences in disease symptoms, total chlorophyll was extracted from contrasting accessions at different time points after inoculation. Chlorophyll levels from controls and Xcc inoculated plants showed a similar reduction in resistant accessions, whereas Xcc-inoculated susceptible accessions showed a greater reduction compared to controls. To test the specificity of resistance, accessions CS1308, CS1566, CS1643 and CS1438 (which showed partial resistance to CNPH 17), were inoculated with a more aggressive isolate of Xcc (CNPH 77) and Ralstonia solanacearum. Among the accessions tested, "CS1566" was the most resistant to Xcc CNPH 77 and also displayed resistance to R. solanacearum. Accessions CS1308, CS1566 and CS1643 were also inoculated with a high titer of Xcc CNPH 17 (5 x 10(8) CFU/mL). No collapse of tissue was observed up to 48 h after inoculation, indicating that a hypersensitive response is not involved in the resistance displayed by these accessions.

Hospedeiros alternativos de Xanthomonas campestris pv. viticola

Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), que causa o cancro bacteriano da videira, sobrevive em plantas infectadas, epifiticamente em órgãos da parte aérea e pode ser veiculada em mudas e/ou bacelos infectados. O trabalho teve como objetivo investigar possíveis hospedeiros alternativos do patógeno, visando fornecer subsídios para o manejo da doença. A partir das plantas invasoras Alternanthera tenella, Amaranthus sp., Glycine sp. e Senna obtusifolia com sintomas similares aos do cancro bacteriano da videira, coletadas em parreirais de Juazeiro e Petrolina, no Submédio São Francisco, foram isoladas bactérias semelhantes a Xcv. No entanto, nenhuma bactéria foi isolada de plantas de Commelina benghalensis e Azadirachta indica com sintomas semelhantes. A patogenicidade dos isolados bacterianos obtidos foi confirmada em plantas de A. tenella, Amaranthus sp., Glycine sp., S. obtusifolia e em mudas de videira cv. Red Globe, em condições de casa de vegetação. As plantas invasoras Chamaesyce hirta, Dactyloctenium aegyptium, Eragrostis pilosa e Pilea sp., inoculadas artificialmente com os isolados Xcv1 e UnB1216, também desenvolveram sintomas típicos do cancro bacteriano.

Development of a molecular method for detection and identification of Xanthomonas campestris pv. viticola

In order to develop a molecular method for detection and identification of Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) the causal agent of grapevine bacterial canker, primers were designed based on the partial sequence of the hrpB gene. Primer pairs Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R, which amplified 243- and 340-bp fragments, respectively, were tested for specificity and sensitivity in detecting DNA from Xcv. Amplification was positive with DNA from 44 Xcv strains and with DNA from four strains of X. campestris pv. mangiferaeindicae and five strains of X. axonopodis pv. passiflorae, with both primer pairs. However, the enzymatic digestion of PCR products could differentiate Xcv strains from the others. None of the primer pairs amplified DNA from grapevine, from 20 strains of nonpathogenic bacteria from grape leaves and 10 strains from six representative genera of plant pathogenic bacteria. Sensitivity of primers Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R was 10 pg and 1 pg of purified Xcv DNA, respectively. Detection limit of primers RST2/Xcv3R was 10(4) CFU/ml, but this limit could be lowered to 10² CFU/ml with a second round of amplification using the internal primer Xcv1F. Presence of Xcv in tissues of grapevine petioles previously inoculated with Xcv could not be detected by PCR using macerated extract added directly in the reaction. However, amplification was positive with the introduction of an agar plating step prior to PCR. Xcv could be detected in 1 µl of the plate wash and from a cell suspension obtained from a single colony. Bacterium identity was confirmed by RFLP analysis of the RST2/Xcv3R amplification products digested with Hae III.

Detecção, transmissão e efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris na qualidade fisiológica de sementes de brócolis

A detecção, a transmissão e o efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) na qualidade fisiológica de sementes de brócolis (Brassica oleracea var. italica) foram avaliadas, a partir de sementes obtidas de plantas ("Baron, Flórida, Hana Midori Sakata, Precoce Piracicaba de Verão, Ramoso Santana e Sabre") inoculadas com a bactéria, em condições de campo. Para a detecção do patógeno nas sementes foram utilizados os meios de cultura semi-seletivos: SX ágar, NSCAA e BSCAA; a taxa de transmissão da bactéria pelas sementes às plântulas foi avaliada usando semeadura em areia e meio de cultura contido em tubo de ensaio. Para a avaliação da qualidade fisiológica das sementes foram realizados o teste padrão de germinação e os testes de vigor: envelhecimento acelerado, índice de velocidade de emergência, crescimento das plântulas e massa seca. De acordo com os resultados, o meio de cultura semi-seletivo NSCAA foi mais eficaz para detectar Xcc em sementes de brócolis; não houve diferença significativa entre os genótipos na taxa de transmissão da bactéria pelas sementes e Xcc não afetou a germinação e o vigor das sementes.

Detecção, transmissão e efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris na qualidade fisiológica de sementes de brócolis

A detecção, a transmissão e o efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) na qualidade fisiológica de sementes de brócolis (Brassica oleracea var. italica) foram avaliados, a partir de sementes obtidas de plantas ("Baron, Flórida, Hana Midori Sakata, Precoce Piracicaba de Verão, Ramoso Santana e Sabre") inoculadas com a bactéria, em condições de campo. Para a detecção do patógeno nas sementes foram utilizados os meios de cultura semi-seletivos: SX ágar, NSCAA e BSCAA; a taxa de transmissão da bactéria pelas sementes às plântulas foi avaliada usando semeadura em areia e meio de cultura contido em tubo de ensaio. Para a avaliação da qualidade fisiológica de sementes foram realizados o teste padrão de germinação e os testes de vigor: envelhecimento acelerado, índice de velocidade de emergência, crescimento de plântulas e massa seca. De acordo com os resultados, o meio de cultura semi-seletivo NSCAA foi mais eficaz para detectar Xcc em sementes de brócolis; não houve diferença significativa entre os genótipos na taxa de transmissão da bactéria pelas sementes e Xcc não afetou a germinação e o vigor das sementes.

Meio semi-seletivo para detectar Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijoeiro e sua erradicação através do tratamento de sementes com o fungicida tolylfluanid

Estudou-se a eficiência do meio semi-seletivo desenvolvido para Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam) do algodoeiro, com algumas modificações, na detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em sementes de feijoeiro, bem como a eficiência do fungicida tolylfluanid na erradicação de Xap através do tratamento de sementes. Foram utilizadas sementes naturalmente infectadas por Xap, procedentes de diferentes municípios do Estado do Paraná. Houve o desenvolvimento de colônias bacterianas ao redor das sementes infectadas sob meio semi-seletivo entre seis e 12 dias de incubação. A freqüência de recuperação de colônias da bactéria em relação ao meio Agar nutriente (AN) variou entre 30 a 112%. O crescimento de Xap foi inibido a concentrações entre 54 a 1500 ppm do fungicida tolylfluanid. A bactéria foi recuperada das sementes não tratadas em meio semi-seletivo, mas não das sementes tratadas em solução do fungicida tolylfluanid (1,20g/L água). Em casa de vegetação, das 400 sementes tratadas com tolylfluanid não foi produzida nenhuma planta com sintomas da doença até 30 dias após a semeadura, enquanto que 9,75% das sementes não tratadas apresentaram sintomas de Xap. Em um outro experimento, das 1200 sementes não tratadas um total de 7,08% e 11,67% das plantas mostraram-se com sintomas da doença, enquanto que das sementes tratadas 0,5% e 2,4% apresentaram sintomas, 26 e 46 dias após a semeadura, respectivamente.

Alterações metabólicas em plantas de feijão originadas de sementes microbiolizadas por Pseudomonas sp. e inoculadas com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

Muitas enzimas estão envolvidas em reações de defesa de plantas contra patógenos. O objetivo deste trabalho foi verificar alterações na atividade de algumas destas enzimas em plantas de feijão originadas de sementes microbiolizadas com um isolado de Pseudomonas do grupo das fluorescentes (isolado DFs842). Sementes de feijão cultivar BRS Valente foram imersas em suspensão salina preparada a partir de crescimento bacteriano com 24 h do isolado de Pseudomonas (OD540=0,5) sabidamente biocontroladora de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Como testemunhas, as sementes foram imersas em solução salina (NaCl 0,85%). Após a microbiolização por 5 h a 10ºC, as sementes foram plantadas em vasos contendo uma mistura de solo não esterilizado, areia e esterco bovino (proporção 3:1:1), mantidos em casa de vegetação. A inoculação do patógeno foi realizada na terceira folha verdadeira de todas as plantas, fazendo-se cortes com tesoura imersa em suspensão salina do patógeno (X. axonopodis pv. phaseoli) preparada a partir de crescimento de 24 h (OD540=0,4). Câmaras úmidas foram mantidas 24 h antes e após a inoculação. Para o preparo do extrato protéico, as três primeiras folhas verdadeiras foram coletadas individualmente em 5 épocas de coleta distintas: uma, momentos antes da inoculação e as demais nos tempos seis, 24, 72 h e 15 dias após a inoculação. Este extrato protéico serviu de fonte para as determinações do teor de proteínas solúveis totais (PST), atividade da polifenol oxidase (PPO) e da peroxidase (PO), as quais foram realizadas por leituras espectrofotométricas. Os resultados demonstraram aumento significativo no teor de PST e na atividade de PPO nas plantas submetidas ao tratamento com isolado DFs842, sendo que, o teor de PST foi o dobro, em relação às plantas não tratadas. Também foi observado que, mesmo antes da inoculação do patógeno o teor de PST e a atividade de PPO nas plantas tratadas estavam bem maiores. Em relação à atividade de PO houve redução da mesma nas plantas tratadas com o isolado de Pseudomonas (DFs842). Esses resultados evidenciaram que a microbiolização das sementes provocou alterações metabólicas nas plantas delas originadas, pelo aumento do teor de PST e atividade de PPO, indicando uma provável participação destas enzimas na indução de resistência ativada pela microbiolização com o isolado de Pseudomonas (DFs842).