Drug-targeting in combined cancer chemotherapy: tumor growth inhibition in mice by association of paclitaxel and etoposide with a cholesterol-rich nanoemulsion

Lipid nanoemulsions (LDE) may be used as carriers of paclitaxel (PTX) and etoposide (ETP) to decrease toxicity and increase the therapeutic action of those drugs. The current study investigates the combined chemotherapy with PTX and ETP associated with LDE. Four groups of 10-20 B16F10 melanoma-bearing mice were treated with LDE-PTX and LDE-ETP in combination (LDE-PTX + ETP), commercial PTX and ETP in combination (PTX + ETP), single LDE-PTX, and single LDE-ETP. PTX and ETX doses were 9 mu mol/kg administered in three intraperitoneal injections on three alternate days. In two control groups mice were treated with saline solution or LDE alone. Tumor growth, metastasis presence, cell-cycle distribution, blood cell counts and histological data were analyzed. Toxicity of all treatments was evaluated in mice without tumors. Tumor growth inhibition was similarly strong in all treatment groups. However, there was a greater reduction in the number of animals bearing metastases in the LDE-PTX + ETP group (30 %) in comparison to the PTX + ETP group (82 %, p < 0.05). Reduction of cellular density, blood vessels and increase of collagen fibers in tumor tissues were observed in the LDE-PTX + ETP group but not in the PTX + ETP group, and in both groups reduced melanoma-related anemia and thrombocytosis were observed. Flow cytometric analysis suggested that LDE-PTX + ETP exhibited greater selectivity to neoplastic cells than PTX-ETP, showing arrest (65 %) in the G(2)/M phase of the cell cycle (p < 0.001). Toxicity manifested by weight loss and myelosuppression was markedly milder in the LDE-PTX + ETP than in the PTX + ETP group. LDE-PTX + ETP combined drug-targeting therapy showed markedly superior anti-cancer properties and reduced toxicity compared to PTX + ETP.

Plasma kinetics of an LDL-like nanoemulsion and lipid transfer to HDL in subjects with glucose intolerance

OBJECTIVE: Glucose intolerance is frequently associated with an altered plasma lipid profile and increased cardiovascular disease risk. Nonetheless, lipid metabolism is scarcely studied in normolipidemic glucose-intolerant patients. The aim of this study was to investigate whether important lipid metabolic parameters, such as the kinetics of LDL free and esterified cholesterol and the transfer of lipids to HDL, are altered in glucose-intolerant patients with normal plasma lipids. METHODS: Fourteen glucose-intolerant patients and 15 control patients were studied; none of the patients had cardiovascular disease manifestations, and they were paired for age, sex, race and co-morbidities. A nanoemulsion resembling a LDL lipid composition (LDE) labeled with C-14-cholesteryl ester and H-3-free cholesterol was intravenously injected, and blood samples were collected over a 24-h period to determine the fractional clearance rate of the labels by compartmental analysis. The transfer of free and esterified cholesterol, triglycerides and phospholipids from the LDE to HDL was measured by the incubation of the LDE with plasma and radioactivity counting of the supernatant after chemical precipitation of non-HDL fractions. RESULTS: The levels of LDL, non-HDL and HDL cholesterol, triglycerides, apo A1 and apo B were equal in both groups. The 14 C-esterified cholesterol fractional clearance rate was not different between glucose-intolerant and control patients, but the H-3-free- cholesterol fractional clearance rate was greater in glucose-intolerant patients than in control patients. The lipid transfer to HDL was equal in both groups. CONCLUSION: In these glucose-intolerant patients with normal plasma lipids, a faster removal of LDE free cholesterol was the only lipid metabolic alteration detected in our study. This finding suggests that the dissociation of free cholesterol from lipoprotein particles occurs in normolipidemic glucose intolerance and may participate in atherogenic signaling.

In Vitro Photodynamic Inactivation of Cryptococcus neoformans Melanized Cells with Chloroaluminum Phthalocyanine Nanoemulsion

The selection of fungi resistant to currently used fungicides and the emergence of new pathogenic species make the development of alternative fungus-control techniques highly desirable. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) is a promising method which combines a nontoxic photosensitizer (PS) with visible light to cause selective killing of microbial cells. The development of PACT to treat mycoses or kill fungi in the environment depends on identifying effective PS for the different pathogenic species and delivery systems able to expand and optimize their use. In the present study, the in vitro susceptibility of Cryptococcus neoformans melanized cells to the photodynamic effects of the PS agent ClAlPc in nanoemulsion (ClAlPc/NE) was examined. Cells were killed in a PS concentration- and light dose-dependent manner. Treatment with ClAlPc/NE, using PS concentrations (e.g. 4.5 mu m) and light doses (e.g. 10 J cm-2) compatible with PACT, resulted in a reduction of up to 6 logs in survival. Washing the cells to remove unbound PS before light exposure did not inhibit fungal photodynamic inactivation. Internalization of ClAlPc by C.neoformans was confirmed by confocal fluorescence microscopy, and the degree of uptake was dependent on PS concentration.

Photodynamic inactivation of biofilms formed by Candida spp., Trichosporon mucoides, and Kodamaea ohmeri by cationic nanoemulsion of zinc 2,9,16,23-tetrakis(phenylthio)-29H, 31H-phthalocyanine (ZnPc)

The biofilms formed by opportunistic yeasts serve as a persistent reservoir of infection and impair the treatment of fungal diseases. The aim of this study was to evaluate photodynamic inactivation (PDI) of biofilms formed by Candida spp. and the emerging pathogens Trichosporon mucoides and Kodamaea ohmeri by a cationic nanoemulsion of zinc 2,9,16,23-tetrakis(phenylthio)-29H,31H-phthalocyanine (ZnPc). Biofilms formed by yeasts after 48 h in the bottom of 96-well microtiter plates were treated with the photosensitizer (ZnPc) and a GaAlAs laser (26.3 J cm(-2)). The biofilm cells were scraped off the well wall, homogenized, and seeded onto Sabouraud dextrose agar plates that were then incubated at 37A degrees C for 48 h. Efficient PDI of biofilms was verified by counting colony-forming units (CFU/ml), and the data were submitted to analysis of variance and the Tukey test (p < 0.05). All biofilms studied were susceptible to PDI with statistically significant differences. The strains of Candida genus were more resistant to PDI than emerging pathogens T. mucoides and K. ohmeri. A mean reduction of 0.45 log was achieved for Candida spp. biofilms, and a reduction of 0.85 and 0.84, were achieved for biofilms formed by T. mucoides and K. ohmeri, respectively. Therefore, PDI by treatment with nanostructured formulations cationic zinc 2,9,16,23- tetrakis (phenylthio)- 29H, 31H- phthalocyanine (ZnPc) and a laser reduced the number of cells in the biofilms formed by strains of C. albicans and non-Candida albicans as well the emerging pathogens T. mucoides and K. ohmeri.

Plasma kinetics of an LDL-like nanoemulsion and lipid transfer to HDL in subjects with glucose intolerance

OBJECTIVE: Glucose intolerance is frequently associated with an altered plasma lipid profile and increased cardiovascular disease risk. Nonetheless, lipid metabolism is scarcely studied in normolipidemic glucose-intolerant patients. The aim of this study was to investigate whether important lipid metabolic parameters, such as the kinetics of LDL free and esterified cholesterol and the transfer of lipids to HDL, are altered in glucose-intolerant patients with normal plasma lipids. METHODS: Fourteen glucose-intolerant patients and 15 control patients were studied; none of the patients had cardiovascular disease manifestations, and they were paired for age, sex, race and co-morbidities. A nanoemulsion resembling a LDL lipid composition (LDE) labeled with 14C-cholesteryl ester and ³H-free cholesterol was intravenously injected, and blood samples were collected over a 24-h period to determine the fractional clearance rate of the labels by compartmental analysis. The transfer of free and esterified cholesterol, triglycerides and phospholipids from the LDE to HDL was measured by the incubation of the LDE with plasma and radioactivity counting of the supernatant after chemical precipitation of non-HDL fractions. RESULTS: The levels of LDL, non-HDL and HDL cholesterol, triglycerides, apo A1 and apo B were equal in both groups. The 14C-esterified cholesterol fractional clearance rate was not different between glucose-intolerant and control patients, but the ³H-free-cholesterol fractional clearance rate was greater in glucose-intolerant patients than in control patients. The lipid transfer to HDL was equal in both groups. CONCLUSION: In these glucose-intolerant patients with normal plasma lipids, a faster removal of LDE free cholesterol was the only lipid metabolic alteration detected in our study. This finding suggests that the dissociation of free cholesterol from lipoprotein particles occurs in normolipidemic glucose intolerance and may participate in atherogenic signaling.

Die kutane murine Mastzelle als Initiator angeborener und adaptiver Immunreaktionen der Haut

Für lange Zeit wurde die Mastzelle nur als Effektorzelle im Rahmen von Erkrankungen des atopischen Formenkreises gesehen. Erst lange Zeit nach ihrer ersten Beschreibung konnte gezeigt werden, dass die Mastzelle einen wichtigen Beitrag zur Abwehr von Pathogenen leistet. Dies wird vor allem durch Wege der alternativen Mastzellaktivierung, z.B. über Toll- like Rezeptoren, ermöglicht. In dieser Arbeit sollte daher zunächst die mögliche Funktion der Mastzelle bei der durch den synthetischen TLR7- Liganden Imiquimod induzierten Entzündungsreaktion der Haut und der Auswanderung von Langerhans Zellen in einem Mausmodell untersucht werden. Beide Reaktion waren dabei von Mastzellen abhängig sind. Für die frühe und schnelle Induktion der Entzündungsreaktion zeigten sich vor allem die Mastzellcytokine IL-1 und TNF-α verantwortlich. Bei der Auswanderung der Langerhans Zellen hingegen spielt das Mastzell-IL1 eine entscheidende Rolle. Imiquimod wurde in Form der Creme Aldara bereits erfolgreich zur transkutanen Immunisierung (TCI) in Mausversuchen verwendet. Da die oben beschriebenen Reaktionen, welche durch Imiquimod vermittelt werden, eine deutliche Abhängigkeit von Mastzellen zeigten, sollte nun auch die Funktion der Mastzelle bei der Entstehung einer adaptiven Immunantwort am Modell der transkutanen Immunisierung untersucht werden. Der Immunisierungserfolg und damit die Entstehung einer adaptiven Immunantwort konnte auch hier auf die Anwesenheit von Mastzellen zurückgeführt werden. Mastzellen können somit als ein weiteres wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität gesehen werden und können so einen entscheidenden Einfluß auf die Entstehung einer adaptiven Immunantwort nehmen.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abhängig. Dazu gehören unter anderen: das ausgewählte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleinsäuren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bezüglich des Applikationsortes repräsentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden können und eine hohe stimulatorische Kapazität besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilität und Translationseffizienz erhöhen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazität in vivo führte. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5’ sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Domäne eines MHC-Klasse-I-Moleküls am 3’ der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Präsentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs führt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabhängigen Weise führt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse befähigt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ‚Priming’ CD8+ T-Zellen in naiven Mäusen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren befähigt eine zytolytische Aktivität gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Darüber hinaus waren wir in der Lage Gedächtnisszellen expandieren zu können. Abschließend konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunität besitzt.

Dalle feste di nozze alle orchestre di stato: Maria Lătărețu e l'invenzione della muzică populară

Le musiche “popolaresche” urbane, in genere trascurate nella letteratura etnomusicologica, sono state quasi completamente ignorate nel caso della Romania. Il presente studio si propone di colmare almeno in parte questa lacuna, indagando questo fenomeno musicale nella Bucarest degli anni Trenta e Quaranta del Novecento. Le musiche esaminate sono tuttavia inserite entro una cornice storica più ampia, che data a partire dalla fine del XVIII secolo, e messe in relazione con alcune produzioni di origine rurale che con queste hanno uno stretto rapporto. Il caso di Maria Lătărețu (1911-1972) si è rivelato particolarmente fecondo in questo senso, dal momento che la cantante apparteneva ad entrambi i versanti musicali, rurale e urbano, e nepadroneggiava con disinvoltura i rispettivi repertori. Dopo il suo trasferimento nella capitale, negli anni Trenta, è diventata una delle figure di maggior spicco di quel fenomeno noto come muzică populară (creazione musicale eminentemente urbana e borghese con radici però nel mondo delle musiche rurali). L’analisi del repertorio (o, per meglio dire, dei due repertori) della Lătărețu, anche nel confronto con repertori limitrofi, ha permesso di comprendere più da vicino alcuni dei meccanismi musicali alla base di questa creazione. Un genere musicale che non nasce dal nulla nel dopo-guerra, ma piuttosto continua una tradizione di musica urbana, caratterizzata in senso locale, ma influenzata dal modello della canzone europea occidentale, che data almeno dagli inizi del Novecento. Attraverso procedimenti in parte già collaudati da compositori colti che sin dal XIX secolo, in Romania come altrove, si erano cimentati con la creazione di melodie in stile popolare o nell’armonizzazione di musiche di provenienza contadina, le melodie rurali nel bagaglio della cantante venivano trasformate in qualcosa di inedito. Una trasformazione che, come viene dimostrato efficacemente nell’ultimo capitolo, non investe solo il livello superficiale, ma coinvolge in modo profondo la sintassi musicale.

Antigenspezifische DNA-Immunisierung in Kombination mit IDO-kodierenden Plasmiden zur Therapie der experimentellen Typ I-Allergie

Derzeit stellt die allergenspezifische Immuntherapie die einzige nicht allein antisymptomatische Behandlungsform zur langfristigen Therapie von Typ I-Allergien dar, welche grundlegende Änderungen im immunologischen Geschehen induziert. Sie ist jedoch verbesserungswürdig in Bezug auf Behandlungsdauer, Erfolgschancen und Nebenwirkungen. Daher wurde in dieser Arbeit eine Strategie zur Therapie von Typ I-Allergien entwickelt und evaluiert, welche auf der Inhibition allergenspezifischer T-Zellen durch Dendritische Zellen (DC), die selektiv nach DNA-Immunisierung sowohl das relevante Allergen als auch Indolamin 2,3-dioxygenase (IDO) konstitutiv produzieren, basiert. IDO ist ein Enzym aus dem Tryptophan-Stoffwechsel, dessen Produktion durch DC einen lokalen immunsuppressiven Mechanismus induziert und in verschiedenen Situationen mit der Induktion peripherer Toleranz assoziiert ist. Zunächst wurden Plasmide hergestellt, die entweder IDO alleine oder IDO zusammen mit dem Antigen unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven CMV- bzw. des DC-spezifischen Fascin-Promotors kodieren. Die Überprüfung der IDO-Expression durch die monocistronischen Plasmide anhand von Transfektionsexperimenten in vitro ergab, dass die IDO-Expression unter der Kontrolle des CMV-Promotors sehr viel stärker ausfiel als unter der Kontrolle des Fascin-Promotors. Nach Transfektion mit den bicistronischen Vektoren, in denen die Transgene für das Antigen und IDO durch eine IRES-Sequenz verbunden waren, war die IDO-Expression jedoch insgesamt sehr schwach. Im Rahmen der Überprüfung der Funktionalität der IDO-Expressionplasmide in vivo unter Verwendung der Genpistole wurden daher lediglich Plasmide getestet, die alleine IDO unter der Kontrolle des CMV-Promotors bzw. des Fascin-Promotors kodieren. Auch in vivo wurde eine stärkere IDO-Expression nach biolistischer Transfektion mit solchen Vektoren beobachtet, in denen der CMV-Promotor zur Expressionskontrolle verwendet wurde. Die Analyse des Einflusses einer Koexpression von IDO auf die durch biolistische Immunisierung mit einem antigenkodierenden Vektor induzierte systemische Immunantwort offenbarte einen inhibitorischer Effekt für den Fall, dass die Antigenproduktion mittels des Fascin-Promotors auf DC fokussiert war und die Expression des koapplizierten IDO-Transgens unter der Kontrolle des CMV-Promotors stand. In diesem Fall wurde eine Reduktion der antigenspezifischen IgG1- und IgG2a-Produktion, eine verringerte Sekretion von IFN-y durch restimulierte Milz- und Lymphknotenzellen sowie eine Reduktion der Zahl antigenspezifischer CD8+ Effektor-T-Zellen nachgewiesen. Im Mausmodell der IgE-vermittelten Typ I-Allergie wurde weiterhin gezeigt, dass nach prophylaktischer biolistischer Vakzinierung unter Verwendung dieser Vektorkombination eine Inhibition der durch die Vakzinierung bedingten antigenspezifischen Th1-Immunantwort ausgelöst wurde. Die Suppression der Th2-Antwort, welche durch Transfektion mit dem Antigenkodierenden Vektor unter Kontrolle des Fascin-Promotors bewirkt wurde, wurde durch Kotransfektion mit den IDO-kodierenden Vektoren aufrecht erhalten.

Predigten für alle Feste des Jahres

von S. Gronemann

Ein Buch für unsere Mütter : Sabbat und Feste im Garten der Kindheit

von S. Müller. Mit 11 Abb. im Text