PGC-1 alfa como regulador inflamatório na esteato-hepatite não-alcoólica

A doença hepática gordurosa não-alcoólica (NAFLD, do inglês) é a manifestação clínica hepática da síndrome metabólica, cuja incidência aumenta consideravelmente em todo o mundo. A NAFLD pode progredir para um estado de esteatohepatite não-alcoólica (NASH, do inglês), caracterizado por inflamação hepatocelular, com ou sem fibrose. Dados na literatura mostram que o coativador-1 alfa do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama (PGC-1alfa), além de estar envolvido em diversos processos metabólicos, representa uma estratégia terapêutica promissora na modulação da inflamação. Neste projeto investigamos as alterações inflamatórias no fígado induzida por dieta hiperlipídica e o papel do PGC-1alfa nesse processo. Camundongos C57black/6 receberam dieta hiperlipídica contendo 30% de gordura por 10 semanas. O peso dos animais foi avaliado semanalmente. Após a eutanásia, o tecido adiposo intra-abdominal (retroperitoneal e periepididimal) foi coletado e pesado. Analisamos o perfil glicêmico e lipídico sérico e expressão de genes envolvidos no metabolismo glicêmico e lipídico. Avaliou-se também o aspecto histológico e a inflamação do tecido hepático por quantificação das citocinas IL-6, TNF-alfa e IL-1beta. A dieta rica em gordura conduziu a um aumento dos depósitos de gordura intra-abdominal, hiperglicemia e hiperlipidemia. Os animais também apresentavam esteatohepatite, com aumento de citocinas pró-inflamatórias e diminuição na expressão de PGC-1alfa no tecido hepático. O envolvimento do PGC-1alfa na produção de mediadores inflamatórios por hepatócitos foi avaliado em células HepG2 utilizando RNA de interferência (RNAi). O knockdown da expressão de PGC-1alfa causou aumento na expressão e liberação de IL-6 em hepatócitos via aumento na fosforilação de IkBalfa e consequente ativação do NFkB. Portanto, nossos dados mostram que o PGC-1alfa inibe a produção de mediadores inflamatórios (IL-6) em hepatócitos, e fornecem novas evidências das conexões existentes entre as vias metabólicas e imunes

Immunomodulatory effects of probiotic bacteria in healthy adults

Probiooteilla kantakohtaisia vaikutuksia ihmisen immuunijärjestelmään terveillä aikuisilla Probiooteilla on kantakohtaisia tulehduksen välittäjäaineita vähentäviä vaikutuksia ja probioottien yhdistelmien vaikutukset eroavat yksittäisten kantojen vaikutuksista selviää TtM Riina Kekkosen tuoreesta väitöstutkimuksesta. TtM Riina Kekkonen on selvittänyt väitöskirjassaan eri probioottikantojen vaikutuksia immuunivasteeseen valkosolumallissa sekä terveillä aikuisilla lumekontrolloiduissa kliinisissä tutkimuksissa. Aikaisemmin probioottien vaikutuksia on tutkittu lähinnä allergian ja erilaisten vatsavaivojen ehkäisyssä ja hoidossa. Probiootteja sisältäviä tuotteita käyttävät kuluttajat ovat kuitenkin useimmiten terveitä aikuisia, ja probioottien vaikutus terveiden aikuisten immuunijärjestelmään on ollut puutteellisesti selvitettyä. Valkosolumallissa probioottikantojen havaittiin poikkeavan toisistaan niiden kyvyssä aktivoida immuunivasteen välittäjäaineiden, sytokiinien, tuotantoa. Anti-inflammatorisia, eli tulehdusta lievittäviä vaikutuksia nähtiin lähinnä Bifidobacterium ja Propionibacterium sukuihin kuuluvilla kannoilla. Streptococcus ja Leuconostoc sukuihin kuuluvat kannat puolestaan aktivoivat Th1 tyyppistä, soluvälitteistä immuunivastetta. Eri probioottien kombinaatiot eivät saaneet aikaan voimakkaampaa aktivaatiota yksittäisiin kantoihin verrattuna, joka viittaa probioottien keskinäiseen kilpailuun niiden ollessa kontaktissa ihmisen solujen kanssa. Probioottikantojen valinta kliinisiin tutkimuksiin tehtiin niiden anti-inflammatoristen ominaisuuksien perusteella. Parhaita anti-inflammatorisia kantoja olivat B. lactis ssp. animalis Bb12 ja P. freudenreichii ssp. shermanii JS, joiden lisäksi tutkimuksiin valittiin myös L. rhamnosus GG (LGG) hyvin tutkittuna referenssikantana. Solutöiden tulokset eivät olleet täysin verrannollisia kliinisen työn tuloksiin, koska LGG näytti omaavan parhaat anti-inflammatoriset ominaisuudet kliinisissä tutkimuksissa vaikka solutyössä sen aikaansaamat vasteet olivat melko vaimeita. Kolmen viikon kliinisessä tutkimuksessa terveillä aikuisilla LGG alensi mm. tulehdusta kuvaavan C-reaktiivisen proteiinin ja inflammatoristen sytokiinien määrää. Pidemmässä kolmen kuukauden pituisessa kliinisessä tutkimuksessa LGG:llä ei ollut vaikutusta terveiden aikuisten infektiosairastavuuteen, mutta LGG lyhensi vatsavaivojen kestoa. Probioottien vaikutukset immuunijärjestelmään näyttävät olevan kantakohtaisia ja erityisesti Lactobacillus rhamnosus GG:llä havaittiin anti-inflammatorisia vaikutuksia. Valkosolumallia ei tulisi käyttää ainoana probioottikantojen skriinausmenetelmänä niiden immunologisia vaikutuksia selvitettäessä, koska solutöiden tulokset eivät olleet täysin verrannollisia kliinisten tutkimusten tuloksiin. Sen sijaan veren perifeeristen lymfosyyttien eristäminen ja niiden aktivoitumisen selvittäminen lyhytaikaisessa kliinisessä tutkimuksessa voisi toimia suhteellisen helppona skiinausmenetelmänä.

The mast cell as a regulator of atherosclerotic plaque stability

Atherosclerosis is an inflammatory disease progressing over years via the accumulation of cholesterol in arterial intima with subsequent formation of atherosclerotic plaques. The stability of a plaque is determined by the size of its cholesterol-rich necrotic lipid core and the thickness of the fibrous cap covering it. The strength and thickness of the cap are maintained by smooth muscle cells and the extracellular matrix produced by them. A plaque with a large lipid core and a thin cap is vulnerable to rupture that may lead to acute atherothrombotic events, such as myocardial infarction and stroke. In addition, endothelial erosion, possibly induced by apoptosis of endothelial cells, may lead to such clinical events. One of the major causes of plaque destabilization is inflammation induced by accumulated and modified lipoproteins, and exacerbated by local aberrant shear stress conditions. Macrophages, T-lymphocytes and mast cells infiltrate particularly into the plaque’s shoulder regions prone to atherothrombotic events, and they are present at the actual sites of plaque rupture and erosion. Two major mechanisms of plaque destabilization induced by inflammation are extracellular matrix remodeling and apoptosis. Mast cells are bone marrow-derived inflammatory cells that as progenitors upon chemotactic stimuli infiltrate the target tissues, such as the arterial wall, differentiate in the target tissues and mediate their effects via the release of various mediators, typically in a process called degranulation. The released preformed mast cell granules contain proteases such as tryptase, chymase and cathepsin G bound to heparin and chondroitin sulfate proteoglycans. In addition, various soluble mediators such as histamine and TNF-alpha are released. Mast cells also synthesize many mediators such as cytokines and lipid mediators upon activation. Mast cells are capable of increasing the level of LDL cholesterol in the arterial intima by increasing accumulation and retention of LDL and by decreasing removal of cholesterol by HDL in vitro. In addition, by secreting proinflammatory mediators and proteases, mast cells may induce plaque destabilization by inducing apoptosis of smooth muscle and endothelial cells. Also in vivo data from apoE-/- and ldlr-/- mice suggest a role for mast cells in the progression of atherosclerosis. Furthermore, mast cell-deficient mice have become powerful tools to study the effects of mast cells in vivo. In this study, evidence suggesting a role for mast cells in the regulation of plaque stability is presented. In a mouse model genetically susceptible to atherosclerosis, mast cell deficiency (ldlr-/-/KitW-sh/W-sh mice) was associated with a less atherogenic lipid profile, a decreased level of lipid accumulation in the aortic arterial wall and a decreased level of vascular inflammation as compared to mast-cell competent littermates. In vitro, mast cell chymase-induced smooth muscle cell apoptosis was mediated by inhibition of NF-kappaB activity, followed by downregulation of bcl-2, release of cytochrome c, and activation of caspase-8, -9 and -3. Mast cell-induced endothelial cell apoptosis was mediated by chymase and TNF-alpha, and involved chymase-mediated degradation of fibronectin and vitronectin, and inactivation of FAK- and Akt-mediated survival signaling. Subsequently, mast cells induced inhibition of NF-kappaB activity and activation of caspase-8 and -9. In addition, possible mast cell protease-mediated mechanisms of endothelial erosion may include degradation of fibronectin and VE-cadherin. Thus, the present results suggest a role for mast cells in destabilization of atherosclerotic plaques.

Noninvasive monitoring of activity in Crohn's disease

Background: The fecal neutrophil-derived proteins calprotectin and lactoferrin have proven useful surrogate markers of intestinal inflammation. The aim of this study was to compare fecal calprotectin and lactoferrin concentrations to clinically, endoscopically, and histologically assessed Crohn’s disease (CD) activity, and to explore the suitability of these proteins as surrogate markers of mucosal healing during anti-TNFα therapy. Furthermore, we studied changes in the number and expression of effector and regulatory T cells in bowel biopsy specimens during anti-TNFα therapy. Patients and methods: Adult CD patients referred for ileocolonoscopy (n=106 for 77 patients) for various reasons were recruited (Study I). Clinical disease activity was assessed with the Crohn’s disease activity index (CDAI) and endoscopic activity with both the Crohn’s disease index of severity (CDEIS) and the simple endoscopic score for Crohn’s disease (SES-CD). Stool samples for measurements of calprotectin and lactoferrin, and blood samples for CRP were collected. For Study II, biopsy specimens were obtained from the ileum and the colon for histologic activity scoring. In prospective Study III, after baseline ileocolonoscopy, 15 patients received induction with anti-TNFα blocking agents and endoscopic, histologic, and fecal-marker responses to therapy were evaluated at 12 weeks. For detecting changes in the number and expression of effector and regulatory T cells, biopsy specimens were taken from the most severely diseased lesions in the ileum and the colon (Study IV). Results: Endoscopic scores correlated significantly with fecal calprotectin and lactoferrin (p<0.001). Both fecal markers were significantly lower in patients with endoscopically inactive than with active disease (p<0.001). In detecting endoscopically active disease, the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) for calprotectin ≥200 μg/g were 70%, 92%, 94%, and 61%; for lactoferrin ≥10 μg/g they were 66%, 92%, 94%, and 59%. Accordingly, the sensitivity, specificity, PPV, and NPV for CRP >5 mg/l were 48%, 91%, 91%, and 48%. Fecal markers were significantly higher in active colonic (both p<0.001) or ileocolonic (calprotectin p=0.028, lactoferrin p=0.004) than in ileal disease. In ileocolonic or colonic disease, colon histology score correlated significantly with fecal calprotectin (r=0.563) and lactoferrin (r=0.543). In patients receiving anti-TNFα therapy, median fecal calprotectin decreased from 1173 μg/g (range 88-15326) to 130 μg/g (13-1419) and lactoferrin from 105.0 μg/g (4.2-1258.9) to 2.7 μg/g (0.0-228.5), both p=0.001. The relation of ileal IL-17+ cells to CD4+ cells decreased significantly during anti-TNF treatment (p=0.047). The relation of IL-17+ cells to Foxp3+ cells was higher in the patients’ baseline specimens than in their post-treatment specimens (p=0.038). Conclusions: For evaluation of CD activity, based on endoscopic findings, more sensitive surrogate markers than CDAI and CRP were fecal calprotectin and lactoferrin. Fecal calprotectin and lactoferrin were significantly higher in endoscopically active disease than in endoscopic remission. In both ileocolonic and colonic disease, fecal markers correlated closely with histologic disease activity. In CD, these neutrophil-derived proteins thus seem to be useful surrogate markers of endoscopic activity. During anti-TNFα therapy, fecal calprotectin and lactoferrin decreased significantly. The anti-TNFα treatment was also reflected in a decreased IL-17/Foxp3 cell ratio, which may indicate improved balance between effector and regulatory T cells with treatment.

Infliximabi-infuusioiden akuuttien haittavaikutusten esto asetyylisalisyylihapolla lapsipotilaiden IBD- ja reumasairauksien hoidossa

IBD- ja reumasairaudet ovat elämänlaatua merkittävästi heikentäviä, kroonisia tulehduksellisia sairauksia, joiden keskivaikeiden ja vakavien muotojen hoidossa suoneen annettava biologinen TNF-alfa -tulehdustekijän vasta-aine infliksimabi (Remicade®) on vankassa asemassa. Infliksimabin hyvän tehon kääntöpuolena esiintyy yleisesti haittoja, joista infuusion aikana tai pian sen jälkeen ilmenevät allergistyyppiset reaktiot ovat hoitoa hankaloittava ja jopa vaarallinen alaluokka. Infuusioreaktioiden estoon ei nykyisellään ole todistettavasti tehokkaita keinoja. Parasetamoli ja setiritsiini osoittautuivat tässä käyttötarkoituksessa tehottomiksi. HUS:n Lasten ja nuorten sairaalassa aloitettiin 11.3.2009 hoitokokeilu asetosalisyylihapolla (ASA, Disperin®), annosteltuna painonmukaisesti per os, päämääränä selvittää prospektiivisesti ASA:n käyttömahdollisuudet infuusioreaktioiden ehkäisyssä. Tämän tutkielman aineisto kerättiin esilääkekokeilun alun ja 24.6.2010 välisellä ajalla (yhteensä 67 viikkoa) infliksimabi-infuusiossa Lasten ja nuorten sairaalan osasto 2:lla käyneiden IBD- ja reumapotilaiden asiakirjoista. Vain 1 (0,2 %) ASA:n kanssa annetuista infuusioista johti infuusioreaktioon kun aiemmin parasetamolin ja setiritsiinin kanssa todettiin 11 (2,9 %) reaktiota. GraphPad Prism 5 -ohjelmistolla tehdyn tilastoanalyysin perusteella tulokset osoittavat ASA:n olevan erittäin lupaava infuusioreaktioiden estolääke.

Efeitos da associação da ovariectomia com uma dieta hiperlipídica sobre alterações no metabolismo lipídico, remodelamento e redistribuição do tecido adiposo e sobre os marcadores inflamatórios em camundongas C57BL/6

A menopausa está associada a algumas alterações metabólicas como a obesidade, dislipidemia e inflamação, entre outras anomalias presentes na síndrome metabólica humana. Uma dieta hiperlipídica ou high-fat (HF) associada à menopausa piora tais alterações, aumentando ainda mais o risco de doença cardiovascular. A hipótese de que uma dieta HF agrava as complicações relacionadas à ovariectomia foi testada. Foram avaliadas fêmeas C57BL/6 ovariectomizadas (OVX) ou com operação SHAM e alimentados com ração padrão ou Standard Chow (SC, 10% de gordura) ou uma dieta HF (60% de gordura) por 18 semanas. A eficiência alimentar (EA), massa corporal (MC), distribuição regional das massas de gordura e a morfometria dos adipócitos foram estudados. As análises de sangue (colesterol total, CT, triglicerídeos, TG, citocinas e adipocinas) foram realizadas. Camundongas OVX-HF apresentaram maior EA e maior MC do que os demais grupos (P<0,05). A gordura visceral (ovariana e retroperitoneal) e a gordura subcutânea (gordura inguinal) tiveram o mesmo padrão de distribuição entre os grupos SHAM-SC, SHAM-HF e OVX-SC, mas o grupo OVX-HF apresentou um padrão diferente de acúmulo de gordura - muito maior do que no rupo SHAM-SC. A associação da ovariectomia com a dieta HF aumentou significativamente o diâmetro dos adipócitos dos animais OVX-HF em comparação aos SHAM-HF (P<0,0001) e também agravou a elevação dos níveis de CT, TG e de leptina nas camundongas OVX-HF, em relação aos OVX-SC (P<0,0001). Os níveis de adiponectina foram maiores nas camundongas OVX-SC comparados com as das camundongas SHAM-SC e OVX-HF (P<0,001). A associação da ovariectomia com a dieta HF agravou o aumento dos níveis séricos de leptina em camundongas OVX-HF, em relação aos OVX-SC (P<0,005). TNF-alfa não foi diferente entre os grupos, mas a IL-6 foi significativamente maior nas camundongas OVX-HF comparados a ambos os grupos SHAM-HF e OVX-SC (P<0,0001). Concluindo, a ingestão de uma dieta hiperlipídica por camundongas ovariectomizadas, leva ao aumento do acúmulo e redistribuição inadequada de gordura, à piora dos níveis de citocinas e adipocinas, assim como à desordem metabólica, o que aumenta os fatores de risco para doenças cardiovasculares.

A atividade da pterocarpanoquinona LQB 118 in vitro e in vivo em Leishmania braziliensis

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-α. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco.

Remodelamento do fígado, pâncreas e tecido adiposo em modelo experimental de síndrome metabólica tratado com telmisartana, sitagliptina e metformina

A intervenção farmacológica pode minimizar ou até mesmo reverter o remodelamento adverso em órgãos num modelo de síndrome metabólica. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das monoterapias e associações medicamentosas sobre a morfologia do tecido adiposo, remodelamento hepático e pancreático em camundongos C57bl/6 alimentados com dieta very high-fat. Camundongos C57bl/6 machos foram alimentados com dieta very high-fat (HF, 60% de lipídios) ou dieta padrão (SC, 10% de lipídios) por 10 semanas, quando foram iniciados os tratamentos: HF-T (HF + Telmisartana, 5.2mg/Kg/dia), HF-S (HF + Sitagliptina, 1.08g/Kg/dia), HF-M (HF + Metformina, 310.0mg/Kg/dia) e as associações medicamentosas HF-TM, HF-TS e HF-SM. Os grupos tratados também tiveram livre acesso à dieta high fat e os tratamentos duraram 6 semanas. Técnicas morfométricas, estereológicas, imunohistoquímicas, ELISA, western blotting e microscopia eletrônica foram utilizadas. A dieta high-fat causou sobrepeso, intolerância oral à glucose, hiperinsulinemia, hipertrofia de ilhotas e adipócitos, grau 2 de esteatose hepatica (<33%) redução da expressão de PPAR-alfa e de GLUT-2, concomitante com aumento da expressão de SREBP-1 no grupo HF (P<0.0001). Por outro lado, todos os tratamentos resultaram em perda de peso significativa, reversão da resistência à insulina, hipertrofia de ilhotas e adipócitos e alívio da esteatose hepática. Somente os grupos HF-T e HF-TS apresentaram massa corporal similar ao grupo SC ao final do experimento, sendo que o ultimo também apresentou reversão da esteatose hepática. O aumento da expressão do PPAR-alfa paralelamente ao decréscimo da expressão do SREBP-1 explica os achados favoráveis para o fígado. A normalização do tamanho do adipócito foi consistente com os níveis maiores de adiponectina e com a redução dos níveis de TNF-alfa (P<0.0001) nos grupos tratados.Todos os tratamentos foram eficazes para controlar a síndrome metabólica. Os melhores resultados foram alcançados com a telmisartana e sitagliptina como monoterapias ou como associação entre essas, combinando a ativação parcial do PPAR-alfa no fígado com a extensão do tempo de ação das incretinas

Estudos dos efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios da própolis sobre as células RAW 264.7 e na resposta inflamatória pulmonar aguda causada pela exposição à fumaça de cigarro em camundongos

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) causa a redução da capacidade respiratória e seu desenvolvimento é associado à fumaça de cigarro. O cigarro possui mais de 4800 substâncias tóxicas e causa a morte de seis milhões de pessoas por ano no mundo. Estudos buscam meios de reverter os males causados pela fumaça de cigarro. A própolis (P) é um produto produzido por abelhas que possui várias propriedades. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos antioxidantes da P em macrófagos murinos e na inflamação pulmonar aguda induzida pela fumaça de cigarro (CS) em camundongos. A análise dos compostos fitoquímicos do extrato alcóolico da P (EAP) foi feita por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS). Células da linhagem RAW 264.7 foram tratadas em diversas concentrações de P durante 24 horas. Após tratamento, as seguintes análises foram realizadas: polifenóis totais; viabilidade celular (MTT); potencial redutor (DPPH); espécies reativas de oxigênio totais (ROS) e de malondialdeído (MDA). Trinta camundongos C57BL/6 foram divididos em 3 grupos (n=10/grupo): Controle+P, CS e CS+P. Ambos os grupos CS foram expostos a 6 cigarros/dia durante 5 dias. O grupo CS foi tratado com veículo. O pulmão e o lavado broncoalveolar (BAL) foram coletados para análise histológica e contagem diferencial de células. As análises para mieloperoxidase (MPO), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), MDA, nitrito e western blotting para TNF-alfa foram realizadas. A análise fitoquímica do EAP mostrou a presença dos ácidos hidrocinâmicos e coumárico, a artepilina C e a drupanina. Foi observado o aumento concentração-dependente dos níveis de polifenóis totais (p<0,001), do MTT (p<0,001) e do DPPH (p<0,001), e o inverso com o MDA (p<0,001). Os níveis de ROS diminuem nas concentrações de 15,6 e 31,2 mg/mL (p<0,05, ambos). A histologia pulmonar do grupo Controle+P foi similar ao do CS+P e foi observado um influxo de macrófagos e neutrófilos no grupo CS (p<0,01 e p<0,001, respectivamente). Os níveis de MPO foram aumentados no grupo CS (526,534,72 mU/mg ptn, p<0,01), mas houve uma redução no grupo CS+P (385,127,64 mU/mg ptn, p<0,05) comparável ao Controle+P (13412,99 mU/mg ptn, p<0,001), o mesmo aconteceu com as enzimas antioxidantes: SOD (Controle+P: 523,529,6 U/mg ptn; CS: 523,529,6 U/mg ptn, p<0,001; CS+P: 246,815,69 U/mg ptn, p<0,001); CAT (Controle+P: 37,383,39 U/mg ptn; CS: 92,686,24 U/mg ptn, p<0,001; CS+P: 59,844,55 U/mg ptn, p<0,05); GPx (Controle+P: 2,230,17 (M/min/mg ptn) x 10-1; CS: 4,510,31 (M/min/mg ptn) x 10-1, p<0,001; CS+P: 2,640,19 (M/min/mg ptn) x 10-1, p<0,05). O inverso ocorreu com a relação GSH/GSSG (Controle+P: 1,0880,17; CS: 0,7360,07, p<0,05; CS+P: 1,2580,10, p<0,05). Os níveis de MDA (Controle+P: 0,2660,05 nMol/mg ptn; CS: 0,940,076 nMol/mg ptn, p<0,001; CS+P: 0,4980,06 nMol/mg ptn, p<0,01) e de nitrito (Controle+P: 50,014,19 Mol/mg ptn; CS: 108,77,73 Mol/mg ptn, p<0,001; CS+P: 58,843,42 nMol/mg ptn, p<0,01) estavam aumentados no CS que em outros grupos. A expressão de TNF-α foi observada no grupo CS. O tratamento da P apresentou ação anti-inflamatória e antioxidante em macrófagos e em camundongos expostos à fumaça de cigarro, possivelmente pela ação dos polifenóis presentes nela

Ciclagem da massa corporal em camundongos

A obesidade está associada com a inflamação crônica atribuída à liberação de citocinas e adipocinas, à homeostase desregulda da glicemia e à dislipidemia. Intervenções nutricionais são frequentemente acompanhadas por episódios repetidos de perda e recuperação do peso, fenômeno conhecido como efeito sanfona ou ciclagem da massa corporal. Foram avaliados os efeitos da ciclagem da massa corporal sobre os parâmetros: eficiência alimentar, massa corporal (MC), perfil lipídico, metabolismo de carboidratos, indíce de adiposidade corporal, marcadores inflamatórios, esteatose hepática e triglicerídeo (TG) hepático em camundongos C57BL/6 machos que ciclaram a massa corporal duas ou três vezes consecutivas pela alternância de dieta hiperlipídica (high-fat, HF) e dieta padrão (standard-chow,SC). Após cada ciclo de dieta HF, os animais ficavam cada vez mais pesados e, após cada ciclo de dieta SC, os animais perdiam cada vez menos peso. A ciclagem da massa corporal provocou flutuação nas reservas de gordura e nos lipídeos sanguíneos. O colesterol total dos animais, após mudança da dieta HF para dieta SC, apresentou redução dos seus valores, assim como os TG plasmáticos. No teste oral de tolerância à glicose, após o perído de ingestão da dieta HF, os animais apresentaram intolerância à glicose e, após a troca para dieta SC, os animais continuaram com intolerância à glicose. Em relação as adipocinas e citocinas, a leptina, resistina e o fator de necrose tumoral (TNF) alfa séricos aumentaram após o ciclo da dieta HF e diminuíram após a troca por dieta SC. Ao contrário, a adiponectina sérica diminuiu após dieta HF e aumentou após troca por dieta SC. A IL-6 aumentou após ingestão da dieta HF, porém após a troca para dieta SC, a IL-6 permaneceu elevada. Enquanto o MCP-1 não variou durante as trocas de dietas. A expressão da adiponectina no tecido adiposo diminuiu após a dieta HF e os valores permaneceram reduzidos mesmo após a troca para dieta SC. As expressões da leptina e IL-6 no tecido adiposo aumentaram após dieta HF e continuaram aumentados mesmo após a troca para dieta SC. Da mesma forma, a esteatose hepática e os TG hepáticos não reduziram após a mudança da dieta HF para dieta SC. Tanto a dieta HF, como a ciclagem da massa corporal são relevantes para o remodelamento do tecido adiposo e provoca repercussões nos lipídios séricos, na homeostase da glicose, na secreção de adipocinas e provoca acúmulo de gordura no fígado. A troca para dieta SC e redução da MC não são capazes de normalizar a secreção de adipocinas no tecido adiposo e nem das citocinas pró-inflamatórias que permaneceram aumentadas. A esteatose hepática e os TG hepáticos também não são recuperados com a troca para dieta SC e redução da massa corporal. Estes resultados indicam que a ciclagem da MC cria um ambiente inflamatório, que é agraado com adipocinas alteradas, intolerância à glicose e acúmulo de gordura no fígado

A ingestão precoce de dieta enriquecida com óleo de peixe reverte alterações bioquímicas, hepáticas e do tecido adiposo na prole de camundongos submetidos à restrição proteica

Ingestão precoce de dieta enriquecida com óleo de peixe reverte alterações bioquímicas, hepáticas e do tecido adiposo na prole de camundongos submetidos à restrição protéica. 2010. 61 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Humana e Experimental) Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010. Estudos relacionam obesidade na vida adulta com baixo peso ao nascer (programação metabólica). O fígado é um dos órgãos mais afetados pela programação. O óleo de peixe é rico em ácidos graxos poli-insaturados (AGP) da família n-3: ácido eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA). O EPA e DHA são relacionados com redução da pressão arterial sistólica e ação anti-inflamatória. Testar a hipótese que a ingestão precoce de óleo de peixe (FO) pode reverter os efeitos deletérios da programação na prole adulta de camundongos. Fêmeas grávidas foram alimentadas com ração padrão (SC) ou dieta restrita em proteínas (LP) durante a gestação e lactação. Ao desmame, os seguintes grupos foram formados (de acordo com a suplementação com FO): SC-SC e SC-FO, LP-SC e LP-FO. Foram aferidas massa corporal, ingestão e eficiência alimentar, pressão arterial sistólica (PAS), insulina plasmática, glicose, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa, colesterol total (CT), triglicerídeos (TG) e alanina aminotransferase (ALT), morfometria dos adipócitos, estereologia do fígado e expressão proteínas SREBP-1c e PPAR-alfa. A prole LP apresentou maior massa corporal, hipercolesterolemia e hiperglicemia Na idade adulta, os animais restritos tornaram-se hipertensos, com esteatose hepática e elevado nível da SREBP-1c. Entretanto, a prole LP com dieta suplementada com FO ocasionou menor ganho e menor massa corporal final. A dieta FO melhorou o metabolismo lipídico, diminuiu a concentração plasmática de CT e TG, reduziu a massa adiposa e o tamanho dos adipócitos. Além disso, LP-FO mostrou níveis reduzidos da ALT, redução da esteatose hepática, baixa expressão da SREBP-1c e aumento da expressão do PPAR-alfa, além de redução da PAS e dos níveis de TNF-alfa. A dieta com FO teve efeitos benéficos revertendo as respostas da programação sobre o metabolismo da glicose e lipídios, estrutura hepática e tecido adiposo na prole adulta programada.

Ação do Glucantime sobre macrófagos de camundongos

Os antimoniais pentavalentes, tais como o Glucantime, são geralmente usados como fármacos de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses, no entanto seu mecanismo de ação não é completamente esclarecido. Atua contra formas amastigotas intracelulares de Leishmania sp, comprometendo o potencial redox levando danos ao DNA do parasito. Alguns trabalhos sugerem que o Glucantime aumenta a capacidade fagocítica e a produção de TNF-alfa por fagócitos. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade do Glucantime modular a atividade do macrófago, a principal célula hospedeira da Leishmania. Inicialmente, a toxicidade do Glucantime foi testada sobre macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, tratando as monocamadas in vitro por 48 horas. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A capacidade do Glucantime (0,1, 1 e 10 mg/ml) modular os macrófagos foi avaliada tratando as monocamadas de macrófagos peritoneais por 24 horas antes da infecção com Leishmania braziliensis. Após 48 horas de incubação com meio de cultura foi avaliado o índice de infecção por contagem. Antes e após a infecção foram analisados a produção de óxido nítrico (NO) pelo método de Griess, espécies reativas de oxigênio (EROS) por fluorimetria usando a sonda H2DCFDA e a produção de citocinas por ELISA. Para avaliar se o Glucantime seria capaz de modular macrófagos in vivo, camundongos suíços foram tratados por 5 dias consecutivos com 8 mg de Glucantime pela via intraperitoneal. Macrófagos peritôneais foram avaliados quanto a sua capacidade de controlar a infecção in vitro com L. braziliensis. Os resultados mostraram que nas concentrações até 10 mg/ml, o Glucantime não alterou a viabilidade dos macrófagos in vitro. O pré-tratamento dos macrófagos com Glucantime nas concentrações de 0.1mg/mL, 1mg/mL e 10mg/mL, foi capaz de reduzir o índice de infecção em 49%, 74% e 85%, respectivamente. Em macrófagos não infectados a produção de NO foi aumentada na concentração de 10mg/ml de Glucantime. O tratamento com 1 e 10 mg/ml de Glucantime foi capaz de aumentar significativamente a produção de EROs (p<0,05 e p<0.01, respectivamente) e a produção IL-12 (p<0,05), mas a IL-10 não foi alterada. Não houve alterações significativas desses parâmetros em relação ao controle após a infecção com L. braziliensis. Os macrófagos oriundos dos animais tratados com Glucantime foram capazes de reduzir o índice de infecção por L. braziliensis (p<0,05). Esses resultados sugerem que o Glucantime é capaz de ativar os macrófagos e esse efeito pode contribuir para o mecanismo de ação desse fármaco.

Perfil de secreção de citocinas e de ativação de células endoteliais após interação com cepas selvagens e mutantes de Aspergillus fumigatus

Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial.

Mães obesas, filhotes obesos: estudo experimental

O aumento da obesidade materna pode refletir em efeitos deletérios na prole adulta, manifestos diferentemente de acordo com o gênero do indivíduo. Este trabalho teve como objetivo verificar a hipótese de que a obesidade materna provoca alterações metabólicas, na estrutura do tecido adiposo e hepático e mudanças de perfil inflamatório nas proles adultas de machos e fêmeas. Fêmeas C57BL/ 6 receberam dieta padrão (SC, 17% da energia proveniente do lipídeo) ou dieta hiperlipídica (HF; 49% da energia proveniente do lipídeo) durante oito semanas pré-gestacionais até a lactação. Após o desmame, os filhotes foram divididos nos grupos: SCM (machos), SCF (fêmeas), HFM (machos) e HFF (fêmeas). As características metabólicas foram avaliadas pela massa corporal (MC), glicemia de jejum, área sob a curva no teste oral de tolerância a glicose; concentrações de triglicerídes (TG) hepáticos e estimativa da esteatose hepática; análise plasmática de insulina, colesterol total (CT), triglicerídes (TG) e adipocinas; distribuição e análise morfológica do tecido adiposo e estado pró-inflamatório dos filhotes. Diferenças entre os grupos foram analisadas pelo Teste T não pareado (dados entre progenitoras e pares de grupos nas proles); one-way ANOVA com pós-teste de Tukey (para proles) e two-way ANOVA (efeito da dieta materna e gênero). O nível de significância adotado foi de P≤0,05. Progenitoras HF tiveram maior MC (+20%), glicemia elevada (+22%) e intolerância à glicose em comparação ao grupo SC. A partir da quarta semana, a MC mostrou-se maior nas proles HF, em ambos os gêneros, quando comparados às proles SC. Na 12 semana, a MC foi 20% maior no grupo HF macho e 30% maior no grupo HF fêmea do que seus controles (p<0,0001, ambos os gêneros). Intolerância à glicose foi observada em machos e fêmeas HF em relação aos seus contrapares SC (+20%, p<0,05). Proles HF demonstraram hepatomegalia com maior acúmulo de TG hepático, resultando em maior percentual de esteatose em machos (27%) e fêmeas HF (25%). Proles HF apresentaram incremento na adiposidade (+20%) e nos níveis de CT e TG do que seus congêneres SC. Níveis plasmáticos de leptina e insulina foram maiores, enquanto houve diminuição da adiponectina no grupo HF macho em relação ao grupo SC macho. Hipertrofia de adipócitos foi observada nas proles HF. TNF-alfa, IL-6 e leptina foram mais expressos em proles HF, porém diminuição na expressão de adiponectina foi evidenciada nas proles geradas por mães obesas. A luz do exposto, a dieta HF administrada em mães antes e durante períodos de gestação e lactação leva à obesidade materna que tem consequências na prole, tais como remodelamento do tecido adiposo, juntamente com alterações bioquímicas e metabólicas dos adipócitos, intensificando o estado pró-inflamatório da prole, em ambos os gêneros, na idade adulta.

Gradiente imunoinflamatório sérico em pacientes com insuficiência cardíaca avançada

Introdução - Diversos estudos têm apontado que uma modulação imunoinflamatória possa desempenhar papel importante na fisiopatologia da insuficiência cardíaca, através da determinação de aumento dos níveis séricos de várias citoquinas em pacientes com a síndrome. No entanto, o sítio da produção aumentada destas moléculas ainda não está claro. Métodos - Foram estudados 18 pacientes com insuficiência cardíaca classe III ou IV com fração de ejecão ≤ 35% (47±11 anos; 14/18 com etiologia não isquêmica) e 7 indivíduos controles (38±9 anos). Foram analisadas as concentrações de TNF-α, seus receptores solúveis I e II, da interleucina 6 e do receptor solúvel da interleucina 2 pelo método de ELISA no sangue periférico e sangue do seio coronário de todos os indivíduos. Resultados - Nos pacientes, as concentrações periféricas do TNF-α, e dos receptores solúveis I e II do TNF-α foram significativamente maiores do que nos indivíduos controles (3,9 ± 2,7 vs. 0,6 ± 1,9 pg/ml, p = 0,009; 1477 ± 489 pg/ml vs. 965 ± 214 pg/ml, p = 0,01; 3149 ± 983 pg/ml vs.1700 ± 526 pg/ml, p = 0,001; respectivamente). Apenas o TNF-α e a interleucina 6 apresentaram maior concentração periférica quando comparada ao sangue do seio coronário (3,9 ± 2,7 vs. 2,7 ± 2,1 pg/ml, p = 0,007 e 4,5 ± 2,8 vs. 3,6 ± 2,8 pg/ml, p = 0,01, respectivamente) em pacientes com insuficiência cardíaca. Além disto, foi observada correlação inversa entre a concentração periférica do TNF-α (r = - 0,5, p = 0,01) e seus receptores solúveis I e II (r = - 0,46, p = 0,02 e r = - 0,59, p = 0,001, respectivamente) e a fração de ejeção, bem como a concentração no seio coronário dos receptores solúveis I e II do TNF-α e a fração de ejeção (r = - 0,46, p= 0,02 e r = - 0,58, p = 0,002, respectivamente). Conclusões - A existência de maiores concentrações de TNF-α e interleucina 6 no sangue periférico do que no seio coronário em pacientes com insuficiência cardíaca sugere que a produção destas citoquinas seja predominantemente periférica. O TNF-α e seus receptores solúveis I e II correlacionaram-se inversamente com a fração de ejeção.