Electrochromic and electrofluorochromic properties of a new boron dipyrromethene–ferrocene conjugate

A new boron dipyrromethene–ferrocene (BODIPY–Fc) conjugate with pentafluorophenyl as the meso substituent and two Fc termini was synthesized and its spectroscopic and electrochemical features were analyzed. An intramolecular charge transfer from the donor Fc to the acceptor BODIPY has been predicted by theory and confirmed experimentally, leading to efficient fluorescence quenching when the dyad is in the neutral state. Fluorescence can be triggered by oxidizing both ferrocenyl units either chemically or electrochemically. Eventually, a fully reversible fluorescence switch is evidenced by coupling TIRF microscopy with electrolysis in an electrochemical cell.

Platelet actin nodules are podosome-like structures dependent on Wiskott-Aldrich syndrome protein and ARP2/3 complex

The actin nodule is a novel F-actin structure present in platelets during early spreading. However, only limited detail is known regarding nodule organization and function. Here we use electron microscopy, SIM and dSTORM super-resolution, and live-cell TIRF microscopy to characterize the structural organization and signalling pathways associated with nodule formation. Nodules are composed of up to four actin-rich structures linked together by actin bundles. They are enriched in the adhesion-related proteins talin and vinculin, have a central core of tyrosine phosphorylated proteins and are depleted of integrins at the plasma membrane. Nodule formation is dependent on Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASp) and the ARP2/3 complex. WASp(-/-) mouse blood displays impaired platelet aggregate formation at arteriolar shear rates. We propose actin nodules are platelet podosome-related structures required for platelet-platelet interaction and their absence contributes to the bleeding diathesis of Wiskott-Aldrich syndrome.

Einzelmolekül-Untersuchungen zu Faltung und Zusammenbau des Lichtsammelkomplexes LHCII

Zusammenfassungrn Der Faltungsprozess des Hauptlichtsammelkomplexes des Photosystems II aus höheren Pflanzen (light harvesting complex II, LHCII) wurde bereits mehrfach untersucht, die Experimente hierzu fanden stets im Ensemble statt. Anhand der bislang veröffentlichten Faltungskinetiken des LHCII aus höheren Pflanzen lassen sich aber keine eindeutigen Aussagen bezüglich der Diversität der Faltungswege treffen. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit Faltungskinetiken einzelner LHCII-Moleküle während der Komplexbildung aufgenommen werden, um weitergehende Informationen zum Faltungsmechanismus zu erhalten und zur Frage, ob hier mehrere unterschiedliche Wege eingeschlagen werden.rnHierfür war zunächst die Etablierung einer Oberflächenimmobilisierung mit Glas als Trägermaterial notwendig. Nachdem Versuche, diese Immobilisierung über einen His6-tag oder über einen heterobifunktionellen Linker zu bewerkstelligen, nicht zum Erfolg geführt haben, konnte eine Immobilisierung des Biotin-markierten Proteins an Oberflächen-gebundenes Avidin erreicht werden. Die Qualität dieser Immobilisierung wurde hierbei sowohl über Bindungsversuche mit fluoreszenzfarbstoffmarkiertem Protein als auch über eine direkte Kontrolle der Oberflächenbeschaffenheit mittels Rasterkraftmikroskopie überprüft. Die für die folgenden Versuche optimale Belegungsdichte wurde im konfokalen Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Zudem wurde sichergestellt, dass die Proteine vereinzelt auf der Oberfläche immobilisiert vorliegen.rnAuf dieser Basis wurden LHCII-Komplexe, die zuvor in vitro rekonstituiert wurden, immobilisiert und Versuche zur kontrollierten Denaturierung unternommen, um Zerfalls-kinetiken im Verfahren der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (total internal reflection fluorescence, TIRF) aufnehmen zu können. Hierbei traten Schwierigkeiten bezüglich der Lebensdauer der Komplexe unter Laser-Belichtung auf, da sich die Löschung der Fluoreszenz durch Zerstrahlung der Pigmente einerseits oder Dissoziation der LHCII andererseits nicht unterscheiden ließen. Auch durch verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Lebensdauer konnte diese nicht in dem Maße gesteigert werden, wie es experimentell notwendig gewesen wäre.rnFür das eigentliche Hauptziel dieser Arbeit – die Aufzeichnung von Einzelmolekül-Faltungskinetiken – war die Entwicklung einer Methode zur Rekonstitution oberflächen-immobilisierter LHCII-Apoproteine notwendig. Dieses Ziel wurde mithilfe einer Detergenzmisch-Rekonstitution erreicht. Der Erfolg der Rekonstitution konnte experimentell sowohl im Fluorimeter anhand des komplexinternen Energietransfers auf einen kovalent an das Protein gebundenen Infrarot-Fluorophor als auch im TIRF-Verfahren direkt beobachtet werden. Auch hier konnte nach ca. 80 Sekunden ein Ausbleichen der Komplexe während der Belichtung durch den Anregungs-Laser beobachtet werden.rnIn Versuchen zur Beobachtung des Komplexbildungsvorganges zeigte sich, dass die Rekonstitution offenbar durch die Belichtung massiv gestört wird. Ein weiteres Problem war eine sehr starke Hintergrundfluoreszenz, ausgelöst durch die zur Rekonstitution notwendige Pigmentlösung, die trotz der TIRF-Anregung von ausschließlich oberflächengebundenem Material die Fluoreszenz der Komplexe überlagerte. Somit konnte die Rekonstitution oberflächenimmobilisierter LHCII-Proteine zwar in Vorher-Nachher-Aufnahmen gezeigt werden, der Faltungsprozess an sich konnte dagegen im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgezeichnet werden.

Structural and kinetic characterization of DNA polymerases I and III from Escherichia coli

DNA elongation is performed by Pol III α subunit in E. coli, stimulated by the association with ε and θ subunits. These three subunits define the DNA Pol III catalytic core. There is controversy about the DNA Pol III assembly for the simultaneous control of lagging and leading strands replication, since some Authors propose a dimeric model with two cores, whereas others have assembled in vitro a trimeric DNA Pol III with a third catalytic core, which increases the efficiency of DNA replication. Moreover, the function of the PHP domain, located at the N-terminus of α subunit, is still unknown. Previous studies hypothesized a possible pyrophosphatase activity, not confirmed yet. The present Thesis highlights by the first time the production in vivo of a trimeric E. coli DNA Pol III by co-expressing α, τ, ε and θ subunits. This trimeric complex has been enzymatically characterized and a molecular model has been proposed, with 2 α subunits sustaining the lagging-strand replication whereas the third core replicates the leading strand. In addition, the pyrophosphatase activity of the PHP domain has been confirmed. This activity involves, at least, the H12 and the D19 residues, whereas the D201 regulates phosphate release. On the other hand, an artificial polymerase (HoLaMa), designed by deleting the exonuclease domain of Klenow Fragment, has been expressed, purified and characterized for a better understanding of bacterial polymerases mechanism. The absence of exonuclease domain impaired enzyme processivity, since this domain is involved in DNA binding. Finally, Klenow enzyme, HoLaMa, α subunit and DNA Pol III αεθ have been characterized at the single-molecule level by FRET analysis, combining ALEX and TIRF microscopy. Fluorescently-labeled DNA molecules were immobilized, and changes in FRET efficiency enabled us to study polymerase binding and DNA polymerization.

Estudio de pre factibilidad para la instalación de una procesadora y exportadora de polvo y goma de tara hacia los mercados brasileño y alemán respectivamente

Trabajo de suficiencia profesional