Rôle des neutrophiles dans l'inflammation allergique associée au souffle chez le cheval, un modèle naturel d'asthme

Réalisé en cotutelle avec le Dr James G Martin de l'Université McGill (Meakins-Christie laboratories)

Modulation de la réponse immunitaire dans le cerveau par la barrière hémato-encéphalique : implication en sclérose en plaques

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration périvasculaire de cellules mononucléaires, telles que les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes B ainsi que les cellules myéloïdes qui comprend les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs). Ce phénomène d’infiltration est dû à une fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’entrée des cellules immunitaires au SNC va mener à la destruction de la gaine de myéline et donc à l’apparition de plaques de démyélinisation. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la migration des divers sous-types de cellules immunitaires du sang périphérique à travers la BHE est contrôlée par des mécanismes moléculaires distincts et spécifiques à chaque type cellulaire. Afin de répondre à cette hypothèse, quatre différentes études ont été mises sur pieds. En premier lieu, nous démontrons un effet bénéfique des statines sur la BHE en SEP, en diminuant la migration des lymphocytes T et des monocytes, et en diminuant la diffusion de marqueurs moléculaire soluble. Ce phénomène s’opère via la suppression du processus d’isoprenylation, et en empêchant probablement la contraction des cellules endothéliales de la BHE. De plus, nous démontrons que les monocytes qui migrent au SNC en condition inflammé sont en mesures de se différencier en DCs et d’induire une réponse inflammatoire de la part des lymphocytes T CD4+. La migration des monocytes à travers la BHE est contrôlée par une nouvelle molécule d’adhérence nommée Ninjurin-1. Le blocage de Ninjurin-1 conduit à une inhibition spécifique de la migration des monocytes in vitro, ainsi qu’à une amélioration des signes cliniques du modèle animal de la SEP, soit l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Finalement, nous démontrons que la migration des lymphocytes T CD8+ au SNC s’effectue via l’intégrine alpha-4. De plus, la majorité des lymphocytes T CD8+ que l’on retrouve dans le liquide céphalo-rachidien de patients SEP, dans le SNC de souris EAE ainsi que dans le SNC de souris infectée au virus de l’hépatite murine portent un phénotype effecteur mémoire. Ces données pourraient expliquer l’émergence de leucoencéphalopathie multifocale progressive observée chez certains patients SEP traités au natalizumab, un anticorps dirigé contre l’intégrine alpha-4. En conclusion, notre étude a permis de démontrer l’importance des monocytes provenant de la périphérie dans le processus inflammatoire prenant part au SNC en SEP. L’inhibition d’entrée de ces cellules pourrait s’avérer bénéfique en SEP tout en permettant l’immuno-surveillance du cerveau, ce que l’anti-alpha-4 intégrine ne permet pas. Les statines pourraient s’avérer une autre option intéressante puisqu’elles agissent sur les processus inflammatoires impliqués dans la SEP.

Évaluation de la capacité de l'estradiol à inhiber l'activation pro-inflammatoire des cellules endothéliales vasculaires induite par la protéine C-réactive

De nombreuses études ont contribué à dévoiler les mécanismes à la base de l’athérosclérose. Cette maladie est médiée par un important déséquilibre homéostatique, qui entraine une inflammation vasculaire contribuant à sa progression. Plusieurs équipes de recherche ont axé leurs investigations sur l’étude d’importants biomarqueurs inflammatoires telle que la protéine C-réactive (CRP). Considérée comme facteur de risque de maladies cardiovasculaires, cette dernière participe aussi aux différents stades du développement de l’athérosclérose. Notre étude révèle pour la toute première fois un processus d’auto-induction de l’expression de la CRP régit par les CE vasculaires. Ce mécanisme représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour la prévention de l’athérosclérose. L’estrogène (E2) est une hormone féminine qui possède un rôle athéroprotecteur via entre autres, la modulation de la réponse inflammatoire. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si elle avait un effet bénéfique sur le profil athérogénique de la CRP exprimée par les cellules endothéliales (CE). En effet, nos travaux ont démontré que l’E2 a la capacité de moduler le rétrocontrôle positif de l’expression de la CRP, contribuant à diminuer également le profil inflammatoire de cette dernière. De plus, nous avons établi que l’E2 restitue une importante voie pro-angiogénique impliquant la réponse migratoire des CE au VEGF, en contrant l’effet d’inhibition de la CRP. Cette nouvelle découverte nous a permis d’éclaircir un important mécanisme de guérison vasculaire de cette hormone dans un contexte inflammatoire. Ainsi, ces données contribuent à mieux comprendre la production endogène de la CRP par les CE vasculaires et l’activité cardioprotectrice de l’E2.

Influence de la taille de départ, de l’état d’agglomération et de la dose de nanoparticules de dioxyde de titane (TiO2) inhalées sur la réponse pulmonaire chez le rat

En raison de leur petite taille, les nanoparticules (NP) (< 100 nm) peuvent coaguler très rapidement ce qui favorise leur pénétration dans l’organisme sous forme d’agglomérats. L’objectif de cette recherche est d’étudier l’influence de l’état d’agglomération de NP de dioxyde de titane (TiO2) de trois tailles de départ différentes, 5, 10-30 ou 50 nm sur la toxicité pulmonaire chez le rat mâle (F344) exposé à des aérosols de 2, 7 ou 20 mg/m3 pendant 6 heures. Dans une chambre d’inhalation, six groupes de rats (n = 6 par groupe) ont été exposés par inhalation aiguë nez-seulement à des aérosols ayant une taille primaire de 5 nm, mais produits sous forme faiblement (< 100 nm) ou fortement (> 100 nm) agglomérée à 2, 7 et 20 mg/m3. De façon similaire, quatre autres groupes de rats ont été exposés à 20 mg/m3 à des aérosols ayant une taille primaire de 10-30 et 50 nm. Les différents aérosols ont été générés par nébulisation à partir de suspensions ou par dispersion à sec. Pour chaque concentration massique, un groupe de rats témoins (n = 6 par groupe) a été exposé à de l’air comprimé dans les mêmes conditions. Les animaux ont été sacrifiés 16 heures après la fin de l’exposition et les lavages broncho-alvéolaires ont permis de doser des marqueurs d’effets inflammatoires, cytotoxiques et de stress oxydant. Des coupes histologiques de poumons ont également été analysées. L’influence de l’état d’agglomération des NP de TiO2 n’a pu être discriminée à 2 mg/m3. Aux concentrations massiques de 7 et 20 mg/m3, nos résultats montrent qu’une réponse inflammatoire aiguë est induite suite à l'exposition aux aérosols fortement agglomérés. En plus de cette réponse, l’exposition aux aérosols faiblement agglomérés à 20 mg/m3 s’est traduite par une augmentation significative de la 8-isoprostane et de la lactate déshydrogénase. À 20 mg/m3, les effets cytotoxiques étaient plus importants suite à l’exposition aux NP de 5 nm faiblement agglomérées. Ces travaux ont montré dans l'ensemble que différents mécanismes de toxicité pulmonaire peuvent être empruntés par les NP de TiO2 en fonction de la taille de départ et de l’état d’agglomération.

Angiopoietine-like 2 : un facteur circulant pro-oxydant et pro-inflammatoire qui contribue au développement de l’athérosclérose

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs.

Caractérisation des processus moléculaires impliqués dans l’activation de la protéine IKKbeta par l'angiotensine II et son rôle dans la réponse phénotypique des CMLV.

Le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) régule l’homéostasie de la contraction des artères. Or, suivant la liaison de l’angiotensine II (Ang II) à son récepteur AT1, le SRAA est également impliqué dans l’activation de voies de signalisation à l’origine de l’inflammation et de l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), soit deux processus participant au remodelage vasculaire caractéristique de diverses maladies cardiovasculaires, telles l’hypertension et l’athérosclérose. Ces pathologies sont les premières causes de mortalité naturelle en Amérique et les traitements les ciblant ne sont pas optimaux puisqu’ils visent seulement quelques facteurs de risque qui leur sont associés. Ainsi, la détermination des effecteurs intracellulaires régulant ces voies délétères est nécessaire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. L’inflammation Ang II-dépendante dans les CMLV est attribuée au facteur de transcription nuclear factor-kappa B (NF-κB). Cependant, les processus moléculaires couplant le récepteur AT1 à son activation sont peu caractérisés. L’étude abordant cette question démontre in vitro que NF-κB est activé par la protéine IκB kinase β (IKKβ) dans les CMLV exposées à l’Ang II et que cette kinase est régulée par deux voies de signalisation indépendantes, mais complémentaires afin d’assurer son activation rigoureuse et soutenue. L’une des voies est précoce et dépend des seconds messagers ainsi que de deux nouveaux effecteurs sous-jacents au récepteur AT1, soit la E3 ligase TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) et la IKK kinase transforming growth factor-beta-activated kinase 1 (TAK1) tandis que la seconde est tardive et résulte de la signalisation mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) - extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) - ribosomal S6 kinase (RSK). L’inhibition conjointe de ces voies abroge complètement la réponse inflammatoire, ce qui indique qu’elles en sont la seule source. Ainsi, l’inhibition d’IKKβ pourrait suffire à contrer l’inflammation impliquée dans le remodelage vasculaire associé à une suractivation du SRAA. Une découverte des plus novatrices découle de cette étude, qui veut que la E3 ligase TRAF6 est un nouvel effecteur des récepteurs couplés aux protéines G et est à l’origine de la formation d’un nouveau type de second messager, soit des chaînes libres de poly-ubiquitines. Les mécanismes moléculaires à la base de l’hypertrophie Ang II-dépendante dans les CMLV sont également peu définis. Or, suivant la parution d’un article démontrant qu’IKKβ dans les cellules cancéreuses participe aux mécanismes d’initiation de la traduction en réponse au facteur de nécrose tumorale α (TNFα) via la phosphorylation de la protéine Tuberous sclerosis 1 (TSC1) et donc l’activation du complexe mammalian target of rapamycin (mTORC1), une hypothèse a été émise selon laquelle cette kinase serait impliquée dans la synthèse protéique Ang II-dépendante dans les CMLV. Les expériences effectuées in vitro dans des CMLV exposées à l’Ang II démontrent qu’IKKβ induit la phosphorylation de TSC1 ainsi que l’activation de mTORC1 et de ses substrats S6 kinase 1 (S6K1) et translational regulators eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein (4E-BP1), deux protéines impliquées directement dans l’hypertrophie. Par ailleurs, la synthèse protéique au niveau des CMLV exposées à l’Ang II est réduite de 75% suivant la diminution de l’expression d’IKKβ et suivant la surexpression d’un mutant de TSC1 dont le site consensus d’IKKβ a été modifié, faisant de cette kinase un médiateur majeur au niveau de ce processus. Ainsi, in vitro IKKβ en réponse à l’Ang II est en amont de deux processus impliqués dans un remodelage vasculaire à l’origine de maladies cardiovasculaires. De plus, plusieurs facteurs de risque de ces pathologies convergent à l’activation d’IKKβ, ce qui en fait une cible thérapeutique particulièrement attrayante. Qui plus est, l’administration d’un inhibiteur d’IKKβ à des rats diminue non seulement la synthèse protéique dépendante de l’Ang II au niveau de l’aorte et des artères mésentériques, mais également la synthèse de la protéine pro-inflammatoire VCAM-1 par les cellules composant l’aorte, ce qui confirme son envergure en tant que cible.

Développement d’un nouveau modèle murin expérimental de sclérodermie

La sclérodermie (SSc) est une maladie rare affectant les personnes génétiquement prédisposées d’une réponse immunitaire défectueuse. Malgré les derniers avancements et développements dans le domaine, l’étiologie et la pathogénèse de la maladie demeurent peu comprises. Par ailleurs, il y a un ralentissement dans la compréhension de cette maladie à cause du manque de modèle animal représentatif de la SSc humaine. Malgré plusieurs lacunes, les souris traitées avec la bléomycine ou portant des modifications génétiques (TSK-1) sont très utilisées dans les études précliniques de la SSc mais elles ne présentent pas toutes les caractéristiques de cette maladie. Pour contribuer à la recherche sur la SSc, la stagiaire postdoctorale Dre Heena Mehta a développé dans le laboratoire du Dre Sarfati en collaboration avec le Dr Senécal, un modèle de souris expérimental induit par l’immunisation de cellules dendritiques (DCs) chargées de peptides de la protéine topoisomérase I (TOPOIA et TOPOIB). Dans le but de caractériser ce modèle murin et d’établir un profil immunitaire, j’ai concentré mes analyses principalement sur les caractéristiques de la SSc telles que la fibrose, l’inflammation, l’hyper-γ-globulinémie polyclonale, la vasculopathie ainsi que de l’expression de cytokines. Brièvement, l’immunisation de souris avec les DCs chargées avec la topoisomérase I (TOPOI) a induit l’inflammation pulmonaire et cutanée, en plus de la fibrose sous forme diffuse (dcSSc). Les souris présentaient également des symptômes de la vasculopathie ainsi que des taux élevés d’anticorps polyclonaux. Les résultats démontraient que les peptides TOPOIA étaient efficaces dans l’induction de la fibrose et de la réponse inflammatoire alors que les peptides TOPOIB étaient surtout impliqués dans la fibrose cutanée. En plus de nos résultats, les observations préliminaires sur le profil de cytokines tissulaires suggéraient que ce modèle pourrait remplacer ou complémenter les autres modèles animaux de SSc.

Développement d’un nouveau modèle murin expérimental de sclérodermie

La sclérodermie (SSc) est une maladie rare affectant les personnes génétiquement prédisposées d’une réponse immunitaire défectueuse. Malgré les derniers avancements et développements dans le domaine, l’étiologie et la pathogénèse de la maladie demeurent peu comprises. Par ailleurs, il y a un ralentissement dans la compréhension de cette maladie à cause du manque de modèle animal représentatif de la SSc humaine. Malgré plusieurs lacunes, les souris traitées avec la bléomycine ou portant des modifications génétiques (TSK-1) sont très utilisées dans les études précliniques de la SSc mais elles ne présentent pas toutes les caractéristiques de cette maladie. Pour contribuer à la recherche sur la SSc, la stagiaire postdoctorale Dre Heena Mehta a développé dans le laboratoire du Dre Sarfati en collaboration avec le Dr Senécal, un modèle de souris expérimental induit par l’immunisation de cellules dendritiques (DCs) chargées de peptides de la protéine topoisomérase I (TOPOIA et TOPOIB). Dans le but de caractériser ce modèle murin et d’établir un profil immunitaire, j’ai concentré mes analyses principalement sur les caractéristiques de la SSc telles que la fibrose, l’inflammation, l’hyper-γ-globulinémie polyclonale, la vasculopathie ainsi que de l’expression de cytokines. Brièvement, l’immunisation de souris avec les DCs chargées avec la topoisomérase I (TOPOI) a induit l’inflammation pulmonaire et cutanée, en plus de la fibrose sous forme diffuse (dcSSc). Les souris présentaient également des symptômes de la vasculopathie ainsi que des taux élevés d’anticorps polyclonaux. Les résultats démontraient que les peptides TOPOIA étaient efficaces dans l’induction de la fibrose et de la réponse inflammatoire alors que les peptides TOPOIB étaient surtout impliqués dans la fibrose cutanée. En plus de nos résultats, les observations préliminaires sur le profil de cytokines tissulaires suggéraient que ce modèle pourrait remplacer ou complémenter les autres modèles animaux de SSc.

Netting neutrophils in skin wounds recruit and activate plasmacytoid dentritic cells

Les mécanismes qui régulent le processus de guérison de la peau lésée ne sont pas entièrement compris. Nous avons précédemment montré que les cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDCs) sont normalement absentes de la peau saine mais infiltrent rapidement la peau humaine ainsi que celle des souris après une blessure cutanée. Après avoir infiltré la peau, ces pDCs sont capables de détecter les acides nucléiques par l'expression des récepteurs de type Toll 7 et 9 ce qui les active à produire de 1' interféron (IFN) de type I. Ce processus est primordial pour la re- épithélisation des blessures cutanées. Cependant, les mécanismes conduisant à l'infiltration et à 1'activation des pDCs restent inconnus. Dans notre projet, nous montrons que la chimiokine CxcllO est responsable de l'infiltration des pDCs. De façon importante, nous démontrons que les neutrophiles qui infiltrent également la peau lésée sont la source majeure de cette chimiokine. La déplétion des neutrophiles abolit d'ailleurs le recrutement des pDCs confirmant ainsi que CxcllO produit par les neutrophiles est responsable de l'infiltration des pDCs dans la peau endommagée. De façon intéressante, nous avons trouvé que CxcllO en plus de son activité chimiotactique, est capable de former des complexes avec l'ADN et d'activer ainsi les pDCs à produire de l'IFN de type I. De plus, nous avons observé que les neutrophiles qui infiltrent la peau forment des Neutrophil Extracellular Traps (NETs). Ces NETs sont constitués de filaments extracellulaires d'ADN recouverts par de nombreuses protéines principalement d'origine granulaire. D'une manière frappante, le blocage de la NETose ou l'utilisation de souris déficientes pour la formation de NETs altère le recrutement et l'activation des pDCs ainsi que la réponse inflammatoire qui en découle ainsi que le processus de re-epithélisation qui s'ensuit. En prenant en compte toutes ces données, nos résultats démontrent que suite à une blessure de la peau, les neutrophiles par la production de CxcllO contrôlent l'infiltration des pDCs dans la peau lésée et par la formation de NETs, promeuvent l'activation des pDCs. Notre étude fournit donc de nouvelles informations sur les mécanismes de guérison de la peau et ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques quant à la réparation tissulaire de la peau soit dans le but de l'amplifier ou de l'inhiber. -- The mechanisms that regulate healing of the injured skin are not well understood. We have previously shown that plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are normally absent from the healthy skin, but rapidly infiltrate both murine and human skin upon injury. Upon skin infiltration, pDCs sense nucleic acids via TLR7/TLR9 and are activated to produce type I interferon (IFN), a process that is crucial for re-epithelialisation of skin wounds. However, the mechanisms that drive pDCs recruitment and activation in injured skin remain unclear. We show that CxcllO is responsible for pDCs infiltration. Importantly, we demonstrate that skin infiltrating neutrophils are the major source of this chemokine. Neutrophils depletion completely abrogated pDCs recruitment confirming that CxcllO- driven pDCs recruitment is controlled by neutrophils. Interestingly, CxcllO was also found to form complexes with DNA and to activate pDCs to produce Type I IFN in addition to its chemotactic activity. Moreover, we observed that infiltrating neutrophils release Neutrophils Extracellular Traps (NETs) composed of DNA filaments decorated with neutrophils-derived proteins. Strikingly, blocking NETosis or using mice deficient for NETs production impaired pDCs recruitment and activation as well as the subsequent inflammatory response and the re-epithelialisation process. Altogether, these data demonstrate that upon skin injury, neutrophils control pDCs infiltration into the injured skin by the release of CxcllO and via the production of NETs, they allow complex formation between CxcllO and NET-DNA leading to pDCs activation. Our findings provide new insights into the mechanisms of wound healing and open new avenues for potential therapeutic interventions to boost or inhibit wound repair in the skin.

Mécanismes de défense immunitaire innée impliqués dans l’hépatite aiguë induite par le virus de l’hépatite murine de type 3

Le virus de l’hépatite murine de type 3 (MHV3) est un excellent modèle animal pour l’étude des différents désordres immunologiques lors d’infections virales. L’hépatite aiguë fulminante induite par ce virus chez la souris susceptible C57BL/6 se caractérise par la présence de plusieurs foyers nécrotiques et inflammatoires dans le foie associée à une immunodéficience en lymphocytes B et T, tuant les souris entre 3 et 5 jours post-infection. L’évolution rapide de cette maladie virale suggère un débalancement dans les mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T et un bris de l’équilibre entre la tolérance hépatique et la réponse inflammatoire. Afin d’élucider les rôles respectifs des différents mécanismes de la défense innée impliqués dans le développement de l’hépatite aiguë, des infections in vivo ont été réalisées chez des souris C57BL/6 avec la souche pathogène L2-MHV3 ou avec des variants du virus MHV3. Ces derniers possèdent des tropismes différents pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques et les cellules de Kupffer, tels que les virus faiblement atténué 51.6-MHV3, fortement atténué CL12-MHV3 et non pathogène YAC-MHV3. Ces études in vivo ont montré une diminution des cellules NK spléniques et myéloïdes suite à une infection avec le virus MHV3. Cette chute en cellules NK spléniques reflète un recrutement de ces cellules au niveau du foie. Par contre, les cellules NK se sont avérées permissives à la réplication virale entraînant un processus d’apoptose suite à la formation de syncétia induits par le virus. Les niveaux de recrutement et d’apoptose des cellules NK et NK-T dans le foie reflètent la pathogénicité des variants MHV3 durant les trois premiers jours de l’infection virale bien que les cellules NK recrutées au niveau du foie maintiennent leur activité cytotoxique. L’ajout des IL-12 et IL-18, qui sont normalement diminués lors de l’hépatite aiguë, provoque une production synergique d’IFN-g par les cellules NK, résultant d’une interaction entre l’activation de la voie p38 MAPK et la réplication virale. Par ailleurs, le récepteur viral CEACAM1a (carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1a) serait essentiel à cette synergie, mais exercerait aussi une action inhibitrice dans la production de l’IFN-g. D’autre part, les niveaux de production des cytokines immunosuppressives IL-10, TGF-b et PGE2, impliquées dans la tolérance hépatique et particulièrement produites par les cellules de Kupffer et les cellules endothéliales sinusoïdales, sont en relation inverse avec le degré de pathogénicité des variants du virus MHV3. Finalement, le virus pathogène L2-MHV3 déclenche la production de cytokines inflammatoires par les macrophages, tels que l’IL-6 et le TNF-a. L’induction de ces cytokines par les macrophages serait indépendante de la présence de la molécule CEACAM1a. Cette stimulation est plutôt reliée à la fixation des particules virales sur des récepteurs TLR2, en association avec les régions riches en héparanes sulfates. Tous ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels le virus MHV3 peut diminuer l’efficacité des mécanismes de l’immunité naturelle sous le contrôle des cellules NK et NK-T intrahépatiques, suite à une stimulation de l’inflammation résultant du bris de la tolérance hépatique.

Étude du rôle des gènes TGF-β1 et HSP-70 lors du processus de régénération du membre chez l’axolotl

Les urodèles amphibiens, dont fait partie l’axolotl (Ambystoma mexicanum), ont la capacité de régénérer leurs organes et membres suite à une amputation, tout au long de leur vie. La patte est l’organe dont le processus de régénération est le mieux caractérisé et ce dernier est divisé en deux phases principales. La première est la phase de préparation et commence immédiatement suite à l’amputation. Elle renferme des étapes essentielles au processus de régénération comme la guérison de la plaie et la formation d’une coiffe apicale ectodermique. Par la suite, les fibroblastes du derme et certaines cellules musculaires vont revenir à un état pluripotent via un processus appelé dédifférenciation cellulaire. Une fois dédifférenciées, ces cellules migrent et s’accumulent sous la coiffe apicale pour former le blastème. Lors de la phase de redéveloppement, les cellules du blastème se divisent puis se redifférencient pour régénérer la partie amputée. Fait intéressant, la régénération d’un membre ou la guérison d’une plaie chez l’axolotl ne mène jamais à la formation d’une cicatrice. Afin d’en apprendre plus sur le contrôle moléculaire de la régénération, les gènes Heat-shock protein-70 (Hsp-70) et Transforming growth factor-β1 (Tgf-β1) ont été sélectionnés. Ces gènes jouent un rôle important dans la réponse au stress et lors de la guérison des plaies chez les mammifères. HSP-70 est une chaperonne moléculaire qui est produite pour maintenir l’intégrité des protéines cellulaires lorsqu’un stress se présente. TGF-β1 est une cytokine produite suite à une blessure qui active la réponse inflammatoire et qui stimule la fermeture de la plaie chez les amniotes. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que Hsp-70 est exprimé et régulé lors du développement et de la régénération du membre chez l’axolotl. D’autre part, nos expériences ont mené à l’isolation de la séquence codante pour Tgf-β1 chez l’axolotl. Nos résultats montrent que Tgf-β1 est exprimé spécifiquement lors de la phase de préparation dans le membre en régénération. De plus, le blocage de la voie des Tgf-β avec l’inhibiteur pharmacologique SB-431542, lors de la régénération, mène à l’inhibition du processus. Ceci démontre que la signalisation via la voie des Tgf-β est essentielle à la régénération du membre chez l’axolotl.

Implication des canaux K+ dans les processus de réparation de l’épithélium respiratoire sain et fibrose kystique

La pathologie de la fibrose kystique (FK) est causée par des mutations du gène codant pour le canal Cl- CFTR. Au niveau respiratoire, cette dysfonction du transport transépithélial de Cl- occasionne une altération de la composition et du volume du liquide de surface des voies aériennes. Une accumulation de mucus déshydraté favorise alors la colonisation bactérienne et une réponse inflammatoire chronique, entraînant des lésions épithéliales sévères au niveau des voies aériennes et des alvéoles pouvant culminer en défaillance respiratoire. Le principal objectif de mon projet de maîtrise était d’étudier les processus de réparation de l’épithélium alvéolaire sain, l’épithélium bronchique sain et FK à l’aide d’un modèle in vitro de plaies mécaniques. Nos résultats démontrent la présence d’une boucle autocrine EGF/EGFR contrôlant les processus de migration cellulaire et de réparation des lésions mécaniques. D’autre part, nos expériences montrent que l’EGF stimule l’activité et l’expression des canaux K+ KATP, KvLQT1 et KCa3.1 des cellules épithéliales respiratoires. L’activation de ces canaux est cruciale pour les processus de réparation puisque la majeure partie de la réparation stimulée à l’EGF est abolie en présence d’inhibiteurs de ces canaux. Nous avons également observé que les cellules FK présentent un délai de réparation, probablement causé par un défaut de la réponse EGF/EGFR et une activité/expression réduite des canaux K+. Nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation des processus de réparation de l’épithélium sain et FK. De plus, ils ouvrent de nouvelles options thérapeutiques visant à promouvoir, à l’aide d’activateurs de canaux K+ et de facteurs de croissance, la régénération de l’épithélium respiratoire chez les patients atteints de FK.

Synthèse d'une librairie d'analogues monomériques et dimériques du sLe X

Dans cet ouvrage sera décrite la synthèse de nouveaux analogues du sialyl Lewis X (sLex). A cet effet, nous avons préparé une librairie d’analogues synthétisée à partir d’une approche mettant en jeu un «espaceur» acyclique permettant d’avoir un biais conformationnel que nous avons défini comme la stratégie ATC-B. Nous avions déjà démontré que certains analogues portant un groupe benzoate en C-2 et en C-4 du galactose présentent une activité 50 fois supérieure à celle du sLex. Nous avions par ailleurs démontré qu’en l’absence du benzoate en C-2, l’activité devient alors trois fois plus faible. A présent, il paraissait interessant de synthétiser des analogues ayant seulement un groupe benzoate en C-4 pour evaluer l’impact de ce groupement sur la puissance de nos analogues. Par le passé, nous avions également mis en évidence le rôle des esters sur l’activité des analogues portant un «espaceur» acyclique dans le cadre de la stratégie ATC-B. Nous effectuerons donc des variations à ce niveau pour en évaluer l’impact. Enfin, nous avons préparé une nouvelle famille d’analogues de type dimère. Ceux-ci seront constitués de 2 unités des composés monomériques synthétisés précédemment. La synthèse de ces dimères fera l’emploi de la «Click Chemistry». Cette étude nous mènera a vous présenter la synthèse de ces composés et la méthodologie employée.

Étude de la régulation du facteur de transcription NF-kB dans l'infection par le RSV

L’infection par le Virus Respiratoire Syncytial cause des affections pulmonaires aiguës en pédiatrie caractérisée par une réponse inflammatoire excessive médiée par la production de cytokines par les cellules épithéliales des voies aériennes. Les gènes codant pour ces cytokines sont régulés par le facteur de transcription NF-κB (p50/p65) dont l’activation est classiquement induite par la phosphorylation de son inhibiteur IκBα, ce qui permet l’accumulation de l’hétérodimère au noyau. Par contre, nous avons récemment identifié la phosphorylation en sérine 536 de la sous-unité p65 comme une autre étape essentielle à son activation lors de l’infection des AEC par RSV. Le travail présenté dans ce mémoire a permis de démontrer que l’inhibition de l’expression de RIG-I, de Cardif ou de TRAF6, 3 protéines impliquées dans la reconnaissance cellulaire des virus, conduit à l’inhibition de cette phosphorylation en réponse à RSV. Nous avons également établi à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’ARNi que, parmi les diverses kinases connues pour phosphoryler p65 en réponse à divers stimulus, IKKα/β sont essentielles à cette phosphorylation lors d’une stimulation par RSV. Puisque TRAF6 est bien connu dans la littérature pour activer le complexe IKK, nous proposons que TRAF6, après reconnaissance de l’ARN viral de RSV par RIG-I, active le complexe IKK qui induit la phosphorylation de la sousunité p65 de NF-κB, permettant l’expression de gènes cibles. D’autre part, nous avions précédemment démontré que Nox2, un isoforme de NADPH oxydase, contrôle l’activation de NF-κB en régulant les phosphorylations de IκBα et p65. Nous montrons ici que l’inhibition de Nox2 réduit fortement l’activité du complexe kinase IKK. De plus, la présence au niveau basal de Nox2 est critique pour le niveau d’ARN messager de Cardif. Nous proposons donc que la régulation de la phosphorylation de p65 en ser536 par Nox2 soit via son effet sur Cardif en permettant la fonctionnalité de la voie RIG-I.

Le récepteur CD36 : implication dans le développement de l'athérosclérose et dans le recrutement des leucocytes aux sites inflammatoires

Le CD36 est un récepteur éboueur de classe B exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages et les cellules endothéliales de la microvasculature. Le CD36 présente une haute affinité de liaison pour les ligands lipidiques tels que les lipoprotéines oxydées de basse densité (LDLox). De part sa capacité à internaliser les LDLox au niveau des macrophages et de son implication dans la formation des cellules spumeuses, le CD36 joue un rôle critique dans le développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique sélectif du CD36, exerce des effets anti-athérosclérotiques chez les souris déficientes en apolipoprotéine E. Un traitement prolongé (12 semaines) avec le EP 80317 réduit fortement (de 51%) la surface des lésions athérosclérotiques par comparaison aux souris témoins. L'effet anti-athérosclérotique est associé à une diminution des taux de cholestérol plasmatique, à une réduction de l’internalisation des LDLox au niveau des macrophages et à une augmentation de l’expression des protéines impliquées dans le transport inverse du cholestérol. De plus, un traitement par le EP 80317 est également associé une diminution de l’expression aortique et plasmatique de protéines pro-inflammatoires. Nos études ont aussi montré un rôle pour le CD36 dans le recrutement des phagocytes mononucléés au niveau des lésions athérosclérotiques, tel que démontré par une réduction de l’accumulation des phagocytes mononucléés radiomarqués CD36–/– par rapport aux cellules CD36+/+. À l’échelle moléculaire, nous avons montré que les phospholipides oxydés induisent la phosphorylation de la kinase Pyk2 des podosomes des monocytes/macrophages de manière dépendante de l’expression du CD36 et de Src. Cette phosphorylation est atténuée par un traitement par le EP80317. Nos résultats appuient le rôle important du CD36 dans l’athérosclérose et suggèrent que les ligands synthétiques qui modulent la fonction du CD36 représentent potentiellement une nouvelle classe d'agents anti-athérosclérotiques. Le CD36 exprimé par les cellules endothéliales de la microvasculature est un récepteur de l’hétérodimère protéique S100A8/A9. Ces protéines s’associent à l’acide arachidonique intracellulaire (AA) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) et le complexe S100A8/A9/AA peut être sécrété par les PMN activés au contact de l’endothélium. Nous avons vérifié l’hypothèse selon laquelle le CD36 exprimé par la microvasculature est impliqué dans le métabolisme transcellulaire de l’AA par la liaison du complexe S100A8/A9/AA et la réponse inflammatoire. Chez deux modèles murins d'inflammation aiguë (ischémie/reperfusion des membres inférieurs et poche d’air dorsale), nous avons observé que la réponse inflammatoire, notamment l’accumulation des PMN au niveau des sites inflammatoires, est diminuée en moyenne de 63% chez les souris CD36-/-. De même, un traitement par le EP 80317 ou par les anticorps anti-S100A8/A9 diminue chacun de 60% en moyenne l’extravasation des PMN vers les tissus inflammatoires. L’administration simultanée des deux traitements n’a aucun effet supplémentaire, et ces traitements n’exercent aucun effet chez les souris CD36-/-. Nos résultats appuient le rôle du récepteur CD36 de la microvasculature dans la régulation de la réponse inflammatoire. L’utilisation des ligands synthétiques du CD36 pourrait représenter une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement des réponses inflammatoires aiguës.