Étude de l’implication de la force du signal transmis par le récepteur des cellules T dans le développement et la survie des lymphocytes T mémoires

Suite à la rencontre d’un antigène (Ag) présenté à la surface des cellules présentatrice de l’Ag (CPA), les lymphocytes T naïfs, ayant un récepteur des cellules T (RCT) spécifique de l’Ag, vont proliférer et se différencier en LT effecteurs (1). Suite à l’élimination de l’Ag la majorité des LTe vont mourir par apoptose alors que les restants vont se différencier en LT mémoire (LTm) protégeant l’organisme à long terme. Les mécanismes qui permettent la différenciation des LTe en LTm sont encore inconnus. Pour comprendre comment les LTm CD8+ sont générés à partir des LTe, nous avons émis l’hypothèse que la densité de l’Ag présenté par les CPA peut avoir un impact sur la sélection des LT CD8+ répondant l’Ag à se différencier en LTm. De manière intéressante, nos résultats montrent qu’une immunisation avec des cellules dendritiques (DCs) exprimant un haut niveau de complexe CMH/peptide à sa surface permet le développement de LTm. À l’inverse, le développement des LTm est fortement réduit (10-20X) lorsque les souris sont immunisées avec des DCs exprimant un niveau faible de complexes CMH/peptide à leur surface. De plus, la quantité d’Ag n’a aucune influence ni sur l’expansion des LT CD8+ ni sur l’acquisition de leurs fonctions effectrices, mais affecte de manière critique la génération des LTm. Nos résultats suggèrent que le nombre de RCT engagé lors de la reconnaissance de l’Ag est important pour la formation des LTm. Pour cela nous avons observé par vidéo-microscopie le temps d’interaction entre des LTn et des DCs. Nos résultats montrent que le temps et la qualité de l’interaction sont dépendants de la densité d’Ag présenté par les DCs. Effectivement, nous observons une diminution dans le pourcentage de LT faisant une interaction prolongée avec les DCs quand le niveau d’Ag est faible. De plus, nous observons des variations de l’expression des facteurs de transcription clefs impliqués dans la différenciation des LTm tels qu’Eomes, Bcl-6 et Blimp-1. Par ailleurs, la densité d’Ag fait varier l’expression du Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor-1). Nor-1 est impliqué dans la conversion de Bcl-2 en molécule pro-apoptotique et contribue à la mort par apoptose des LTe pendant la phase de contraction. Notre modèle propose que la densité de l’épitope contrôle la génération des CD8+ LTm. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la génération des LTm permettra le développement de meilleures stratégies pour la génération de vaccin. Dans un second temps, nous avons évalué le rôle du signal RCT dans l’homéostasie des LTm. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de souris transgénique pour le RCT dont son expression peut être modulée par un traitement à la tétracycline. Ce système nous a permis d’abolir l’expression du RCT à la surface des LTm. De manière intéressante, en absence de RCT exprimé, les LTm CD8+ peuvent survivre à long terme dans l’organisme et rester fonctionnels. De plus, une sous population des LTm CD4+ a la capacité de survivre sans RCT exprimé dans un hôte lymphopénique alors que l’autre sous population nécessite l’expression du RCT.

Troubles du rythme cardiaque dans les modèles murins transgéniques

Thèse en cotutelle avec Université de Nantes - Pays de La Loire - France (2005-2010)

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 in human disease

Les maladies cardiovasculaires (MCV) demeurent au tournant de ce siècle la principale cause de mortalité dans le monde. Parmi les facteurs de risque, l’hypercholestérolémie et l’obésité abdominale sont directement liées au développement précoce de l’athérosclérose. L’hypercholestérolémie familiale, communément associée à une déficience des récepteurs des lipoprotéines de basse densité (LDLR), est connue comme cause de maladie précoce d’athérosclérose et de calcification aortique chez l’humain. La subtilisine convertase proprotéine/kexine du type 9 (PCSK9), membre de la famille des proprotéines convertases, est trouvée indirectement associée aux MCV par son implication dans la dégradation du LDLR. Chez l'humain, des mutations du gène PCSK9 conduisent soit à une hypercholestérolémie familiale, soit à une hypocholestérolémie, selon que la mutation entraîne un gain ou une perte de fonction, respectivement. Il demeure incertain si les individus porteurs de mutations causant un gain de fonction de la PCSK9 développeront une calcification aortique ou si des mutations entraînant une perte de fonction provoqueront une obésité abdominale. Dans cette étude, nous avons examiné : 1) l’effet d’une surexpression de PCSK9 dans le foie de souris sur la calcification aortique ; 2) les conséquences d’une déficience en PCSK9 (Pcsk9 KO), mimant une inhibition pharmacologique, sur le tissu graisseux. Nous avons utilisé un modèle de souris transgénique (Tg) surexprimant le cDNA de PCSK9 de souris dans les hépatocytes de souris et démontrons par tomographie calculée qu’une calcification survient de façon moins étendue chez les souris PCSK9 Tg que chez les souris déficientes en LDLR. Alors que le PCSK9 Tg et la déficience en LDLR causaient tous deux une hypercholestérolémie familiale, les niveaux seuls de cholestérol circulant ne parvenaient pas à prédire le degré de calcification aortique. Dans une seconde étude, nous utilisions des souris génétiquement manipulées dépourvues de PSCK9 et démontrons que l’accumulation de graisses viscérales (adipogenèse) apparaît régulée par la PCSK9 circulante. Ainsi, en l’absence de PCSK9, l’adipogenèse viscérale augmente vraisemblablement par régulation post-traductionnelle des récepteurs à lipoprotéines de très basse densité (VLDLR) dans le tissu adipeux. Ces deux modèles mettent en évidence un équilibre dynamique de la PCSK9 dans des voies métaboliques différentes, réalisant un élément clé dans la santé cardiovasculaire. Par conséquent, les essais d’investigations et d’altérations biologiques de la PCSK9 devraient être pris en compte dans un modèle animal valide utilisant une méthode sensible et en portant une attention prudente aux effets secondaires de toute intervention.

Étude de la fonction et de la régulation homéostatique des lymphocytes T extrathymiques

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude de la fonction du promoteur foetal A[gamma] dans la régulation de la commutation de l'hémoglobine foetale à adulte

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) : étude de mécanismes impliqués dans la phase exsudative

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) se développe suite à une atteinte pulmonaire lésionnelle, induisant un œdème et une inflammation excessive, généralement suivis d’une réparation atypique menant à la fibrose. Malgré de signifiants progrès dans les traitements, la mortalité reste élevée : ~ 40 %. Mon hypothèse de travail est que l’atténuation de l’œdème ou de la réponse inflammatoire pourrait freiner le développement ou la sévérité de la phase exsudative. Nous avons évalué cette hypothèse à l’aide d’un modèle de phase exsudative du SDRA, i.e. instillation intra-trachéale de bléomycine, chez les souris.  La modulation des fluides alvéolaires est étudiée avec des souris transgénique (Tg) pour le canal ENaC, qui sont sensibles à la formation d’un œdème. Cependant, ces souris Tg ne sont pas plus sensibles au développement de la phase exsudative en condition lésionnelle (bléomycine). Nous avons déterminé par une étude électrophysiologique des cellules épithéliales alvéolaires de type II (AT II) que ce n’est pas lié à une inhibition par la bléomycine de la fonction du canal ENaC.  Le traitement de la réponse inflammatoire associée au SDRA par des glucocorticoïdes est une thérapie potentielle mais controversée. Les glucocorticoïdes dans notre modèle murin ne réduisent pas la sévérité des lésions. Nous avons pu déterminé lors d’expériences in vitro que ce serait dû à une réduction de la capacité de réparation des AT II. En résumé :  La modulation du canal ENaC ne modifie pas le développement de la phase exsudative, suggérant que la régulation de l’œdème n’est pas suffisante pour modifier l’évolution du SDRA.  La modulation de l’inflammation par les glucocorticoïdes est ineffective, possiblement à cause d’une altération de la réparation. Mon étude suggère que le traitement de la phase exsudative du SDRA est complexe. En effet, la régulation de l’œdème ou de l’inflammation de façon isolée ne peut pas modifier l’évolution du SDRA. L'hétérogénéité des sources du SDRA et la redondance des mécanismes cellulaires impliqués dans l’évolution des lésions pulmonaires suggèrent que le traitement nécessitera une approche visant plusieurs cibles mécanistiques afin d’en accélérer la résolution.

Rôle du facteur de transcription BP1 dans la régulation des gènes du locus humain de beta-globine

Le facteur de transcription BP1 humain est exprimé dans les cellules érythroïdes pendant le développement fœtal mais son niveau d’expression est réduit au stade adulte. Les études antérieures in vitro ont montré que BP1 est un répresseur du gène adulte de β-globine mais sa fonction dans la régulation des gènes ε et γ n’a pas été abordée à ce jour. Dans notre étude, nos analyses de BP1 humain ont été menées in vivo au stade embryonnaire en utilisant une lignée de souris transgénique surexprimant BP1 dans les cellules érythroïdes définitives murines. Au niveau protéique, BP1 humain est exprimé aux âges E12.5 et E13.5 dans les cellules érythroïdes fœtales des embryons transgéniques. Toutefois, les niveaux de BP1 humain ne perturbent pas l’érythropoïèse définitive fœtale: les embryons transgéniques ne sont pas anémiques et ne meurent pas in utero. La surexpression de BP1 humain altère tout de même le niveau endogène des facteurs de transcription Ikaros et SOX6 impliqués dans la régulation des gènes de β-globine durant l’érythropoïèse définitive fœtale murine. Chez les embryons doubles transgéniques exprimant BP1 et les gènes humains de β-globine à E12.5, l’expression du gène adulte β est réduite alors que celle des gènes ε et γ est non réprimée. Les mesures d’expression des gènes humains de β-globine effectuées en absence d’Ikaros à E12.5 précisent le rôle de BP1 humain dans l’activation du gène embryonnaire ε. Dans les cellules érythroïdes fœtales murines dépourvues d’Ikaros à E12.5, BP1 humain augmente grandement l’expression des facteurs de transcription EKLF et BCL11A et semble déréprimer l’expression de SOX6, ce qui conduit à une répression des gènes fœtaux et une activation du gène adulte β au jour embryonnaire murin suivant. Puisque BP1 atténue l’altération de l’expression des gènes fœtaux et adultes causée par l’absence d’Ikaros, nous proposons que BP1 et Ikaros soient liés dans les mécanismes de transcription des gènes humains de β-globine.

Function of the immunoregulatory CD4-CD8- T cells in the context of autoimmune diabetes

La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun.

Les cytokines inflammatoires modulent la prolifération et la différenciation in vitro des cellules souches/progénitrices de la moelle épinière.

La moelle épinière (MÉ) est essentielle pour relier les informations motrices et sensorielles entre le cerveau et la périphérie. Malheureusement, elle peut facilement être endommagée suite à un traumatisme médullaire (TM) ou des pathologies comme la sclérose en plaques. Chez les vertébrés inférieurs, tels les amphibiens, la MÉ lésée se régénère via ses cellules souches endogènes, alors que celle des mammifères démontre une très faible habileté régénératrice post-traumatique. Des travaux récents ont démontré que la MÉ des mammifères contient des cellules souches neurales latentes correspondant aux cellules épendymaires du canal central. D’autres études ont prouvé qu’à la suite d’un TM, les cellules souches épendymaires (cSÉ) prolifèrent, migrent vers le site de la lésion et se différencient principalement en cellules gliales. Promouvoir la régénération de la MÉ endommagée via la modulation des cellules souches endogènes devient donc une voie thérapeutique intéressante. Isolant des cellules souches/progénitrices de la MÉ via la culture de neurosphères (NS), nos études in vitro, en présence de cytokines inflammatoires ou de milieu conditionné auxmacrophages, suggèrent que la réponse inflammatoire influence fortement la prolifération et la différentiation des cSÉ. Dans l’objectif de définir le programme génétique relié à l’activation des cSÉ de la MÉ, nous avons débuté l’élaboration d’un protocole d’isolement des cSÉ à l’aide d’un modèle de souris transgénique.

Impact d’un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions sur le développement des interneurones corticaux : rôle de l’adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)

L’encéphalopathie hypoxique-­‐ischémique cause des milliers de victimes à travers le monde chaque année. Les enfants survivants à un épisode hypoxique-­‐ischémique sont à risque de développer des problèmes neurologiques incapacitants comme une paralysie cérébrale, un retard mental, une épilepsie ou des troubles d’ordre comportemental. Les modèles animaux ont amélioré nos connaissances sur les mécanismes sous-­‐jacents aux dommages cérébraux, mais elles sont encore trop incomplètes pour être capables de prévenir les problèmes neurologiques. Ce projet vise à comprendre l’impact d’un épisode asphyxique périnatale associé à des convulsions ainsi que l’activation de l’adenosine monophosphate-­‐activated protein kinase (AMPK) sur les circuits GABAergiques inhibiteurs en développement chez la souris. Dans le but d’investiguer le sort des neurones inhibiteurs, appelés interneurones, suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions avec des animaux transgéniques, nous avons pris avantage d’un nouveau modèle d’hypoxie permettant d’induire des convulsions chez la souris. Deux populations d’interneurones représentant ensemble environ 60% de tous les interneurones corticaux ont été étudiées, soit les cellules exprimant la parvalbumine (PV) et les cellules exprimant la somatostatine (SOM). L’étude stéréologique n’a montré aucune mort neuronale de ces deux populations d’interneurones dans l’hippocampe chez les souris hypoxique d’âge adulte. Par contre, le cortex des souris hypoxiques présentait des zones complètement ou fortement dépourvues de cellules PV alors que les cellules SOM n’étaient pas affectées. L’utilisation d’une lignée de souris transgénique exprimant une protéine verte fluorescente (GFP) dans les cellules PV nous a permis de comprendre que les trous PV sont le reflet de deux choses : 1) une diminution des cellules PV et 2) une immaturité des cellules PV restantes. Puisque les cellules PV sont spécifiquement affectées dans la première partie de notre étude, nous avons voulu étudier les mécanismes moléculaires sous-­‐jacents à cette vulnérabilité. L’AMPK est un senseur d’énergie qui orchestre le rétablissement des i niveaux d’énergie cellulaire dans le cas d’une déplétion énergétique en modulant des voies de signalisation impliquant la synthèse de protéines et l’excitabilité membranaire. Il est possible que l’activation d’AMPK suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions soit néfaste à long-­‐terme pour le circuit GABAergique en développement et modifie l’établissement de l’innervation périsomatique d’une cellule PV sur les cellules pyramidales. Nous avons étudié cette hypothèse dans un modèle de culture organotypique en surexprimant la forme wild-­‐type (WT) de la sous-­‐unité α2 d’AMPK, ainsi qu’une forme mutée dominante négative (DN), dans des cellules PV individuelles. Nous avons montré que pendant la phase de formation synaptique (jours post-­‐natals équivalents EP 10-­‐18), la surexpression de la forme WT désorganise la stabilisation des synapses. De plus, l’abolition de l’activité d’AMPK semble augmenter le nombre de synapses périsomatiques faits par la cellule PV sur les cellules pyramidales pendant la phase de formation et semble avoir l’effet inverse pendant la phase de maturation (EP 16-­‐24). La neurotransmission GABAergique joue plusieurs rôles dans le cerveau, depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte des interneurones, et une dysfonction des interneurones a été associée à plusieurs troubles neurologiques, comme la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La maturation des circuits GABAergiques se fait majoritairement pendant la période post-­‐natale et est hautement dépendante de l’activité neuronale et de l’expérience sensorielle. Nos résultats révèlent que le lourd fardeau en demande énergétique d’un épisode asphyxique périnatal peut causer une mort neuronale sélective des cellules PV et compromettre l’intégrité de leur maturation. Un des mécanismes sous-­‐ jacents possible à cette immaturité des cellules PV suite à l’épisode hypoxique est l’activation d’AMPK, en désorganisant leur profil d’innervation sur les cellules pyramidales. Nous pensons que ces changements dans le réseau GABAergique pourrait contribuer aux problèmes neurologiques associés à une insulte hypoxique.

Caractérisation du rôle de MCAM dans la sclérose en plaques

Objectifs: Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), des lymphocytes pro-inflammatoires utilisent des molécules d’adhérence afin de parvenir à traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et former des lésions multifocales dans le système nerveux central (SNC). Dans le contexte de la SEP, les lymphocytes CD4 auto-agressifs polarisés en TH17 (sécrétant de l’IL-17) sont reconnus comme contribuant à la formation des lésions. Le rôle des lymphocytes CD8 TC17 est quant à lui encore mal défini. L’identification de marqueurs de surface spécifiquement exprimés par les lymphocytes TH17 et TC17 faciliterait la caractérisation de ces sous-populations pathogéniques et fournirait de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la SEP. Méthodologie: Nous avons identifié MCAM lors d’analyses protéomiques de cellules endothéliales de la BHE humaine et de lymphocytes T humains. Nous avons caractérisé le phénotype et la fonction de ces cellules exprimant MCAM ex vivo, in vitro, in situ et in vivo, à partir de matériel obtenu de témoins (contrôles), de patients atteints de SEP et d’animaux atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Résultats: MCAM est exprimé à la fois par les cellules endothéliales de la BHE humaine et par une sous-population de lymphocytes T effecteurs mémoire CD161+ et CCR6+. Les lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ expriment plus d’IL-17, IL-22, GM-CSF et granzyme B (Gz B) que les lymphocytes MCAMneg. De plus, l’expression de MCAM est fortement augmentée à la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ lors des poussées de SEP, alors que les traitements immunomodulateurs en diminuent l’expression. In situ, l’expression de MCAM par les cellules endothéliales de la BHE est plus marquée au site des lésions de SEP et d’EAE, et on retrouve des lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ au sein de ces infiltrats périvasculaires du SNC. In vitro, les lymphocytes CD8 MCAM+ causent plus de mort oligodendrocytaire et bloquer MCAM diminue la transmigration des CD8 TC17 et des CD4 TH17 à travers les cellules endothéliales de la BHE humaine. In vivo, dépléter les lymphocytes CD4 ou CD8 MCAM+ améliore les signes cliniques de l’EAE par transfert. Par ailleurs, l’expression de MCAM est régulée à la hausse à la surface des lymphocytes CD4 et CD8 de la souris transgénique TCR1640, un modèle animal d’EAE spontanée. Finalement, bloquer MCAM atténue les déficits neurologiques chroniques aussi bien du modèle d’EAE induite avec le MOG35-55 que du modèle d’EAE spontanée. Conclusion: Nos données démontrent que les lymphocytes encéphalitogéniques produisant de l’IL-17 et présentant une capacité effectrice et migratoire marquée expriment MCAM. MCAM pourrait servir de biomarqueur en SEP et constituer une cible thérapeutique valable pour traiter les conditions neuroinflammatoires.

Découverte de cellules souches potentielles de l’épithélium thymique

Le thymus subit un vieillissement précoce, appelé involution thymique, qui cause une perte de fonction du thymus avec l’âge. À ce jour, les mécanismes de renouvellement des cellules épithéliales thymiques (TECs) sont encore mal compris, c’est pourquoi nous avons voulu identifier les cellules souches de l’épithélium thymique. Comme les cellules souches sont quiescentes dans plusieurs tissus, les objectifs de notre étude étaient de déterminer si l’épithélium thymique contenait des cellules quiescentes et d’étudier la cinétique de prolifération des TECs chez les souris jeunes et adultes. Pour ce faire, nous avons utilisé une souris transgénique (H2B-GFP Tet-On) nous permettant d’identifier les cellules ne se divisant pas sur une longue période de temps (LRC, label-retaining cells¬). Nous avons d’abord montré que les TECs proliféraient plus rapidement chez les femelles que les mâles. De plus, nous avons trouvé plusieurs différences entre l’épithélium thymique post-natal et adulte : (1) les TECs corticales (cTECs) et médullaires (mTECs) ont un taux de prolifération similaire chez les jeunes souris, mais chez l’adulte, les cTECs prolifèrent plus lentement que les mTECs; (2) les TECs prolifèrent plus rapidement chez les souris jeunes que adultes; (3) des LRC sont détectées chez l’adulte, mais pas chez les jeunes souris. Les LRC, retrouvées dans le compartiment cTEC, sous-expriment des gènes associés à la sénescence et surexpriment des gènes importants pour le développement et le renouvellement des TECs. Ces résultats montrent que ces cellules sont quiescentes et suggèrent qu’elles pourraient bel et bien être les progéniteurs thymiques responsables du renouvellement des TECs adultes.

Rôle de la tolérance centrale et périphérique des lymphocytes T autoréactifs dans deux nouveaux modèles murins double transgéniques

Les maladies autoimmunes sont des affections chroniques, le plus souvent invalidantes, qui touchent plus de 5% de la population dans les pays développés. L’autoimmunité résulte de la rupture des mécanismes de tolérance du système immunitaire vis-à-vis des autoantigènes exprimés par les tissus de l’organisme, entraînant la destruction d’un ou de plusieurs organes-cibles par les lymphocytes T et/ou B. L’hépatite autoimmune et le diabète autoimmun se caractérisent par la destruction sélective des hépatocytes et des cellules beta pancréatiques, respectivement. De plus en plus d’arguments suggèrent une implication des lymphocytes T CD8+ dans le déclenchement, la progression et la régulation des réponses associées à plusieurs maladies autoimmunes. Dans ce projet, nous avons suivi l’évolution de clones de lymphocytes T CD8+ spécifiques à un antigène particulier dont le site d’expression différait. Pour ce faire, nous avons développé deux nouveaux modèles murins double transgéniques par croisement entre une lignée de souris exprimant un TCR transgénique spécifique à la nucléoprotéine (NP) du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), et une souris exprimant cette NP-LCMV : 1) uniquement dans les hépatocytes (modèle d’hépatite autoimmune), ou 2) simultanément dans le thymus et le pancréas (modèle de diabète autoimmun). L’avidité fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP chez les souris TCR transgéniques était inversement proportionnelle au niveau d’expression du TCR. Le répertoire lymphocytaire dans le thymus, la rate, les ganglions et le sang périphérique a été caractérisé pour chacune des lignées de souris double transgéniques, de même que la capacité fonctionnelle et le phénotype (marqueurs d’activation/mémoire) des lymphocytes T CD8+ autoréactifs. Chacun des deux nouveaux modèles présentés dans cette étude ont montré que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP sont aptes à briser la tolérance centrale et périphérique et à provoquer une réaction d’autoimmunité spontanée. Dans le modèle d’hépatite autoimmune, où l’expression de l’autoantigène était restreinte au foie, la surexpression du TCR transgénique a entraîné une délétion thymique quasi-totale des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP prévenant le développement d’une hépatite spontanée. alors qu’un niveau de TCR comparable à celui d’une souris de type sauvage a permis une sélection positive des lymphocytes autoréactifs qui se sont accumulés dans le foie où ils se sont activés pour provoquer une hépatite autoimmune spontanée. Dans le modèle de diabète autoimmun, où l’autoantigène était exprimé dans le pancréas et le thymus, les souris des deux lignées double transgéniques ont montré une délétion thymique partielle, peu importe le niveau d’expression du TCR. Seuls les mâles adultes développaient un diabète spontané et une partie de leurs lymphocytes T CD8+ exprimaient une combinaison particulière de marqueurs d’activation/mémoire (CD44, CD122, PD-1). Cette population lymphocytaire était absente chez les souris femelles et les mâles sains. L’étude de la tolérance des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans nos deux nouveaux modèles murins double transgéniques a permis d’identifier des mécanismes alternatifs possiblement impliqués dans la tolérance et l’activation, et de mieux comprendre le rôle des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans le processus autoimmun menant à l’hépatite autoimmune et au diabète autoimmun. Ces découvertes seront utiles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les lymphocytes T CD8+ autoréactifs.

Characterization of polycystin-1 in ADPKD pathogenetic mechanism : biogenesis and functional implications by genetic approaches in mouse

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide.

L'expression de nestine est associée à l'entrée des cardiomyocytes de rats néonataux dans le cycle cellulaire.

L’infarctus du myocarde est une des conséquences possibles de l’ischémie cardiaque; il se traduit par la mort des cardiomyocytes se situant en aval du blocus coronaire, puis par la formation d’une cicatrice formée essentiellement de dépôts de matrices extracellulaires sécrétées par les myofibroblastes. Nestine est une protéine filamenteuse intermédiaire de classe VI couramment associée à la prolifération et à la migration cellulaire. Chez l’homme et les rongeurs, à la suite d’un infarctus du myocarde, une sous-population de cardiomyocytes localisée à la zone infarcie/péri-infarcie exprimait la forme striée de nestine. Le but principal de cette étude était de déterminer la source cellulaire des cardiomyocytes nestine (+) observée dans le cœur infarci ainsi que le mécanisme de signalisation cellulaire sous-jacent impliqué dans l’expression de nestine. L’utilisation de souris transgénique a révélé que l’augmentation des cardiomyocytes nestine (+) dans le cœur infarci des souris n’était pas attribuable à la différenciation de cellules souches/progénitrices nestine (+) en cardiomyocytes nestine (+). Le traitement des cardiomyocytes ventriculaires de rats néonataux avec l’activateur des protéines kinases C PDBu et l’inhibition concomitante des voies p38 MAPK a mené à l’augmentation du nombre de ces cellules exprimant nestine. De plus, une population importante de cardiomyocytes ventriculaires de rats néonataux a incorporé la bromodéxoxyuridine, signe d’une capacité à réentrer dans le cycle cellulaire et à synthétiser de l’ADN. Sur la base de ces observations, l’apparition de cardiomyocytes nestine (+) dans le cœur infarci des rongeurs et des hommes pourrait possiblement refléter une sous-population de cardiomyocytes en prolifération tentant de régénérer le cœur infarci.