Aspectos comparativos das luciferases pH-insensitivas de Pyrearinus termitilluminans (Coleoptera: Elateridae) e Phrixotrix spp (Coleoptera: Phengodidae): expressão, purificação e propriedades do sítio ativo

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) - IBRC

Viabilidade e fertilidade de sêmen ovino criopreservado com glicerol e dimetilacetamida acrescido de trealose EDTA

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Inseminação artificial com sêmen congelado em cães

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Principais marcadores utilizados na avaliação da qualidade do sêmen de animais domésticos

Methods of semen cryopreservation allow changes in spermatic cells, such as damage in plasma and acrossomal membrane and modifications in mitochondrial function due to a disorder in the lipidic bilayer. For effective oocyte fertilization, spermatozoa require functional competent membranes, and intact organelles, acrosome and DNA. However, most laboratory methods used to evaluate semen quality are not highly correlated with fertilizing capacity. The discovery of a variety of fluorochromes and compounds conjugated to fluorescent probes has enabled an accurate assessment of the viability, integrity and function of spermatozoa. Among the most used probes that label the various compartments of the sperm cell there are the membrane impermeable fluorescent dyes to test the membrane integrity, as well as acylated dyes that pass the intact membrane. For the acrossomal integrity the most commonly used method is lectins labeled by a fluorescent probe. The acrosome reaction and spermatic capacitation is detected by the evaluation of membrane architecture and disorder of lipids in plasma membrane. Mitochondrial function can be determined using markers for their aerobic activity. The DNA status of spermatozoa has been determined using the metachromatic properties of Acridine Orange, and the DNA fragmentation can also be assessed by TUNEL assay. Finally, DNA condensation is analyzed using a single cell DNA gel electrophoresis assay that indicates DNA compactation. This monograph aims to compile the various tests used to detect damaged spermatozoa under cryopreservation methods, searching for improve the predictive value of semen analysis with the intention of a successful conception

Utilização do choque osmótico na avaliação da viabilidade de sêmen criopreservado de ovinos

This study evaluated the use of hipoosmotic swelling test (HOST) with deionized water (0 mOsmol), as a method of post thaw ram semen evaluation and correlate their findings with different techniques of semen evaluation. Therefore, twenty semen samples of 20 different adult rams were assessed as for kinetic sperm parameters through computerized system (IVOS 12, Hamiton Thorn Biosciences, Beverly, MA, EUA) and subjective analysis. The sperm membranes viability was carried out by the association of fluorescent probes (propidium iodide, JC-1 and FITC-PSA). The structural integrity of the plasma membrane was also studied through supravital test with eosin and the functional integrity of membrane evaluated by doing the hipoosmotic swelling test with deionized water (0 mOsmol), in the following proportions: One part of semen for 10 (HOST 10), 50 (HOST 50) and 100 (HOST 100) parts of water. After semen dilution in the different proportions it was fixed in formalin-buffered saline and analyzed with regard to percentage of HOST reactive sperm (bent/coiled). The percentage of reaction obtained for HOST 10 (33,1%); HOST 50 (32,8%) and HOST 100 (31,8%) did not differ significantly. HOST 10 presented positive correlation with the plasma membrane integrity by the EOS (r = 0,80; p < 0,05). Positive correlations between HOST 50 and HOST 100 with sperm subpopulation with membrane integrity by fluorescence were observed (r = 0,83 and r = 0,85; p < 0,01). The findings suggest that the HOST with deionized water can provide additional information for post thawing ram sperm viability evaluation.

Estudio de la estabilidad genética asociada a los procesos de crioconservación de ápices de menta

La crioconservación se ha descrito como una técnica de conservación ex situ a largo plazo que ha sido aplicada con éxito a numerosas especies, y resulta especialmente importante en aquellas con propagación vegetativa, infértiles o amenazadas, en las que sistemas de conservación ex situ más sencillos, como los bancos de semillas, no son posibles. También presenta ventajas frente a la conservación in vitro, ya que logra disminuir o eliminar problemas como la excesiva manipulación del material, evitando los subcultivos periódicos y disminuyendo así el riesgo de contaminaciones y de aparición de variación somaclonal. Sin embargo, someter al material vegetal a los procedimientos que implica la crioconservación provoca distintos estreses. Entre ellos, el estrés oxidativo puede potencialmente producir daños en membranas, proteínas, carbohidratos y en el ADN. En este trabajo se han evaluado diversos sistemas de crioconservación en ápices de Mentha × piperita L., híbrido estéril entre Mentha aquatica L. y Mentha spicata L. Se han utilizado ápices de dos genotipos (‘MEN 186’y ‘MEN 198’) en los cuales se compararon dos técnicas de crioconservación, encapsulación-deshidratación y vitrificación-droplet. El análisis de la supervivencia y capacidad de regeneración del material sometido a los tratamientos de crioconservación, junto con el análisis de la estabilidad genética de dicho material mediante marcadores moleculares (RAPD y AFLP) han permitido comparar los distintos protocolos y tratamientos establecidos. El estudio sobre el tipo de protocolo empleado reveló una mayor variabilidad genética en la técnica de encapsulación-deshidratación, especialmente en el genotipo ‘MEN 186’, ya que ‘MEN 198’ resultó ser más estable en todos los análisis. La inestabilidad encontrada en esta técnica no fue exclusiva de aquellos explantos crioconservados, sino que los pasos previos a la inmersión en nitrógeno líquido (NL) también provocaron variaciones en el ADN. Según el tipo de muestra analizada se encontraron diferencias en la estabilidad: muestras provenientes de callos presentaron una mayor inestabilidad que aquellas de hojas (brotes). Se utilizaron tres medios para la recuperación de los ápices tras la crioconservación con el uso de diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento: “Reed” (0,5 mgL-1 6-bencilaminopurina, BAP), “Senula” (0,5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purina, 2-iP + 0,1 mgL-1 ácido α-naftalen-acético, ANA) y “Nudos” (0,5 mgL-1 BAP + 0,1 mgL-1ANA). El medio “Reed” produjo un aumento en la supervivencia y recuperación de los ápices en ambos genotipos y técnicas, y disminuyó la formación de callo. Sin embargo, no tuvo un efecto significativo en la estabilidad genética. El medio “Senula” provocó una mayor estabilidad genética en el genotipo más inestable, ‘MEN 186’. Para reducir el daño oxidativo producido durante la encapsulación-deshidratación, e incrementar la recuperación de los ápices manteniendo su estabilidad genética, se comparó el efecto de añadir sustancias antioxidantes en el precultivo de los ápices (ácido ascórbico, vitamina E y glutatión). No se obtuvo la respuesta esperada y estos tratamientos no presentaron efectos significativos tanto en la estabilidad como en la recuperación. Para entender mejor qué sucede durante todo el proceso de encapsulación-deshidratación, se evaluó cada paso del protocolo por separado y su efecto en la estabilidad y la recuperación. Además, se determinó el estado de oxidación en cada etapa mediante la cuantificación de malondialdehído y la detección de la formación de radicales libres (mediante el ensayo del ácido tiobarbitúrico, y sondas fluorescentes específicas, respectivamente). Se determinó que a partir de los primeros pasos se genera estrés oxidativo, el cual aumenta a medida que se avanza por el protocolo hasta la inmersión en nitrógeno líquido. Esto se ve reflejado en la disminución progresiva tanto de la recuperación como de la estabilidad genética. Con el uso de antioxidantes en el precultivo (ácido ascórbico y vitamina E) no se obtuvo un efecto positivo en el mantenimiento de la estabilidad genética, y tan sólo con el uso de vitamina E se observó una recuperación mayor en uno de los pasos estudiados (después de la desecación). Sin embargo, cuando se utilizó ácido ascórbico durante el precultivo o la deshidratación osmótica se consiguió disminuir de forma significativa la formación de MDA y la acumulación del radical superóxido (O2•-) en la mayoría los pasos analizados, aunque esta reducción no parece tener un efecto directo en la estabilidad genética del material recuperado. ABSTRACT Cryopreservation has been described as an effective technique for the long term of ex situ conservation that has been successfully applied to numerous species, and is of especial relevance for those with vegetative propagation, infertile or endangered, in which simpler systems of ex situ conservation, such as seed banking, are not feasible. It also has advantages over in vitro conservation, as it reduces or eliminates excessive material handling, avoids periodic subcultures and thus limits the risk of contamination and the appearance of somaclonal variation. However, plant material is subjected to different treatments involved in the cryopreservation procedures, which impose several stresses. Among them, oxidative stress can potentially cause damage to membranes, proteins, carbohydrates and DNA. In this work, two cryopreservation techniques have been evaluated in Mentha × piperita L. shoot tips, sterile hybrid between Mentha aquatica L. and Mentha spicata L. Two genotypes ('MEN 186' and 'MEN 198') were used to compare two techniques: encapsulation-dehydration and droplet-vitrification. The analysis of survival and recovery capacity of the material after the cryopreservation treatments, and the analysis of the genetic stability by molecular markers (RAPD and AFLP) have enabled the comparison between protocols and treatments. The study of the two cryopreservation procedures revealed a higher genetic variability in the encapsulation-dehydration technique, especially in genotype 'MEN 186', as 'MEN 198' was more stable in all analyses. The instability generated in this technique was not exclusive of cryopreserved explants, pretreatments prior to immersion in NL also caused DNA variations. The type of sampled plant material revealed also differences in the stability: callus samples showed greater instability than shoots. Three different culture media were used for the recovery of shoot tips after cryopreservation, using different combinations of growth regulators: "Reed" (0.5 mgL-1 6-benzylaminopurine, BAP), "Senula" (0.5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purine, 2-iP + 0.1 mgL-1 α-naphthalene acetic acid, ANA) and "Nodes" (0.5 mgL-1 BAP + 0.1 mgL-1 ANA). "Reed" medium increased survival and recovery of shoot tips in both genotypes and techniques and decreased callus formation. However, it didn`t have a significant effect on genetic stability. "Senula" medium caused a higher genetic stability in the most unstable genotype, 'MEN 186'. To reduce oxidative damage during encapsulation-dehydration, and increase shoot tip recovery and maintain genetic stability, the effect of added antioxidants (ascorbic acid, vitamin E and glutathione) in the shoot tip preculture medium was studied. These treatments had no significant effect on both stability and recovery. To better understand the events during the encapsulation-dehydration process, the effect of each step of the protocol on stability and recovery was evaluated separately. Moreover, the oxidation level was determined by quantifying malondialdehyde (MDA) formation and detecting free radical accumulation (using the thiobarbituric acid assay, and specific fluorescent probes, respectively). The oxidative stress was detected from the first steps and increased throughout the protocol until the immersion in liquid nitrogen. This was also reflected in the gradual decline of recovery and genetic stability. The use of antioxidants (ascorbic acid and vitamin E) in the shoot tip preculture medium had no effect in maintaining genetic stability; only vitamin E increased recovery in one of the steps studied (after desiccation). However, when ascorbic acid was used during the preculture or during the osmotic dehydration, a significantly decrease was observed in MDA formation and superoxide radical accumulation in most of the steps analyzed, although this reduction did not seem to have a direct effect on the genetic stability of recovered material.

Síntese, caracterização e aplicações de fluoróforos derivados do BODIPY

O desenvolvimento de técnicas analíticas, espectroscópicas e de imagem baseadas na detecção da fluorescência está associado com a necessidade por marcadores fluorescentes com variadas características e aplicabilidades. Dentre os diversos marcadores fluorescentes disponíveis, os derivados de borodipirrometenos (BODIPY), descobertos no final da década de 1960, passaram a ser amplamente utilizados desde o final da década de 1980. Esta tese de doutorado se trata de um estudo pioneiro no Brasil, envolvendo a síntese, modificação química e caracterização fotofísica de BODIPYs. Na primeira etapa do projeto métodos de obtenção de BODIPYs foram estabelecidos e aplicados na síntese de uma biblioteca de sondas fluorescentes. O estudo fotofísico dessa biblioteca de fluoróforos nos possibilitou identificar e estudar particularidades de alguns fluoróforos, como o solvatocromismo, halocromismo e ionocromismo. A segunda etapa do projeto envolveu o estabelecimento de métodos de modificação química de BODIPYs visando a diversificação fotofísica e estrutural da biblioteca de compostos. Foram sintetizados BODIPYs reativos que foram submetidos a reações de substituição nucleofílica, Suzuki, Sonogashira, Knoevenagel e arilação direta, levando à obtenção de compostos com propriedades ópticas diversas. Por fim, na terceira etapa do projeto, está descrito o desenvolvimento de novos métodos de modificação química de fluoróforos BODIPY. Foi desenvolvido um método simples de tiocianação direta dessa classe de compostos com bons rendimentos, baseado na utilização de tiocianato de amônio e oxone ®. O escopo e as limitações do novo método de tiocianação foi estudado em BODIPYs com propriedades eletrônicas diversas. Foi mostrada ainda a conversão de BODIPYs tiocianados a derivados tioalquilados com características ópticas particulares. Em conclusão, com esta tese de doutorado foi estabelecida uma linha de pesquisa inovadora envolvendo a síntese e modificação química de uma classe de compostos com ampla aplicação tecnológica.

Mapeamento cromossômico de DNAs repetitivos com fins biotecnológicos em peixes marinhos e interesse comercial - Rachycentridae e Lutjanidae

The Rachycentron canadum species, commonly known as beijupirá or cobia is the only representative of Rachycentridae family which has been increasingly used in marine fish farming, in intensive cultivation. As advantageous features it has easy adaptation, prolific behavior, early growth in captivity and high commercial value. Additionally, specie of Lutjanidae family (Lutjanus synagris, Lutjanus jocu, Lutjanus analis, Lutjanus alexandrei and Ocyurus chrysurus) represents an important fisheries resource in all areas of its occurrence. In Brazil, the commercial exploitation of Lutjanidae which begun in the 60's and 80's, already has showed a decline in catch volumes. This fact suggests that the snappers must have a conservative management. Despite the economic potential, little is known about the genetic and cytogenetic characteristics of these species, especially with respect to repetitive DNA analysis, which represents the major part of the eukaryotes genome, playing important evolutionary roles in the fish genome. Cytogenetic data is increasingly being used in population studies and biotechnological purposes in fishes. The cytogenetical analyzes were performed using classical methods such as Giemsa staining, C-banding and Ag-NORs, fluorochromes base-specific staining (DAPI and MM) and physical mapping of repetitive sequences among which, telomeric sequences, transposons (Tol2), retrotransposons (Rex1 and Rex3), repetitive DNA (microsatellites and Cot-1) and transcriptionally active regions of the 18S and 5S ribosomal genes and histone (H3 and H2BA) by in situ hybridization with fluorescent probes (FISH). The chromosomal patterns obtained contributed to the organization of repetitive sequences in the genome of the species, as well as karyotypical differentiation. Unusual patterns of histone sequences expansion depict the first occurrence in marine fishes. The obtained data provided subsides to the genetic knowledge of the important fisheries resource represented by the species here analyzed, seeking the marine pisciculture improvement.

Mapeamento cromossômico de genes ribossomais em espécies estuarinas da família Gerreidae Identificação de uniformidade cariotípica e sua empregabilidade com fins biotecnológicos - REPROGEN

Perciformes are dominant in the marine environment, characterized as the largest and most diverse fish group. Some families, as Gerreidae, popularly known as silver jennies, carapebas, or mojarras have a high economic potential to marine fish farming, natural explotation and game fishing. Genetic information of these species are of fundamental importance for their management and production. Despite exist over 13,000 marine fish species described, only 2% were cytogenetically analyzed and less than 1% have some reproductive characteristics known. Induced breeding, cytogenetic characterization and cryopreservation of gametes, represent important areas in applied fish studies. In this project cytogenetic analyzes were performed to acess genetic aspects of Gerreidae species, distributed in coastal and estuarine regions of Northeast Brazil. Different methods for identifying chromosomal regions were employed using conventional techniques (Ag-NORs, C-banding), staining with base-specific fluorochromes (DAPI-CMA3), and physical mapping of ribosomal genes 18S and 5S rDNA, through hybridization in situ with fluorescent probes (FISH). The six species analyzed showed remarkable chromosome conservatism. The 18S and 5S ribosomal genes when analyzed in phylogenetic perspective demonstrate varied evolutionary dynamics, suggesting ocurrence of stasis process in some groups and greater dynamism in others. Double FISH with 18S and 5S probes showed both how efficient cytotaxonomic markers in the homogeneous karyotypes of this group of species. The karyotypic pattern identified in addition to the evolutionary aspects of karyotype, are suggestive of existence of low potential of post-zygotic barrier, prompting further research to prospect for artificial interspecific hybridization of these species of commercial importance

Síntese e análise fotofísica de híbridos de cumarinas-chalconas

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Química e Biológica, 2016.

Poli-líquidos iônicos e complexos solúveis de Eu3+ e Tb3+ : bioimageamento celular seletivo

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2015.

Síntese de novas bases de tröger, fluorescentes via transferência protônica intramolecular no estado excitado (ESIPT)

Neste trabalho, realizou-se a síntese e a caracterização de quatro novas bases de Tröger. Estes compostos pertencem à classe de heterociclos 2-hidroxifenibenzazóis, que caracterizam-se por apresentar uma forte emissão de fluorescência, devido à reação de transferência protônica intramolecular no estado excitado -ESIPT- por eles sofrrida quando excitados por luz ultravioleta. Os heterociclos sintetizadosapesentam ligações de hidrogênio intramolecular entrte o nitrogênio azólico e a hidroxila fenólica e um granded deslocamento de Stokes, características tíicas de compostos que sofrem a ESIPT. As bases de Tröger, que são quirais, são bem conhecidas como receptores moleculares devido a concavidade que estas moléculas apresentam, Os compostos obtidos são os primeiro exmeplos de bases de Tröger fluorescentes, via ESIP, na literatura, por isso, despertam grande interesse na síntese de sondas biológicas moleculares fluorescentes. A partir da resolução quiral das bases de Tröger, estas potencialmente podem vir a ser utilizadas como indutores quirais e/ou par ao reconhecimento enantiosseletivo do DNA. A resolução quiral foi feita para uma das bases de Tröger sintetizadas.

Calibração de sondas capacitivas, funções físico-hídricas e variação do armazenamento de água em um argissolo cultivado com palma forrageira

Objetivou-se, com este trabalho, realizar a calibração de três sondas capacitivas, visando a utilizá-las na definição de funções físico-hídricas e na análise da variação espacial e temporal do conteúdo (q) e do armazenamento de água, em um Argissolo Vermelho-Amarelo, cultivado com três clones de palma forrageira, no Semiárido pernambucano. O estudo foi executado numa área experimental situada em Serra Talhada, PE. Para isso, foi realizada a calibração de três sondas capacitivas, usando-se dados de densidade aparente do solo, de umidade gravimétrica e de frequências relativas, em cinco condições de umidade do solo. Aplicou-se o método do perfil instantâneo, para determinação do fluxo vertical de água, e do potencial matricial de água no solo. Em seguida, analisou-se a variação espaço-temporal do q e do armazenamento de água no solo. As medidas de frequência relativa das sondas capacitivas apresentaram elevada relação com os dados de q (R2 > 0,87). A partir do método do perfil instantâneo, foi possível determinar as funções da condutividade hidráulica e do potencial total de água no solo, em relação ao q, com elevados coeficientes de determinação (R2 > 0,91). Não houve diferenças significativas do q entre os clones de palma forrageira.

Dispositivos moleculares fluorescentes contendo receptores poliamínicos

O objectivo desta tese é a caracterização global de algumas famílias de compostos poliamínicos com grupos aromáticos fluorescentes. Estes têm potencial deaplicação como dispositivos moleculares, incluindo quimiossensores, interruptores moleculares,máquinas moleculares ou sistemas de processamento de informação moleculares. Estes compostos possuem poliaminas que podem actuar como unidades receptoras de várias espécies químicas, como protões, iões metálicos ou aniões, e os tornam solúveis em água. Contêm também grupos aromáticos fluorescentes (naftaleno, antraceno, pireno), que actuam como unidades sinalizadoras do estado do receptor. No Capítulo 1 são apresentados métodos de síntese e purificação de compostos poliamínicos, juntamente com descrições pormenorizadas das sínteses. Nos Capítulos 2 a 8 são caracterizados diversos compostos, quando livres em solução aquosa, e na presença de iões de metais de transição e de ATP. São usadas técnicas de espectrofotometria no UV-visível, espectrofluorimetria no estado estacionário e de contagem de fotão único correlacionada no tempo, complementadas com dados potenciométricos e de RMN fornecidos pelo grupo do Prof. Enrique García-España da Universidade de Valência, Espanha. No Capítulo 2 estudam-se compostos com grupos antraceno. Verifica-se supressão de emissão a pH básico, comum a todos os compostos poliamínicos, e caracterizam-se factores que influenciam nesse fenómeno. No Capítulo 3 analisam-se compostos de naftaleno. Verificam-se excímeros intramoleculares em compostos com dois grupos naftaleno. Para os formar ocorre um movimento fotoinduzido de flexão, pelo que esses compostos podem ser considerados máquinas moleculares. No Capítulo 4 estudam-se compostos com grupos pireno. Observam-se excímeros intramoleculares nos compostos com dois fluoróforos. No Capítulo 5 caracterizam-se compostos com dois grupos aromáticos diferentes(vários compostos com naftaleno e antraceno, um com pireno e antraceno e um com pireno e naftaleno). Verifica-se transferência de energia do grupo naftaleno para o antraceno (que parece evoluir de acordo com a teoria de Förster), de pireno para antraceno e de naftaleno para pireno. No Capítulo 6 examinam-se dois compostos de antraceno na presença de iões metálicos. Verifica-se aumento de emissão presença de Zn(II) e Cd(II), e supressão de emissão na presença de Cu(II) e Ni(II). Caracteriza-se o comportamento de um deles do ponto de vista de operações lógicas ao nível molecular. No Capítulo 7 caracteriza-se um composto de naftaleno na presença de vários iões metálicos. Verifica-se supressão de emissão com iões de metais de transição do 3ºperíodo com níveis na presença de Zn(II), Cd(II) e Al(III). Não se verifica efeito na presença de iões alcalinos, alcalino-terrosos, lantanídeos, Sn(II) e Pb(II). No Capítulo 8 estuda-se a interacção de compostos poliamínicos com ATP. Verifica-se em qualquer pH a ocorrência de empilhamento aromáticos do ATP e composto poliamínico, e ancoragem do grupo polifosfato do ATP com a poliamina. Verifica-se supressão de emissão do composto poliamínico a pH ácido, principalmente por transferência electrónica fotoinduzida do seu grupo aromático para o grupo adenina protonado do ATP. Num composto com antraceno e naftaleno, continua-se a verificar transferência de energia d incompletamente preenchidos, e com Hg(II), e aumento de emissãoπ-π entre os grupos

Evaluacion de un conjugado antirrabico por titulacion en diferentes microscopios fluorescentes

En cinco laboratorios se tituló una partida de conjugado antirrábico para inmunofluoresCencia con microscopios de tres marcas distintas, equipados con diferentes accesorios. Los títulos obtenidos variaron entre < 1:4 y 1:64, dependiendo de los accesorios utilizados. Estos resultados ponen de relieve la necesidad de titular los conjugados en cada laboratorio. Se mencionam los inconvenientes que pueden ocasionar la distribución del reactivo diluido de acuerdo con el título obtenido por el productor, o mezclado con suspensiones de cerebro de ratones normales e infectados con virus rábico.