Quantitative and qualitative changes in gene expression patterns characterize the activity of plaques in multiple sclerosis

Multiple sclerosis (MS) is a complex autoimmune disorder of the CNS with both genetic and environmental contributing factors. Clinical symptoms are broadly characterized by initial onset, and progressive debilitating neurological impairment. In this study, RNA from MS chronic active and MS acute lesions was extracted, and compared with patient matched normal white matter by fluorescent cDNA microarray hybridization analysis. This resulted in the identification of 139 genes that were differentially regulated in MS plaque tissue compared to normal tissue. Of these, 69 genes showed a common pattern of expression in the chronic active and acute plaque tissues investigated (Pvalue<0.0001, ρ=0.73, by Spearman's ρ analysis); while 70 transcripts were uniquely differentially expressed (≥1.5-fold) in either acute or chronic active tissues. These results included known markers of MS such as the myelin basic protein (MBP) and glutathione S-transferase (GST) M1, nerve growth factors, such as nerve injury-induced protein 1 (NINJ1), X-ray and excision DNA repair factors (XRCC9 and ERCC5) and X-linked genes such as the ribosomal protein, RPS4X. Primers were then designed for seven array-selected genes, including transferrin (TF), superoxide dismutase 1 (SOD1), glutathione peroxidase 1 (GPX1), GSTP1, crystallin, alpha-B (CRYAB), phosphomannomutase 1 (PMM1) and tubulin β-5 (TBB5), and real time quantitative (Q)-PCR analysis was performed. The results of comparative Q-PCR analysis correlated significantly with those obtained by array analysis (r=0.75, Pvalue<0.01, by Pearson's bivariate correlation). Both chronic active and acute plaques shared the majority of factors identified suggesting that quantitative, rather than gross qualitative differences in gene expression pattern may define the progression from acute to chronic active plaques in MS.

Organización espacial y funcional del genoma en células aneuploides

198 p.

Ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante por ExoU de Pseudomonas aeruginosa

ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103∆exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103∆UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante

Differential effects of an anti-oxidant intervention on cardiomyocyte expression of adrenomedullin and intermedin and their receptor components in chronic nitric oxide deficiency

Background: Chronic inhibition of nitric oxide (NO) synthesis is associated with hypertension, myocardial oxidative stress and hypertrophic remodeling. Up-regulation of the cardiomyocyte adrenomedullin (AM) / intermedin (IMD) receptor signaling cascade is also apparent in NO-deficient cardiomyocytes: augmented expression of AM and receptor activity modifying proteins RAMP2 and RAMP3 is prevented by blood pressure normalization while that of RAMP1 and intermedin (IMD) is not, indicating that the latter is regulated by a pressure-independent mechanism. Aims: to verify the ability of an anti-oxidant intervention to normalize cardiomyocyte oxidant status and to investigate the influence of such an intervention on expression of AM, IMD and their receptor components in NO-deficient cardiomyocytes. Methods: NO synthesis inhibitor, NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 35mg/kg/day) was given to rats for 8 weeks, with/without con-current administration of antioxidants (Vitamin C (25mg/kg/day) and Tempol (25mg/kg/day)). Results: In left ventricular cardiomyocytes isolated from L-NAME treated rats, increased oxidative stress was indicated by augmented (3.6 fold) membrane protein oxidation, enhanced expression of catalytic and regulatory subunits of pro-oxidant NADPH oxidases (NOX1, NOX2) and compensatory increases in expression of anti-oxidant glutathione peroxidase and Cu/Zn superoxide dismutases (SOD1, SOD3). Vitamin C plus Tempol did not reduce systolic blood pressure but normalized augmented plasma levels of IMD, but not of AM, and in cardiomyocytes: (i) abolished increased membrane protein oxidation; (ii) normalized augmented expression of prepro-IMD and RAMP1, but not prepro-AM, RAMP2 and RAMP3; (iii) attenuated (by 42%) increased width and normalized expression of hypertrophic markers, skeletal-�-actin and prepro-endothelin-1 similarly to blood pressure normalization but in contrast to blood pressure normalization did not attenuate augmented brain natriuretic peptide (BNP) expression. Conclusion: normalization specifically of augmented IMD/RAMP1 expression in NO-deficient cardiomyocytes by antioxidant intervention in the absence of blood pressure reduction indicates that these genes are likely to be induced directly by myocardial oxidative stress. Although oxidative stress contributed to cardiomyocyte hypertrophy, induction of IMD and RAMP1 is unlikely to be secondary to cardiomyocyte hypertrophy.

Expression and function of endothelin and its receptors in vascular adventitial fibroblasts

Objective: The adventitia has been recognized to play important roles in vascular oxidative stress, remodelling and contraction. We recently demonstrated that adventitial fibroblasts are able to express endothelin-1 (ET-1) in response to angiotensin II (ANG II). However, the mechanisms by which ANG II induces ET-1 expression are unknown. It is also unclear whether the ET-1 receptors are expressed in the adventitia. We therefore examined the role of oxidative stress in the regulation of ET-1. We also investigated the expression of both the ETA and ETB receptors and the roles of these two types of receptors in collagen synthesis and ET-1 clearance in adventitial fibroblasts. Methods and Results: Adventitial fibroblasts were isolated and cultured from the thoracic mouse aorta. Cells were treated with ANG II (lOOnM), ET-1 (lOpM), NADPH oxidase inhibitor apocynin (lOOfiM), the superoxide anion scavenger tempol (lOOfiM), the ANG II receptor antagonists (100[aM), losartan (AT| receptor) and PD 1233 19 (AT2 receptor), the ET-1 receptor antagonists (lOOuM), BQ123 (ETA receptor) and BQ788 (ETB receptor), and the ETB receptor agonist (lOOnM) Sarafotoxin 6C. ET-1 peptide levels were determined by ELISA, while ETA ,ETB and collagen levels were determined by Western blot. ANG II increased ET-1 peptide levels in a time-dependent manner reaching significance when incubated for 24 hours. NAD(P)H oxidase inhibitor, apocynin, as well as the superoxide scanverger, tempol, significantly reduced ANG Il-induced ET-1 peptide levels while over-expression of SOD1 (endogenous antioxidant enzyme) significantly decreased ANG Il-induced collagen I expression, therefore implicating reactive oxygen species in the mediation of ET-1. ANG II increased ETA receptor protein as well as collagen in a similar fashion, reaching significance after 4, 6, and 24 hours treatment. ANG II induced collagen was reduced while in the presence of the ETA receptor antagonist suggesting the role of the ETa receptor in the regulation of the extracellular matrix. ANG II treatment also increased ETB receptor protein levels in a time-dependent manner. ANG II treatment in the presence of the ETB receptor antagonist significantly increased ET-1 peptide levels. On another hand, the ETB receptor agonist, Sarafotoxin 6C, significantly decreased ET-1 peptide levels. These data implicate the role of the ETb receptor in the clearance of the ET-1 peptide. Conclusion: ANG II-induced increases of ET-1 peptide appears to be mediated by reactive oxygen species derived from NAD(P)H oxidase. Both the ETA and ETB receptors are expressed in adventitial fibroblasts. The ETA receptor subtype mediates collagen I expression, while the ETB receptor may play a protective role through increasing the clearance of the ET- 1 peptide.

Genetics of amyotrophic lateral sclerosis

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la maladie des neurones moteurs la plus fréquente, affectant 4-6 individus par 100,000 habitants à l’échelle mondiale. La maladie se caractérise par une faiblesse et une atrophie musculaire suite à la dégénérescence des neurones du cortex moteur, tronc cérébral et moelle épinière. Les personnes atteintes développent les premiers symptômes à l’âge adulte et la maladie progresse sur une période de trois à cinq ans. Il a été répertorié qu’environ 10% des patients ont une histoire familiale de SLA; 90% des gens affectés le sont donc de façon sporadique. La découverte il y a 19 ans de mutations dans le gène zinc/copper superoxide dismutase (SOD1), présentes dans 15-20% des cas familiaux de SLA et environ 2% du total des individus affectés, a été l’événement déclencheur pour la découverte de variations génétiques responsables de la maladie. La recherche sur la génétique de la SLA a connu une progression rapide ces quatre dernières années avec l’identification de mutations dans de nouveaux gènes. Toutefois, même si certains de ces gènes ont été démontrés comme réellement liés à la maladie, la contribution d’autres gènes demeure incertaine puisque les résultats publiés de ceux-ci n’ont pas, à ce jour, été répliqués. Une portion substantielle de cas reste cependant à être génétiquement expliquée, et aucun traitement à ce jour n’a été démontré comme étant efficace pour remédier, atténuer ou prévenir la maladie. Le but du projet de recherche de doctorat était d’identifier de nouveaux gènes mutés dans la SLA, tout en évaluant la contribution de gènes nouvellement identifiés chez une importante cohorte multiethnique de cas familiaux et sporadiques. Les résultats présentés sont organisés en trois sections différentes. Dans un premier temps, la contribution de mutations présentes dans le gène FUS est évaluée chez les patients familiaux, sporadiques et juvéniles de SLA. Précisément, de nouvelles mutations sont rapportées et la proportion de mutations retrouvées chez les cas familiaux et sporadiques de SLA est évaluée. De plus, une nouvelle mutation est rapportée dans un cas juvénile de SLA; cette étude de cas est discutée. Dans un deuxième temps, de nouvelles avenues génétiques sont explorées concernant le gène SOD1. En effet, une nouvelle mutation complexe est rapportée chez une famille française de SLA. De plus, la possibilité qu’une mutation présente dans un autre gène impliqué dans la SLA ait un impact sur l’épissage du gène SOD1 est évaluée. Finalement, la dernière section explique la contribution de nouveaux gènes candidats chez les patients atteints de SLA. Spécifiquement, le rôle des gènes OPTN, SIGMAR1 et SORT1 dans le phénotype de SLA est évalué. Il est souhaité que nos résultats combinés avec les récents développements en génétique et biologie moléculaire permettent une meilleure compréhension du mécanisme pathologique responsable de cette terrible maladie tout en guidant le déploiement de thérapies suite à l’identification des cibles appropriées.

Altérations synaptiques à la jonction neuromusculaire dans un modèle murin de sclérose latérale amyotrophique

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative fatale caractérisée par la dégénérescence progressive des neurones moteurs centraux et périphériques. L’un des premiers signes de la maladie est la dénervation de la jonction neuromusculaire (JNM). Les diverses unités motrices (UM) ne présentent toutefois pas la même vulnérabilité à la dénervation dans la SLA: les UM rapide fatigables sont en fait les plus vulnérables et les UM lentes sont les plus résistantes. Alors que des études précédentes ont démontré dans plusieurs modèles animaux de la SLA de nombreuses variations synaptiques, les découvertes ont été contradictoires. Par ailleurs, le type d’UM n’a pas été tenu en compte dans ces divers travaux. Nous avons donc émis l’hypothèse que la présence de la mutation SOD1 pourrait affecter différemment la transmission synaptique des UM, en accord avec leur vulnérabilité sélective. En effectuant des enregistrements électrophysiologiques et de l’immunohistochimie, nous avons étudié la transmission synaptique des différents types d’UM du muscle à contraction rapide Extensor Digitorum Longus (EDL; rapide fatigable (FF) MU) et du muscle à contraction lente Soleus (SOL; lente (S) and rapide fatigue-résistante (FR) MU) de la souris SOD1G37R et leur congénères WT. Pour identifier le type d’UM, un marquage par immunohistochimie des chaînes de myosine a été effectué. Un triple marquage de la JNM a également été effectué pour vérifier son intégrité aux différents stades de la maladie. À P160, dans la période asymptomatique de la maladie, alors qu’aucune altération morphologique n’était présente, l’activité évoquée était déjà altérée différemment en fonction des UM. Les JNMs FF mutantes ont démontré une diminution de l’amplitude des potentiels de plaque motrice (PPM) et du contenu quantique, alors que les JNMs lentes démontraient pratiquement le contraire. Les JNMs FR montraient quant à elles une force synaptique semblable au WT. À P380, dans la période présymtomatique, de nombreuses altérations morphologiques ont été observées dans le muscle EDL, incluant la dénervation complète, l’innervation partielle et les extensions du nerf. La transmission synaptique évoquée des UM FF étaient toujours réduites, de même que la fréquence des potentiels de plaque motrice miniatures. À P425, à l’apparition des premiers symptômes, l’activité synaptique des JNMs S était redevenue normale alors que les JNMs FR ont montré à ce moment une diminution du contenu quantique par rapport au contrôle. De manière surprenante, aucun changement du ratio de facilitation n’a été observé malgré les changements flagrants de la force synaptique. Ces résultats révèlent que la fonction de la JNM est modifiée différemment en fonction de la susceptibilité des UM dans l’ALS. Cette étude fournit des pistes pour une meilleure compréhension de la physiologie de la JNM durant la pathologie qui est cruciale au développement d’une thérapie adéquate ciblant la JNM dans la SLA.

Superoxide Dismutase 1-mediated Production of Ethanol- and DNA-derived Radicals in Yeasts Challenged with Hydrogen Peroxide MOLECULAR INSIGHTS INTO THE GENOME INSTABILITY OF PEROXIREDOXIN-NULL STRAINS

Peroxiredoxins are receiving increasing attention as defenders against oxidative damage and sensors of hydrogen peroxide-mediated signaling events. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, deletion of one or more isoforms of the peroxiredoxins is not lethal but compromises genome stability by mechanisms that remain under scrutiny. Here, we show that cytosolic peroxiredoxin-null cells (tsa1 Delta tsa2 Delta) are more resistant to hydrogen peroxide than wildtype (WT) cells and consume it faster under fermentative conditions. Also, tsa1 Delta tsa2 Delta cells produced higher yields of the 1-hydroxyethyl radical from oxidation of the glucose metabolite ethanol, as proved by spin-trapping experiments. A major role for Fenton chemistry in radical formation was excluded by comparing WT and tsa1 Delta tsa2 Delta cells with respect to their levels of total and chelatable metal ions and of radical produced in the presence of chelators. The main route for 1-hydroxyethyl radical formation was ascribed to the peroxidase activity of Cu, Zn-superoxide dismutase (Sod1), whose expression and activity increased similar to 5- and 2-fold, respectively, in tsa1 Delta tsa2 Delta compared with WT cells. Accordingly, overexpression of human Sod1 in WT yeasts led to increased 1-hydroxyethyl radical production. Relevantly, tsa1 Delta tsa2 Delta cells challenged with hydrogen peroxide contained higher levels of DNA-derived radicals and adducts as monitored by immuno-spin trapping and incorporation of (14)C from glucose into DNA, respectively. The results indicate that part of hydrogen peroxide consumption by tsa1 Delta tsa2 Delta cells is mediated by induced Sod1, which oxidizes ethanol to the 1-hydroxyethyl radical, which, in turn, leads to increased DNA damage. Overall, our studies provide a pathway to account for the hypermutability of peroxiredoxin-null strains.

Efeitos da apomorfina e de um produto derivado de sua autoxidação em diferentes modelos biológicos

Apomorfina é um potente agonista dopaminérgico D1/D2, utilizada no tratamento da Doença de Parkinson. Em maio de 2001, apomorfina HCl foi aprovada para utilização no tratamento da disfunção erétil, aumentando o número de usuários potenciais deste fármaco. Estudos sugerem que apomorfina e outros agonistas dopaminérgicos podem induzir neurotoxicidade mediada por seus derivados de oxidação semiquinonas e quinonas, os quais levam à formação de espécies reativas de oxigênio. Os objetivos do presente estudo foram de avaliar os possíveis efeitos genotóxicos, antimutagênicos, citotóxicos de apomorfina (APO) e de um produto derivado de sua oxidação, 8-oxo-apomorfina-semiquinona (8-OASQ), utilizando o teste Salmonella/microssoma, Mutoxiteste WP2, ensaio Cometa e teste de sensibilidade em Saccharomyces cerevisiae. Em adição, foram avaliados os efeitos de APO e 8-OASQ sobre a memória e o comportamento em ratos (tarefa de esquiva inibitória, comportamento e habituação ao campo aberto) e o comportamento estereotipado em camundongos. Ambos compostos induziram mutações por erro no quadro de leitura em linhagens de S. typhimurium TA97 e TA98, sendo que 8-OASQ foi cerca de duas vezes mais mutagênico que APO, na ausência de S9 mix. Para linhagens que detectam mutágenos oxidantes, 8-OASQ foi mutagênico, enquanto APO foi antimutagênico, inibindo a mutagenicidade induzida por H2O2 e t-BOOH em linhagens de S. typhimurium e derivadas WP2 de E. coli. O S9 mix inibiu todos os efeitos mutagênicos, provavelmente retardando a oxidação de APO ou devido à conjugação de APO e seus produtos de autoxidação, como 8-OASQ, a proteínas do S9. Em testes de sensibilidade com S. cerevisiae, APO foi citotóxica para algumas linhagens apenas nas doses mais altas. Para 8-OASQ este efeito foi dose-depende para todas as linhagens, sendo que as mutantes deficientes em catalase (ctt1), superóxido dismutase (sod1) e yap1 foram as mais sensíveis. APO protegeu as linhagens de S. cerevisiae contra danos oxidativos induzidos por concentrações altas de H2O2 e t-BOOH, enquanto que 8-OASQ aumentou os efeitos pró-oxidantes e induziu respostas adaptativas para aqueles agentes. APO e 8-OASQ induziram efeitos de prejuízo na memória de curta e de longa duração em uma tarefa de esquiva inibitória em ratos. APO, mas não 8-OASQ, prejudicou a habituação a um novo ambiente de forma dose-dependente. Os efeitos de prejuízo de memória não foram atribuídos à redução da nocicepção ou outra alteração inespecífica de comportamento, visto que nem APO e nem 8-OASQ afetaram a reatividade ao choque nas patas e comportamento durante a exploração ao campo aberto. Os resultados sugerem, portanto, que os produtos de oxidação de dopamina ou de agonistas dopaminérgicos podem induzir deficiências cognitivas.APO, mas não 8-OASQ, induziu comportamento estereotipado em camundongos machos CF-1. A falta da indução deste comportamento por 8-OASQ sugere que a autoxidação de APO causa a perda na sua habilidade de ligar-se a receptores dopaminérgicos. Pelo ensaio Cometa, 8-OASQ provocou danos ao DNA do tecido cerebral de camundongos sacrificados 1 h e 3 h, mas não 24 h após sua administração, enquanto que APO induziu um fraco aumento da freqüência de dano ao DNA 3 h após o tratamento. Esses resultados sugerem que ambos APO e 8-OASQ desempenham uma atividade genotóxica no tecido cerebral.

Estudos dos alcalóides β-carbolínicos em diferentes modelos biológicos

Os alcalóides β-carbolínicos possuem uma ampla distribuição, sendo encontrados em várias famílias de plantas, além de estarem presentes na fumaça do cigarro, bebidas alcoólicas, alimentos excessivamente cozidos e em mamíferos. Estes alcalóides são conhecidos por apresentarem várias ações farmacológicas sobre os sistemas nervoso central, muscular e cardiovascular, causando alucinações, tremores, convulsões, hipotensão e bradicardia. Possuem também atividade antioxidante e imunossupressora, além de ligarem-se a receptores de serotonina, dopamina, benzodiazepina; são também inibidores das enzimas monoamino-oxidase-A (MAO-A) e DNA topoisomerases. Os objetivos do presente estudo foram avaliar os possíveis efeitos antioxidantes, antimutagênicos, antigenotóxicos e neurocomportamentais dos alcalóides β-carbolínicos: harmano, harmina, harmol, harmalol e harmalina, utilizando teste de sensibilidade e antimutagênese em Saccharomyces cerevisiae, ensaio cometa em cultura de células de pulmão de hâmster chinês (V79) e avaliação do comportamento, através da tarefa de reconhecimento de novo objeto, em camundongos, respectivamente. Em testes de sensibilidade, todos os alcalóides protegeram as linhagens deficientes em sistemas de defesa antioxidante de S. cerevisiae contra danos induzidos pelos oxidantes H2O2 e paraquat. De maneira geral, os alcalóides β-carbolínicos protegeram mais as células dos danos gerados pelo H2O2 e o aumento da viabilidade foi mais significativo para as linhagens sod1Δ, sod2Δ e sod1Δsod2Δ. Também, possivelmente por uma ação seqüestradora de espécies reativas de oxigênio, os alcalóides β-carbolínicos mostraram forte atividade contra danos no DNA induzidos pelo H2O2, no teste de antimutagênese com a linhagem N123 de S. cerevisae e no teste de antigenotoxicidade, utilizando o ensaio cometa com células V79. As dihidro-β-carbolinas harmalina e harmalol mostraram um efeito mais pronunciado que as β-carbolinas nos ensaios citados acima. Quanto à avaliação dos efeitos neurocomportamentais em camundongos, a administração sistêmica dos alcalóides β-carbolínicos facilitou a formação de memória de curta duração, no caso da harmina, harmol e harmalina e, também a memória de longa duração (harmalina) em camundongos, verificada com uso da tarefa de reconhecimento de novo objeto.

Evaluation of developmental changes in bovine in vitro produced embryos following exposure to bovine Herpesvirus type 5

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeito genotóxico da artemisinina e do artesunato em células de mamíferos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Avaliação dos efeitos da exposição experimental ao herpesvírus bovino tipo 5 em embriões bovinos produzidos in vitro

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação mitocondrial em células mononucleares periféricas caninas infectadas com o vírus da cinomose

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Genetic analysis of superoxide dismutase 1 gene in murrah river buffalo

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)