Role of cytokines in secondary lymphoid organ development

Summary Secondary lymphoid organs are sites of antigen presentation, clonal expansion of B and lymphocytes, and affinity maturation of B lymphocytes. In the intestine, these immune functions occur mainly in Peyer's patches (PP). PP develop through the interplay of two main cell types, haematopoietic cells and meserichyrnal cells. One particular haematopoietic cell type was identified as the inductive cell type in the formation of both PP and lymph nodes and was therefore designated as lymphoid tissue inducer cell. For a successful PP organogenesis, the crucial molecular components involved in the crosstalk of inducer cells and their mesenchymal target cells are adhesion molecules, lymphotoxin (LT) family members, and cytokines. In particular, the interleukin 7 receptor (IL-7R) expressed on inducer cells is absolutely required. To investigate the contribution of the ligand for the IL-7R. the cytokine IL-7, in the process of PP formation, we analyzed double transgenic (TG) mice. These mice resulted from an interbreeding of an IL-7TG mouse strain where the transgene is under the control of the MHC class II promoter with a second transgenic mouse strain, which overexpresses a transactivator for MHC class II genes. Double TG offsprings revealed higher levels of IL-7 mRNA occuring earlier in embryogenesis. Consequently, double TG mice showed a striking phenotype with a 3- to 5-fold increase in PP numbers compared to single IL-7TG or control littermates. Analysis of embryonic double TG intestines demonstrated that the process of PP development was already elevated during development as early as the embryonic day 16.5. Importantly, inducer cells were significantly increased in numbers in these embryonic intestines. Furthermore, the expression of LT? mRNA, which at this early time point is exclusively expressed by inducer cells, was also increased in double TG animals. These data clearly indicate a direct influence of IL-7 on the expansion of lymphoid tissue inducer cells and on the availability of LT? leading to a higher frequency of developing PP in fetal life. Interestingly, in addition to an enhanced frequency of PP development, in double TG mice, three additional phenotypic differences were observed. i) Lymphocyte infiltration in various non-lymphoid organs, such as stomach, salivary gland, and liver. Subsequent analysis demonstrated that B lymphocytes were predominant within these tertiary lymphoid structures. ii) Ectopic lymph node-like structures containing both B and T lymphocytes were found near the inguinal lymph node. iii) Double TG mice had a severe bone resorption syndrome most likely as a consequence of the pro-osteoclastic effect of IL-7. Taken together, these results show that IL-7 plays a key role in the homeostasis of inducer cells, in the generation of PP in the gut, in the formation of ectopic lymphoid tissue, and in bone resorption. Résumé Les organes lymphoïdes secondaires sont les lieux de présentation des antigènes aux lymphocytes, permettant l'expansion des lymphocytes B et T et la maturation d'affinité des lymphocytes B. Dans l'intestin, ces fonctions immunitaires se déroulent dans les plaques de Peyer (PP). Ces plaques se développent grâce à l'interaction des cellules hématopoïétiques avec des cellules mésenchymales. Un type particulier de cellules hématopoïétiques a été identifié comme cellule inductrice dans la formation des PP et des ganglions lymphatiques et de ce fait a été désigné cellule inductrice des tissus lymphoïdes. Durant l'organogénèse des PP, les composants moléculaires cruciaux impliqués dans l'interaction des cellules inductrices et des cellules mésenchymales sont les molécules d'adhésion, les membres de la famille des lymphotoxines (LT) et les cytokines. En particulier, le récepteur de l'interleukine 7 (IL-7R) exprimé par les cellules inductrices est absolument nécessaire. Pour étudier le rôle du ligand de l'IL-7R, l'interleukine IL-7, dans la formation des PP, nous avons croisé une lignée de souris transgénique (TG) surexprimant IL-7 sous contrôle du promoteur MHC class Il avec une lignée de souris transgénique surexprimant un transactivateur des genes MHC class II. Les souris doubles TG présentent une concentration élevée d'ARNm de l'IL-7 durant l'embryogénèse, ce qui résulte en une augmentation du nombre de PP de 3 à 5 fois en comparaison aux souris ayant seul le transgène IL-7 et aux souris contrôles. L'analyse des intestins des souris doubles TG démontre que le processus de développement des PP était élevé dès le jour 16.5 du développement embryonnaire. L'augmentation du nombre des cellules inductrices dans ces intestins embryonnaires est signilicative. De plus l'expression de l'ARNm LT?, qui à ce stade précoce est exclusivement exprimé dans les cellules inductrices, est également augmenté dans les doubles TG. Ces résultats indiquent clairement une influence directe d'IL-7 sur l'expansion des cellules inductrices des tissues lymphoïdes et sur la synthèse de LT? induisant une augmentation des PP se développant durant la vie foetale. En plus du développement accru des PP dans les souris doubles TG, trois différences phénotypiques ont été observées. i) L'infiltration lymphocytaire dans différents organes non-lymphoïdes, comme l'estomac, les glandes salivaires et le foie. Des analyses complémentaires ont demontré que les lymphocytes B étaient prédominants dans ces structures lymphoïdes tertiaires. ii) Des structures de ganglions lymphatiques ectopiques contenant des lymphocytes B et T ont été trouvées près des ganglions lymphatiques inguinaux. iii) Les souris doubles TG présentent un syndrome de résorption osseuse sévère probablement dû à l'effet pro-osteoclaste d'IL-7. Globalement, ces résultats montrent que IL-7 joue un rôle clé dans l'homéostasie des cellules inductrices dans la génèse de PP de l'intestin, dans la formation des tissus lymphoïdes ectopiques et dans la résorption osseuse.

Optimisation du transfert de gènes dans la rétine par des vecteurs lentiviraux lors de maladies dégénératives de la rétine

Certaines dégénérescences rétiniennes sont engendrées par des mutations¦génétiques et conduisent à la perte des cellules photosensibles, les¦photorécepteurs (cônes et/ou bâtonnets), et donc à la cécité (Roy et al., 2010).¦La prévalence est de 1/3000 chez les Caucasiens. Les Rétinites Pigmentaires¦(RP) en composent la majorité des cas, suivent l'Amaurose congénitale de¦Leber et la maladie de Stargardt. Il n'y a pas une mutation type associés à une¦maladie mais diverses mutations peuvent aboutir à une dégénérescence de la¦rétine. Tout comme le reste du système nerveux central, la rétine lésée n'a pas¦les capacités de se régénérer. Un objectif du traitement est de ralentir la¦dégénérescence de la rétine dans le but de la stabiliser. La thérapie génique¦constitue actuellement la seule approche thérapeutique à même de traiter les¦dégénérescences rétiniennes d'origine génétique. Elle consiste à utiliser un virus¦modifié, qui n'a plus les capacités de se reproduire, appelé vecteur pour cibler¦certaines cellules afin d'ajouter un gène sain ou d'inhiber un gène malade. Les¦virus associés à l'adénovirus (AAV) et les Lentivirus (LV) sont les 2 principaux¦types de virus utilisés en thérapie génique en ophtalmologie. D'autres vecteurs¦existent, comme les adénovirus et le virus de l'anémie infectieuse équine. Des¦études de thérapie génique effectuées chez l'homme avec le vecteur AAV ont¦démontré une sensible amélioration des fonctions visuelles (acuité visuelle,¦champ visuel, pupillométrie et le déplacement dans un environnement avec une¦lumière tamisée) chez des patients atteints d'Amaurose congénitale de Leber¦(Maguire et al., Ali et al., Hauswirth et al., Bennett et al.). Le vecteur utilisé au¦cours de ce travail est un LV, qui a pour avantage de pouvoir transporter de¦grands gènes. Lorsque ce vecteur est pseudotypé avec une enveloppe VSVG, il¦transduit (transférer un gène qui sera fonctionnel dans la cellule cible) bien¦l'épithélium pigmentaire rétinien (nécessaire à la survie et à la fonction des¦photorécepteurs). Afin de changer le tropisme du vecteur, celui testé dans cette¦étude contient une enveloppe de type Mokola qui cible efficacement les cellules¦gliales du cerveau et donc probablement aussi les cellules de Müller de la rétine.¦Le but à court terme est de transformer génétiquement ces cellules pour leur¦faire sécréter des molécules favorisant la survie des photorécepteurs. Pour¦révéler la cellule ciblée par le vecteur, le gène qui sera exprimé dans les cellules¦transduites code pour la protéine fluorescente verte 2 (GFPII) et n'a pas de¦fonction thérapeutique. Après avoir produit le virus, deux types de souris ont été¦injectées : des souris dépourvues du gène de la rhodopsine appelées Rho -/- et¦des souris sauvages appelées C57BL6. Les souris Rho -/- ont été choisies en¦tant que modèle de dégénérescence rétinienne et les souris C57BL6 en tant que¦comparatif. Les souris Rho -/- et C57BL56 ont été injectées entre le 2ème et le¦3ème mois de vie et sacrifiées 7 jours après. Des coupes histologiques de la rétine¦ont permis de mesurer et comparer pour chaque oeil, les distances de¦transduction du RPE et de la neurorétine (= toute la rétine sauf le RPE). La¦distance sur laquelle le RPE est transduit détermine la taille de la bulle¦d'injection alors que la distance sur laquelle la neurorétine est transduite¦détermine la capacité du vecteur à diffuser dans la rétine. Les résultats montrent¦une expression plus importante de la GFPII dans le RPE que dans la neurorétine¦chez les souris Rho -/- et C57BL6. Les principales cellules transduites au¦niveau de la neurorétine sont, comme attendu, les cellules de Müller. Lorsque¦l'on compare les proportions de neurorétine et de RPE transduites, on constate¦qu'il y a globalement eu une meilleure transduction chez les souris Rho -/-¦que chez les souris C57BL6. Cela signifie que le vecteur est plus efficace pour¦transduire une rétine dégénérée qu'une rétine saine. Pour déterminer quels types¦de cellules exprimaient la GFPII, des anticorps spécifiques de certains types de¦cellules ont été utilisés. Ces résultats sont similaires à ceux d'autres études¦effectuées précédemment, dont celle de Calame et al. en 2011, et tendent à¦prouver que le vecteur lentiviral avec l'enveloppe Mokola et le promoteur EFs¦est idéal pour transduire avec un gène thérapeutique des cellules de Müller dans¦des rétines en dégénérescence.

Molecular mechanisms for the regulation of skin homeostasis

L'ubiquitination est une modification des protéines conservée, consistant en l'addition de résidus « ubiquitine » et régulant le destin cellulaire des protéines. La protéine « TRAF-interacting protein » TRAIP (ou TRIP) est une ligase E3 qui catalyse l'étape finale de l'ubiquitination. TRAIP est conservé dans l'évolution et est nécessaire au développement des organismes puisque l'ablation de TRAIP conduit à la mort embryonnaire aussi bien de la drosophile que de la souris. De plus, la réduction de l'expression de TRAIP dans des kératinocytes épidermiques humains réprime la prolifération cellulaire et induit un arrêt du cycle cellulaire en phase Gl, soulignant le lien étroit entre TRAIP et la prolifération cellulaire. Comme les mécanismes de régulation de la prolifération jouent un rôle majeur dans l'homéostasie de la peau, il est important de caractériser la fonction de TRAIP dans ces mécanismes. En utilisant des approches in vitro, nous avons déterminé que la protéine TRAIP est instable, modifiée par l'addition d'ubiquitine et ayant une demi-vie d'environ 4 heures. Nos analyses ont également révélé que l'expression de TRAIP est dépendante du cycle cellulaire, atteignant un pic d'expression en phase G2/M et que l'induction de son expression s'effectue principalement au cours de la transition Gl/S. Nous avons identifié le facteur de transcription E2F1 comme en étant le responsable, en régulant directement le promoteur de TRAIP. Aussi, TRAIP endogène ou surexprimée est surtout localisée au niveau du nucléole, une organelle nucléaire qui est désassemblée pendant la division cellulaire. Pour examiner la localisation subcellulaire de TRAIP pendant la mitose, nous avons imagé la protéine TRAIP fusionnée à une protéine fluorescente, à l'intérieur de cellules vivantes nommées HeLa, à l'aide d'un microscope confocal. Dans ces conditions, TRAIP est majoritairement localisée autour des chromosomes en début de mitose, puis est arrangée au niveau de l'ADN chromosomique en fin de mitose. La détection de TRAIP endogène à l'aide d'un anticorps spécifique a confirmé cette localisation. Enfin, l'inactivation de TRAIP dans les cellules HeLa par interférence ARN a inhibé leur capacité à s'arrêter en milieu de mitose. Nos résultats suggèrent que le mécanisme sous-jacent peut être lié au point de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique. - Ubiquitination of proteins is a post-translational modification which decides the cellular fate of the protein. The TRAF-interacting protein (TRAIP, TRIP) functions as an E3 ubiquitin ligase mediating addition of ubiquitin moieties to proteins. TRAIP interacts with the deubiquitinase CYLD, a tumor suppressor whose functional inactivation leads to skin appendage tumors. TRAIP is required for early embryonic development since removal of TRAIP either in Drosophila or mice by mutations or knock¬out is lethal due to aberrant regulation of cell proliferation and apoptosis. Furthermore, shRNA- mediated knock-down of TRAIP in human epidermal keratinocytes (HEK) repressed cell proliferation and induced a Gl/S phase block in the cell cycle. Additionally, TRAIP expression is strongly down- regulated during keratinocyte differentiation supporting the notion of a tight link between TRAIP and cell proliferation. We thus examined the biological functions of TRAIP in epithelial cell proliferation. Using an in vitro approach, we could determine that the TRAIP protein is unstable, modified by addition of ubiquitin moieties after translation and exhibits a half-life of 3.7+/-1-6 hours. Our analysis revealed that the TRAIP expression is modulated in a cell-cycle dependent manner, reaching a maximum expression level in G2/M phases. In addition, the expression of TRAIP was particularly activated during Gl/S phase transition and we could identify the transcription factor E2F1 as an activator of the TRAIP gene promoter. Both endogenous and over-expressed TRAIP mainly localized to the nucleolus, a nuclear organelle which is disassembled during cell division. To examine the subcellular localization of TRAIP during M phase, we performed confocal live-cell imaging of a functional fluorescent protein TRAIP-GFP in HeLa cells. TRAIP was distributed in the cytoplasm and accumulated around mitotic chromosomes in pro- and meta-phasic cells. TRAIP was then confined to chromosomal DNA location in anaphase and later phases of mitosis. Immune-detection of endogenous TRAIP protein confirmed its particular localization in mitosis. Finally, inactivating TRAIP expression in HeLa cells using RNA interference abrogated the cells ability to stop or delay mitosis progression. Our results suggested that TRAIP may involve the spindle assembly checkpoint.

AFT3 as a new therapeutic target for skin field cancerization in antagonism with compromised Notch/CSL signaling

Les interactions épithélio-mésenchymateuses jouent un rôle important dans le contrôle du développement normal de la peau, son homéostasie et sa tumorigenèse. Les fibroblastes dermiques (DFs) représentent la catégorie cellulaire la plus abondante dans le stroma et leur rôle est de plus en plus considéré. En ce qui concerne particulièrement la tumorigenèse, des facteurs diffusibles produits par les fibroblastes entourant les tumeurs épithéliales, appelés 'fibroblastes associés au cancer (CAF)', interagissent au niveau de l'inflammation impliquée directement ou indirectement dans la signalisation paracrine, entre le stroma et les cellules épiéliales cancéreuses. Le risque de cancer de la peau augmente de façon exponentielle avec l'âge. Comme un lien probable entre les deux, la sénescence des fibroblastes résulte de la production du sécrétome favorisant la sénescence (SMS), un groupe de facteurs diffusibles induisant une stimulation paracrine de la croissance, l'inflammation et le remodelage de la matrice. De façon fort intéressante, l'induction de ces gènes est aussi une caractéristique des CAFs. Cependant, le lien entre les deux événements cellulaires sénescence et activation des CAFs reste en grande partie inexploré. L'ATF3 (Activating Transcription Factor 3) est un facteur de transcription induit en réponse au stress, dont les fonctions sont hautement spécifiques du type cellulaire. Bien qu'il ait été découvert dans notre laboratoire en tant que promoteur de tumeurs dans les kératinocytes, ses fonctions biologique et biochimique dans le derme n'ont pas encore été étudiées. Récemment, nous avons constaté que, chez la souris, l'abrogation de la voie de signalisation de Notch/CSL dans les DFs, induisait la formation de tumeurs kératinocytaires multifocales. Ces dernières proviennent de la cancérisation en domaine, un phénomène associé à une atrophie du stroma, des altérations de la matrice et de l'inflammation. D'autres études ont montré que CSL agissait comme un régulateur négatif de gènes impliqués dans sénescence des DFs et dans l'activation des CAFs. Ici, nous montrons que la suppression ou l'atténuation de l'expression de ATF3 dans les DFs induit la sénescence et l'expression des gènes liés aux CAFs, de façon similaire à celle déclenchée par la perte de CSL, tandis que la surexpression de ATF3 supprime ces changements. Nous émettons l'hypothèse que ATF3 joue un rôle suppresseur dans l'activation des CAFs et dans la progression des tumeurs kératinocytaires, en surmontant les conséquences de l'abrogation de la voie de signalisation Notch/CSL. En concordance avec cette hypothèse, nous avons constaté que la perte de ATF3 dans les DFs favorisait la tumorigénicité des kératinocytes via le contrôle négatif de cytokines, des enzymes de la matrice de remodelage et de protéines associées au cancer, peut-être par liaison directe des effecteurs de la voie Notch/CSL : IL6 et les gènes Hes. Enfin, dans les échantillons cliniques humains, le stroma sous-jacent aux lésions précancéreuses de kératoses actiniques montre une diminution significative de l'expression de ATF3 par rapport au stroma jouxtant la peau normale. La restauration de l'expression de ATF3 pourrait être utilisée comme un outil thérapeutique en recherche translationnelle pour prévenir ou réprimer le processus de cancérisation en domaine. - Epithelial-mesenchymal interactions play an important role in control of normal skin development, homeostasis and tumorigenesis. The role of dermal fibroblasts (DFs) as the most abundant cell type in stroma is increasingly appreciated. Especially during tumorigenesis, fibroblasts surrounding epithelial tumors, called Cancer Associated Fibroblasts (CAFs), produce diffusible factors (growth factors, inflammatory cytokines, chemokines and enzymes, and matrix metalloproteinases) that mediate inflammation either directly or indirectly through paracrine signaling between stroma and epithelial cancer cells. The risk of skin cancer increases exponentially with age. As a likely link between the two, senescence of fibroblasts results in production of the senescence-messaging-secretome (SMS), a panel of diffusible factors inducing paracrine growth stimulation, inflammation, and matrix remodeling. Interestingly, induction of these genes is also a characteristic of Cancer Associated Fibroblasts (CAFs). However, the link between the two cellular events, senescence and CAF activation is largely unexplored. ATF3 is a key stress response transcription factor with highly cell type specific functions, which has been discovered as a tumor promoter in keratinocytes in our lab. However, the biological and biochemical function of ATF3 in the dermal compartment of the skin has not been studied yet. Recently, we found that compromised Notch/CSL signaling in dermal fibroblasts (DFs) in mice is a primary cause of multifocal keratinocyte tumors called field cancerization associated with stromal atrophy, matrix alterations and inflammation. Further studies showed that CSL functions as a negative regulator of genes involved in DFs senescence and CAF activation. Here, we show that deletion or silencing of the ATF3 gene in DFs activates senescence and CAF-related gene expression similar to that triggered by loss of CSL, while increased ATF3 suppresses these changes. We hypothesize that ATF3 plays a suppressing role in CAF activation and keratinocyte tumor progression, overcoming the consequences of compromised Notch/CSL signaling. In support of this hypothesis, we found that loss of ATF3 in DFs promotes tumorigenic behavior of keratinocytes via negative control of cytokines, matrix-remodeling enzymes and cancer-associated proteins, possibly through direct binding to Notch/CSL targets, IL6 and Hes genes. On the other hand, in human clinical samples, stromal fields underlying premalignant actinic keratosis lesions showed significantly decreased ATF3 expression relative to stroma of flanking normal skin. Restoration of ATF3, which is lost in cancer development, may be used as a therapeutic tool for translational research to prevent or suppress the field cancerization process.

Role of microRNAs in the pathogenesis of Ewing's sarcoma

SummaryEwing's sarcoma family tumors (ESFT) are the second most frequent cancer of bone in adolescents and young adults. ESFT are characterized by a chromosomal translocation that involves the 5' segment of the EWSR1 gene and the 3' segment of an ets transcription factor family member gene. In 85% of cases the chromosomal translocation generates the fusion protein EWSR1-FLI-1. Recent work from our laboratory identified mesenchymal stem cells (MSC) as the putative cell of origin of ESFT and characterized a CD133+ subpopulation of ESFT cells with tumor initating and self-renewal capacity, known as cancer stem cells (CSC). MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA that regulate protein expression at the post-transcriptional level by either repressing translation or destabilizing mRNA. MiRNAs participate in several biological processes including cell proliferation and differentiation. We used miRNA expression profile comparison between MSC and ESFT cell lines and CD133+ ESFT cells and CD133" ESFT cells to investigate the role of miRNAs in ESFT pathogenesis. MiRNA expression profile comparison of MSC and ESFT cell lines identified 35 differentially expressed miRNAs. Among these was down-regulation of let-7a which results, in part, by the direct repression of let-7a-l promoter by EWSR1-FLI-1. Overexpression of let-7a in ESFT cells blocked ESFT tumorigenesis through an High-motility group AT-hook2 (HMGA2)-mediated mechanism.MiRNA profiling of CD133+ ESFT and CD 133" ESFT cells revealed a broad repression of miRNAs in CD133+ ESFT mediated by down-regulation of TARBP2, a central regulator of the miRNA maturation pathway. Down-regulation of TARBP2 in ESFT cell lines results in a miRNA expression profile reminescent of that observed in CD133+ ESFT and associated with increased tumorigenicity. Enhancement of TARBP2 activity using the antibiotic enoxacin or overexpression of miRNA-143 or miRNA-145, two targets of TARBP2, impaired ESFT CSC self-renewal and block ESFT tumorigenicity. Moreover in vivo administration of synthetic let- 7a, miRNA-143 or miRNA-145 blocks ESFT tumor growth.Thus, dysregulation of miRNA expression is a key feature in ESFT pathogenesis and restoration of their expressions might be used as a new therapeutic tool.RésuméLe sarcome d'Ewing est la deuxième tumeur osseuse la plus fréquente chez l'enfant et le jeune adolescent. Le sarcome d'Ewing est caractérisé par une translocation chromosomique qui produit une protéine de fusion EWSR1-FLI-1. Des récents travaux ont identifié les cellules mésenchymateuses souches (MSC) comme étant les cellules à l'origine du sarcome d'Ewing ainsi qu'une sous-population de cellules exprimant le marqueur CD 133, dans le sarcome d'Ewing connu comme les cellules cancéreuses souches (CSC). Ces cellules ont la capacité d'initier la croissance tumorale et possèdent des propriétés d'auto-renouvellement. Les microRNAs (miRNAs) sont de petits ARN qui ne codent pas pour des protéines et qui contrôlent l'expression des protéines en bloquant la traduction ou en dégradant l'ARNm. Les miRNAs participent à différents processus biologiques comme la prolifération et la différenciation cellulaires.Le but de ce travail est d'étudier le rôle des miRNAs dans le sarcome d'Ewing. Un profil d'expression de miRNAs entre les MSC et des lignées cellulaires de sarcome d'Ewing a mis en évidence 35 miRNAs différemment exprimés. Parmi ceux-ci, la répression de let-7a est liée à la répression directe du promoteur de let-7a-l par EWSR-FLI-1. La sur-expression de let-7a dans des lignées cellulaires de sarcome d'Ewing inhibe leur croissance tumorale. Cette inhibition de croissance tumorale est régulée par la protéine high-motility group AT-hook2 (HMGA2).Un profil d'expression de miRNAs entre les cellules du sarcome d'Ewing CD133+ et CD133" montre une sous-expression d'un grand nombre de miRNAs dans les cellules CD133+ par rapport aux cellules CD133". Cette différence d'expression de miRNAs est due à la répression du gène TARBP2 qui participe à la maturation des miRNAs. La suppression de TARBP2 dans des cellules d'Ewing induit un profil d'expression de miRNAs similaire aux cellules CD133+ du sarcome d'Ewing et augmente la tumorigenèse des lignées cellulaires. De plus l'utilisation d'enoxacin, une molécule qui augmente l'activité de TARBP2 ou la sur- expression des miRNA143 ou miRNA-145 dans les CSC du sarcome d'Ewing bloque l'auto- renouvellement des cellules et la croissance tumorale. Finalement, l'administration de let-7a, miRNA-143 ou miRNA-145, dans des souris bloque la croissance du sarcome d'Ewing. Ces résultats indiquent que la dysrégulation des miRNAs participe à la pathogenèse du sarcome d'Ewing et que les miRNAs peuvent être utilisés comme des agents thérapeutiques.

Recueil de lettres et pièces originales, et de copies de pièces indiquées comme telles dans le dépouillement qui suit.

Contient : 1 Lettre de GASPARD Ier DE COLIGNY, maréchal DE « CHASTILLON », à François Ier. « A Reims, le XIme jour de septembre » 1521 ; 2 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... au roy mon souverain seigneur... En vostre camp à Athigny sur Ayne, le 6me jour de juillet » 1521 ; 3 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... au roy mon souverain seigneur... A Reims, le Xme jour d'aoust » 1521 ; 4 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON » au roi. « A Reims, le IIIme jour d'aoust » 1521 ; 5 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... au roy mon souverain seigneur... Escript en vostre camp à Athigny sur Ayne. Juillet 1521 ; 6 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON » au roi. « A Reims, le VIIIme jour d'aoust » 1521 ; 7 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... au roy mon souverain seigneur... A Herpy, le Vme jour d'octobre » 1521 ; 8 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... à Monsei gneur... A Rethel, le XXVme jour de septembre » 1521 ; 9 Lettre du SrDE « FROMANTES [GASPARD Ier DE COLIGNY].. à monseigneur de Salygny, mon bon cousin... C'est à Froman??? tes, ce IIIe de novambre » ; 10 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... à monseigneur l??? tresorier Robertet, Sr d'Aluye,... A Athigny, le XXVIm??? jour de juillet » 1521 ; 11 Lettre du Sr « DE LOGES,... à monseigneur de Chastillon, mareschal de France... Au chasteau de Tournay le premier jour de juillet » ; 12 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... à monseigneur le tresorier Robertet, Sr d'Aluye,... A Reims, le Xme d'aoust 1521 ; 13 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... à monseigneur le tresorier Robertet,... A Reims, le VIIIe d'aoust » 1521 ; 14 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... à monseigneur le tresorier Robertet,... A Reims, le IIIIme jour d'aoust » 1521 ; 15 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... à monseigneur le??? tresorier Robertet,... A Reims, le XIme jour de septembre » 1521 ; 16 « Roolle des gentilzhommes, dames, damoiselles et officiers de la royne [Marguerite] de Navarre, pour l'année commencée le premier jour de janvier mil cinq cens vingt huit et finissant le dernier jour de decembre mil cinq cens vingt neuf, baillé à maistre Guy Gantier, tresorier et receveur general des finances de ladicte dame, pour en faire les payemens aux personnes » ; 17 Lettre du maréchal DE « CHASTILLON,... au roy mon souverain seigneur... A Reims, le IIIIe jour d'aoust » 1521 ; 18 « Previllege octroyé par le roy [FRANÇOIS Ier] aux vingt quatre conseillers de sa ville et cité de Paris... Donné à Loches, au moys de novembre » 1536. Copie ; 19 « Advertissemenz » envoyés au maréchal de Châtillon sur les projets des impériaux. « Du vendredy IIme jour d'aoust » 1521 ; 20 Extraits de dépêches contenant des nouvelles de Rome, des 2, 4, 5 et 11 octobre ; 21 « Roolle de ceulx que l'on doit confiner de Millan en France » ; 22 Note secrète, dans laquelle on offre à François Ier, moyennant une somme d'argent, d'entretenir à son profit la guerre entre l'Écosse et l'Angleterre. Vers 1544 ; 23 Lettre d'«ODET DE FOIX [maréchal] DE LAUTREC, au roy, du XIIe de novembre ». Copie ; 24 « Ordonnance » de « FRANÇOYS [Ier] sur la gendarmerie... Fait à Lyon, le neufiesme jour de may mil V.C. vingt et deux » ; 25 Lettre d'ODET DE FOIX, maréchal DE LAUTREC, au roi. « Au camp à Robec (Rebecco), le XVIIIe jour d'octobre » ; 26 Donation par « CATHERINE » DE MEDICIS au cardinal Hippolyte de Ferrare de « tout le territoire scitué entre Terracine, Piperne et Sezze ». Copie ; 27 Lettres de créance données par « FRANÇOYS » Ier au « Sr de Bonnyvet, admiral de France », envoyé en qualité de lieutenant général en Italie, 1523 ; 28 « Advertissement au roy des entreprinses et nouvelletez faictes par l'ordonnance de monseigneur de Seden [Robert II de La Marck, duc de Bouillon] sur les droiz, preeminences et prerogatives qui lui appartiennent à cause de sa ville, terre et seigneurie de Mouzon ». 1520 ; 29 Lettre de « messrs DE CARPY et DE ST-MARSAULT au roy... De Rome, ce IIIe jour de mars MV.C???.XXIIII ». Copie ; 30 Résumé d'une dépêche de Rome, du 14 septembre ; 31 Lettre d'ODET DE FOIX, « mareschal DE LAUTREC, au roy... A Castyon, le XXXe jour de juillet mil V.C.XVI ». Copie ; 32 Lettre de « FRANÇOYS [Ier]... à mon cousin le grant maistre... Escript à Lariere, le XIXme jour de juillet » ; 33 Lettre des députés des huit cantons suisses de la grande ligue à René, bâtard de Savoye, sénéchal de Provence. De Berne, le 4 août 1516 ; 34 Lettres de MAXIMILIEN SFORCE, duc DE MILAN, par lesquelles il accorde une pension mensuelle de quarante écus à douze députés des cantons suisses. « Datum Mediolani, die primo julii millesimo quingentesimo decimo quinto » ; 35 Lettres de MAXIMILIEN SFORCE, duc DE MILAN, par lesquelles il donne une pension mensuelle au vogt Richmot, député du canton de Schwitz. A Milan, le 1er juillet 1515 ; 36 « Double du premier traicté de mariage de madame Renée [de France] et de [Joachim], filz aisné du marquis de Brandebourg ». En latin ; 37 Second Traité de mariage de Renée de France avec Joachim, marquis de Brandebourg. 26 mars 1519. En latin. Copie ; 38 Lettres de JOACHIM, marquis DE BRANDEBOURG, par lesquelles il promet de donner sa voix à François Ier, lors de l'élection pour l'empire. « Date in castro nostro Colonio ad Spream, die octava mensis aprilis anno » 1519 ; 39 Lettre de JOACHIM, marquis DE BRANDEBOURG, à l'amiral de Bonnivet. « Vendredi, une heure apres midi, 1519 » ; 40 Lettre d'ODET DE FOIX, maréchal « DE LAUTREC, au roy... Escript à Question, ce XXVIe jour de juillet » ; 41 Lettre de « FRANÇOYS [Ier]... à mon cousin le duc de Suffort,... A Sainct Germain en Laye, le XIXe jour d'avril » ; 42 « Double de la letre que monseigneur DE LAUTRECT escript au roy... Au camp de St Second, le XXIe jour de septembre » ; 43 « Double de la letre que le roy [FRANÇOIS Ier] escript à monseigneur de Lautret,... De Lariere, le XIXe jour de juillet » ; 44 Lettres closes de « FRANÇOYS [Ier]... à noz amez et feaulx advocat et procureur en nostre chambre des comptes à Paris... Donné à Tharascon, le XVIe jour de may mil V.C.XXXVIII » ; 45 Lettres closes de « FRANÇOYS [Ier]... à noz amez et feaulx les gens de noz comptes à Paris... Donné à Tharascon, le XVIe jour de may mil V.C.XXXVIII » ; 46 « Articles de l'election » de Henri, duc d'Anjou, au trône de Pologne. 1573 ; 47 Bref du pape CLEMENT VII à Louise de Savoie, duchesse d'Angoulême. « Datum Romae, die XXI decembris M.D.XXIII » ; 48 « Double de letres de [GUILLAUME BRIÇONNET], evesque de St Malo, au roy... A Rome, le XIXe d'apvril » ; 49 Lettre de GUILLAUME BRIÇONNET, « evesque de St Malo... au roy mon souverain seigneur... Escript à Rome, le XXIXe janvier » ; 50 « Article extraict de la letre » de G. BRIÇONNET, évêque de Saint-Malo, « au roy, du VIIe Xbre » ; 51 Lettre des grand et petit conseil de la ville de Berne aux députés bernois près le roi François Ier. « Datum uff dem Uffarttag anno [MD]XXIIII° ». En allemand ; 52 Récépissé d'une lettre de François Ier, donné par le « Statschrieber » de la ville d'Ulm, le 2 mai 1519. En allemand ; 53 Récépissé d'une lettre de François Ier adressée au sénat d'Augsbourg, donné par CONRAD « PEUTINGER », le 3 mai 1519. En latin ; 54 « Double des letres de messrs les ambassadeurs estans à Calais [ANTOINE DU PRAT, chancelier, JEAN DE SELYE et le maréchal DE CHABANNES] au roy. Aoust » 1521 ; 55 Lettre d'«ODET DE FOIX, [maréchal] DE LAUTREC », au roi. « Escript au camp de Saint Second, le XXVIIme jour de septembre ». Copie ; 56 « Double des lettres d[e JOACHIM], marquis DE BRANDEBOURG, à monseigneur l'admiral » de Bonnivet. « XVIIIe jung 1519 » ; 57 Lettre de Mrs « A[NTOINE] DE LAMET », ambassadeur près les cantons suisses, et « JEHAN PASTE,... au roy, nostre souverain seigneur... Escript à Lucerne, le XVIe jour d'avril » ; 58 « Coppie de l'obligation et seureté que monseigneur [Albert de Brandebourg, archevêque] de Mayence, veult??? avoir du roy » ; 59 « Autre Coppie d'autre obligation et promesse faicte par le roy audict Sr de Mayence » ; 60 « Coppie de la promesse de l'arcevesque de Mayence faicte au roy » ; 61 « Autre Promesse et obligation dudict arcevesque de Mayence faicte au roy ». Copie ; 62 « Coppie des lettres d[e JOACHIM], marquis DE BRANDEBOURG, pour bailler au roy », par lesquelles il consent à ajourner le payement d'une partie de la somme que François Ier s'était engagé à lui payer après l'élection du roi des Romains ; 63 « Promesse faicte par ledit marquis au roy de l'eslire, pourveu que deux autres ses coeslecteurs ayant voix devant luy, le eslisent et luy donnent leurs voix ». Copie ; 64 Lettres de « FRANÇOIS » Ier, par lesquelles il s'engage, s'il est élu roi des Romains, à nommer Joachim, marquis de Brandebourg, son lieutenant et promoteur en Allemagne. Copie ; 65 « Coppie de la promesse que le roy [FRANÇOIS Ier] fait au marquis de Brandebourg, pour sa pension » ; 66 Récépissé de lettres de François Ier adressées au sénat de la ville de Ratisbonne, le 6 mai 1529. En latin ; 67 Lettre de « FRANÇOYS [Ier]... à madame [Louise de Savoie]... 1521, en octobre » ; 68 « Double de la lettre que monseigneur [LOUIS II] DE LA TREMOILLE, escript à Madame... Du camp pres Valenciennes, ce XXIIIe jour d'octobre » ; 69 Lettre de « FRANÇOYS [Ier]... à mon cousin le grand maistre et à messrs de Paris et president Olivier,... Escript à Briarre, le IIIIme jour d'aoust » ; 70 Minute d'un mémoire, dans lequel on cherche « les moyens d'amitié, alliance et intelligence entre le roy tres chrestien [François Ier], d'une part, et le roy catholique, d'autre » ; 71 Instructions de « FRANÇOYS » Ier relatives aux renforts qu'il se propose de faire passer en Italie. « Faict à Bloys, le XVIIIme jour de janvier, l'an mil V.C.XXIII » ; 72 Lettre des « orateurs des ligues assemblez [à Lucerne]... au roy... Escript à Lucerne, le XVIe jour de janvier, l'an mil V.C.XXIII ». Copie ; 73 Lettre d'«ERNEST, duc DE LUNEMBOURG » et « JOACHIN » DE BRANDEBOURG à François Ier. « Escript la veille de Sainct Pol, au matin à cinq heures ». Copie ; 74 « Translat des lettres d'[ERNEST], filz du duc DE LUNEMBOURG, à monseigneur le chancelier... A Celles, le XXVIIIe de janvier » ; 75 « Double du traicté de Noyon, fait entre les ambassadeurs » de François Ier et ceux « du roy catholique... En la ville et cité de Noyon, le XIIIe jour d'aoust » 1516 ; 76 « Lettre de monseigneur le conte DE CARPY,... à monseigneur l'admiral... De Rome, ce IIIIe jour de janvier M.V.C.XXIIII ». Copie ; 77 Lettre des « cardinaulx [LOUIS DE] BOURBON » VENDOME et JEAN DE « LORRAINE,... à monseigneur l'admiral, lieutenant general du roy en Italye... De Rome, ce XXXe jour de decembre M.V.C.XXIIII » ; 78 Lettre de Mrs « DE CARPY et DE ST MARSAULT à monseigneur l'admiral... De Rome, ce IXe jour de mars M.V.C.XXIIII ». Copie ; 79 Lettre de « LOYSE [DE SAVOYE]... à mon cousin monseigneur l'admyral... Escript à St Germain en Laye, le XIIe jour de may ». Copie ; 80 Lettre des Srs « DUPLESSEYS » et « A. LE ROY,... à monseigneur le grant maistre... A Berne, le XVIIe jour de juillet » ; 81 « Lettre de monseigneur le conte DE CARPY à monseigneur de St Marsault,... De Rome, ce Ve jour de janvier M.V.C.XXIIII ». Copie ; 82 Mémoire du « conte EYTEL FEDRICH DE ZOLLERN », contenant les propositions qu'il désire faire au roi ; 83 Lettre de « CHARLES [III, duc DE SAVOYE]... à monseigneur l'admiral mon cousin... A Geneve, le XXVIe de janvier » ; 84 Lettre de « HENRY [II], roy de Navarre,... à mon cousin monseigneur l'admyral... A Sauveterre, le XXIe jour de septembre » ; 85 Lettre d'«A[NTOINE] DE LAMET [ambassadeur près les cantons suisses]... Escript à Lusserne, ce XVIe jour d'avril » ; 86 Lettre de « GALEAS BIRAGO [all'] exmo monsigre l'armiraglio... Datta a Turino, die XVIIII° martii 1523 ». En italien ; 87 Lettre de « FRANÇOYS [Ier]... à messrs l'admiral et mareschal de Montmorency,... Escript à Lyon, le XXVIIe jour d'octobre » ; 88 Lettre des « orateurs des Ligues, assemblez » à Lucerne, « à monsegneur l'admiral et monsegneur le mareschal de France... Escript à Lucerne, le IIe jour de fevrier, l'an mille cinq cens et XXIIII » ; 89 Lettre du cardinal ANTOINE « DUPRAT,... à messrs les grant maistre, evesque de Paris et president Olivyer,... A Briarre, le IIIe aoust ». Copie ; 90 Lettre de « GALEAS BIRAGO » et « BERNARDINO VESCONTE,... a lo illmo et exmo monre lo admirallo... Datum in Novara, die 4 februarii 1524 ». En italien ; 91 Lettre du marquis « DE PESCARA,... all' ill° segnore el almirante de Franza... De Milano, a III de febraro de M.D.XXIIII ». En italien ; 92 Lettre de « RYCHARD SUFFOLK,... à monseigneur mon cousin, monseigneur de Boisy, grant maistre de France... A Metz, ce XVIe juillet » ; 93 Lettre d'«A[DRIEN] DE CROY,... à monseigneur de Boisy, grant maistre de France... Escript à Heure, le Xe jour de septembre » ; 94 Lettre des « orateurs des Ligues assemblez » à Lucerne « à... monsegneur l'admyral et monsegneur le mareschal de France... Escript à Lucerne, ce XVIe jour de janvier » 1524 ; 95 Lettre de « JACQUES DE DAILLON, [baron] DU LUDE,... à monseigneur l'admiral... De Fontarrabie, ce XXXe jour de decembre » ; 96 Lettre de la reine « CLAUDE [DE FRANCE]... à monseigneur l'admiral... De St Germain, le XVIe jour d'avril » ; 97 Lettre d'«A[NTOINE] DE LAMET,... à monseigneur l'amyral... A Lusserne, ce XIIIIe jour d'avril » ; 98 Lettre des « maire, eschevyns, conseillers et pers de la ville de La Rochelle... à monseigneur de Bonyvet, admiral de France... De La Rochelle, ce XIIme jour de decembre » ; 99 Lettre de « FRANÇOYS [Ier]... à messrs l'admiral et mareschal de Montmorency,... Escript à Lyon, le XXIIe jour d'octobre » ; 100 « Minutte d'une lettre d'un seigneur DE GRAMONT au roy... Escript à Navarrencs, aoust » ; 101 Lettre d'«ODET DE FOYX, [maréchal] DE LAUTREC,... à monseigneur le grant maistre... A Castion, ce XIIIe jour de juillet » ; 102 Lettre de THOMAS WOLSEY, cardinal archevêque d'Yorck, « à monseigneur de Bonnyvet, admiral de France... De Hamptoncourt, le IXme jour de decembre » ; 103 Lettre de la reine « LOYSE [DE SAVOIE]... à monseigneur l'amyral ». Octobre 1522 ; 104 Lettre de « LOYSE [DE SAVOIE]... à mon cousin le Sr de Bonnyvet, admyral de France... Escript de Meaulx, ce IIe jour d'octobre » 1522 ; 105 « Double du dechifrement venu de monseigneur D'AUX à Venise... De Rome, ce sixme de may » ; 106 Lettre de FRANÇOIS-MARIE DE LA ROVERE, « duca D'URBINO,... all' illmo monseigneur l'amiraglio di Franza... In Martinengo, alli XIIII di novembre 1523 ». En italien ; 107 « Advertissement de Rome par lettres du XIIIIe d'octobre » ; 108 « Sommaire de la depesche d'Espaigne... Du IIIe juillet ». Copie ; 109 Lettre contenant des renseignements sur les forces de Charles Ier, roi de Castille, et des nouvelles de sa cour dans les Pays-Bas ; 110 « Advertissement » d'Espagne, dans lequel on annonce une expédition projetée par les Espagnols contre l'île de Ré et Belle-Isle. Vers 1523 ; 111 Lettre d'«ANDREA BIRRAGO,... allo illmo monsigre lo almirago... In Asula, 21 decembre 1522 ». En italien ; 112 Lettre d'ANDREA BIRAGO à l'amiral de Bonnivet. En italien ; 113 Lettre de « N[ICOLAS] RAINCE à monseigneur l'admiral... De Rome, ce samedy Ve jour de mars M.V.C.XXIIII » ; 114 Lettre de « J[EAN] DE PINS,... à monseigneur l'admiral... De Romme, ce Vme de fevvrier » ; 115 Lettre du chancelier « A[NTOINE] DUPRAT,... à monseigneur l'admiral... A Calais, le VIe jour d'aoust » ; 116 Lettre d'«ANDREA BIRRAGO,... allo illmo monsignore lo almirago... In Asula, 7 januarii 1523 ». En italien ; 117 Lettre d'«ODET DE FOIX [maréchal DE LAUTREC]... à monsieur l'admiral, gouverneur du Daulphiné... A Millan, le XVIe jour de fevrier » ; 118 Lettre de « PIERRE LIZET,... à monseigneur l'admiral... De Paris, ce VIIIe jour de janvier » ; 119 Lettre de « G[UILLAUME] DE MONTMORENCY,... à monseigneur l'amyral... Escript à Compienne, ce XXVIe d'octobre » 1522 ; 120 Lettre de « NICOLAS RAINCE,... à monseigneur l'admiral... De Rome, ce VIIIe jour de janvier M.V.C.XXIIII » ; 121 Lettre du comte « DE CARPI,... à monseigneur l'admiral... De Rome, ce VIIIe jour de janvier M.V.C.XXIIII » ; 122 Lettre de « THOMAS DE FOIX, [maréchal] DE LESCUN,... à monseigneur l'admiral... Au camp de St Second, ce XXIIIe jour de septembre » ; 123 Lettre d'«ODET DE FOIX, [maréchal] DE LAUTREC,... à monseigneur de Bonnyvet, admyral de France... Au camp de Saint Second, le XXIIIe jour de septembre » ; 124 Lettre de « FRANÇOYS [Ier]... à messrs l'admiral et mareschal de Montmorency,... Escript à Lyon, le XVIIme jour de septembre » ; 125 Fragment de lettre du duc DE SAVOIE. Copie ; 126 « Depesche de Rome, envoyée par monseigneur DE ST FERME, le huitme jour de juillet M.V.C.LVII, à monseigneur le conservateur de Naples ». Copie ; 127 Lettre de CATHERINE DE MEDICIS à « monseigneur de Selve », évêque de Saint-Flour, ambassadeur à Rome. Décembre 1557. Minute ; 128 Lettre de CATHERINE DE MEDICIS « à monseigneur le conservateur de Naples et au doyen de la rotte... De St Germain en Laye, ce... XVe jour de decembre 1557 ». Minute ; 129 Lettre de CATHERINE DE MEDICIS « à monseigneur de Selve, du XVe decembre 1557 ». Minute ; 130 Lettre de CATHERINE DE MEDICIS « à monseigneur le cardinal Strossy, du XVe decembre 1557 ». Minute ; 131 Lettre d'ÉTIENNE « BOUCHER,... à la royne » Catherine de Médicis. « De Rome, XXVe jour de novembre » 1557 ; 132 Lettre de CATHERINE DE MEDICIS « à monseigneur de Selve », ambassadeur à Rome, 1557. Minute ; 133 Lettre d'«A[NTOINE] DE LAMET,... à Madame... Escript à Lusserne, ce XVIe jour d'avril » ; 134 Lettre de CATHERINE DE MEDICIS, « à monseigneur le conte de Pellianne, du XXVIe octobre 1557 ». Minute ; 135 « Responce que l'empereur a faict à monseigneur le president sus les propos qu'il luy a tenu de la paix » ; 136 Lettre de « F[RANÇOIS], cardinal DE TOURNON,... à la royne, ma souveraine dame... De Monceaulx, ce premier jour de may 1561 » ; 137 Lettre de « F[RANÇOIS], cardinal DE TOURNON,... à la royne, mere du roy... De Romme, ce XVIIIe d'apvril 1560 » ; 138 Lettre de FLORIMOND « ROBERTET » à Catherine de Médicis. « De Fontainebleau, ce XVIIIe jour de juillet 1560 » ; 139 Lettre du cardinal « VITELLO,... alla sacra christianissima regal Maesta della regina di Francia... Di Roma, il primo di genaro M.D.LX ». En italien

Régulation de la lipoprotéine lipase macrophagique et de LOX-1 par des facteurs métaboliques. Implications dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans les pays occidentaux et constituent la principale complication associée au diabète. La lipoprotéine lipase (LPL) est une enzyme clé du métabolisme des lipides et est responsable de l'hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Plusieurs études ont démontré que la LPL sécrétée par les macrophages dans la paroi artérielle est pro-athérogénique. La dysfonction endothéliale caractérise les stades précoces du processus athérosclérotique. Il a été observé qu’un récepteur nouvellement identifié des lipoprotéines de basse densité oxydées (LDLox), le récepteur de type lectine des LDLox (LOX-1), est fortement exprimé dans les lésions athérosclérotiques humaines et dans l’aorte de rats diabétiques, suggérant un rôle clé de LOX-1 dans la pathogénèse de l’athérosclérose diabétique. Au vu du rôle potentiel de la LPL macrophagique et du LOX-1 dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2, nous avons évalué la régulation de ces deux molécules pro-athérogéniques par des facteurs métaboliques et inflammatoires augmentés dans le diabète, soit la leptine, l’acide linoléique (LA) et la protéine C-réactive (CRP). Nos résultats démontrent que : 1) Dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs), LA augmente l’expression protéique de LOX-1 de façon temps- et dose-dépendante; 2) La pré-incubation de HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la NADPH oxydase, de la protéine kinase C (PKC) et du facteur nucléaire-kappa B (NF-kB), inhibe l’effet stimulant de LA sur l’expression protéique de LOX-1; 3) Dans les HAECs traitées avec LA, on observe une augmentation d’expression des isoformes classiques de la PKC; 4) LA augmente de manière significative l’expression génique de LOX-1 ainsi que la liaison des protéines nucléaires extraites des HAECs à la séquence régulatrice NF-kB présente dans le promoteur du gène de LOX-1; 5) LA augmente, via LOX-1, la captation des LDLox par les cellules endothéliales. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que LA augmente l’expression endothéliale de LOX-1 in vitro et appuient le rôle clé de LA dans la dysfonction endothéliale associée au diabète. Au vu de nos études antérieures démontrant qu’une expression accrue de LPL macrophagique chez les patients diabétiques de type 2 et que l’augmentation de facteurs métaboliques dans cette maladie, soit l’homocystéine (Hcys), les acides gras et les produits terminaux de glycation (AGE), accroissent l’expression de la LPL macrophagique, nous avons par la suite déterminé l’effet, in vitro, de deux autres facteurs métaboliques et inflammatoires surexprimés dans le diabète, soit la leptine et la CRP, sur l’expression de la LPL macrophagique. Les concentrations plasmatiques de leptine sont élevées chez les patients diabétiques et sont associées à un accroissement des risques cardiovasculaires. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la leptine augmente l’expression de la LPL, tant au niveau génique que protéique; 2) L’effet stimulant de la leptine sur la LPL est aboli par la pré-incubation avec un anticorps dirigé contre les récepteurs à la leptine (Ob-R), des inhibiteurs de la PKC et des antioxydants; 3) La leptine augmente l’expression membranaire des isoformes classiques de la PKC et la diminution de l’expression endogène de la PKC, abolit l’effet de la leptine sur l’expression de la LPL macrophagique; 4) Dans les macrophages murins, la leptine augmente le taux de synthèse de la LPL et augmente la liaison de protéines nucléaires à la séquence protéine activée-1 (AP-1) du promoteur du gène de la LPL. Ces observations supportent la possibilité que la leptine puisse représenter un facteur stimulant de la LPL macrophagique dans le diabète. Finalement, nous avons déterminé, in vitro, l’effet de la CRP sur l’expression de la LPL macrophagique. La CRP est une molécule inflammatoire et un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires. Des concentrations élevées de CRP sérique sont documentées chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la CRP augmente l’expression de la LPL au niveau génique et protéique et la liaison de la CRP aux récepteurs CD32 est nécessaire pour médier ses effets; 2) La pré-incubation de macrophages humains avec des antioxydants, des inhibiteurs de la PKC et de la protéine kinase mitogénique activée (MAPK), prévient l’induction de la LPL par la CRP; 3) La CRP augmente l’activité de la LPL, la génération intracellulaire d’espèces radicalaires oxygénées (ROS), l’expression d’isoformes classiques de la PKC et la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées 1/2 (ERK 1/2); 4) Les macrophages murins traités avec la CRP démontrent une augmentation de la liaison des protéines nucléaires à la séquence AP-1 du promoteur du gène de la LPL. Ces données suggèrent que la LPL puisse représenter un nouveau facteur médiant les effets délétères de la CRP dans la vasculopathie diabétique. Dans l’ensemble nos études démontrent le rôle clé de facteurs métaboliques et inflammatoires dans la régulation vasculaire de la LPL et du LOX-1 dans le diabète. Nos données suggèrent que la LPL et le LOX-1 puissent représenter des contributeurs clé de l’athérogénèse accélérée associée au diabète chez l’humain. Mots-clés : athérosclérose, maladies cardiovasculaires, diabète de type 2, macrophage, LPL, cellules endothéliales, LOX-1, stress oxydatif, leptine, LA, CRP.

Caractérisation du produit du gène sty4221, unique à Salmonella enterica sérovar Typhi

Salmonella enterica sérovar Typhi (Typhi) est une bactérie pathogène spécifique à l’homme. Typhi est l’agent étiologique de la fièvre typhoïde chez l’humain, causant plus de 16 millions de nouveaux cas par année et plus de 600 000 morts. Il a été démontré que pour causer une infection systémique, Salmonella doit nécessairement survivre dans les macrophages de l'hôte. Paradoxalement, S. enterica sérovar Typhimurium, très apparenté à Typhi (près de 90 % d’homologie), n’a pas la capacité de se disséminer dans l’organisme humain et peut infecter plusieurs espèces animales. Nous avons antérieurement identifié 36 gènes uniques à Typhi (absents chez Typhimurium) situés sur 15 régions différentes et exprimés sélectivement lors de l’infection de macrophages humains. Ainsi, l’une de ces régions a suscité notre attention, soit la région sty4217-4222 et plus particulièrement le produit du gène sty4221, une aminotransférase hypothétique. Ce dernier gène est d’intérêt dû à l’homologie qu’il détient avec une hémolysine connue (Hly) produite par Treponema denticola, possédant elle-même une activité d’aminotransférase. Chez T. denticola, Hly dégrade la cystéine et produit du H2S qui est toxique pour l’hôte. Notre hypothèse est que la spécificité d’hôte et la capacité de produire une infection systémique de Typhi sont dues à l’expression de gènes qui ne se retrouvent pas chez d’autres salmonelles. Le but de cette étude était donc de caractériser le gène sty4221 quant à son activité hémolytique, cytotoxique et tenter de déterminer son rôle dans la virulence de cette bactérie. Le gène sty4221 a été cloné sous le contrôle d’un promoteur inductible à l’arabinose et exprimé par E. coli. L’activité hémolytique du clone a été déterminée par simple observation sur gélose sang. Ce clone a également permis d’observer l’effet cytotoxique du surnageant de culture sur différentes lignées cellulaires, par quantification de la relâche de LDH. Le gène sty4221 a été muté chez la souche sauvage de Typhi, ISP1820, l’implication pathogénique du gène a ainsi pu être étudiée. Des tests de phagocytose, d’invasion et de survie dans des macrophages humains ont été effectués, ainsi que des tests d’adhésion et d’invasion sur des cellules HeLa. Par ailleurs, une première tentative de purification de la protéine a été entreprise. En somme, nous savons maintenant que STY4221 a des propriétés hémolytiques, augmentées par la présence de cystéine. De plus, STY4221 a un effet cytotoxique sur les macrophages THP-I, mais aucun effet sur les HeLa. Or, sty4221 ne semble pas impliqué dans les étapes d’adhésion, d’invasion, de phagocytose ou de survie. La caractérisation de sty4221 permettra sans doute d’approfondir nos connaissances sur les toxines trouvées uniquement chez Typhi.

Régulation de la proprotéine convertase subtilisine / kexine type 9 (PCSK9) dans les cellules intestinales Caco-2/15

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin.

Caractérisation et étude d'un élément régulateur du gène codant pour le récepteur à la vasopressine de type 2

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris VI, France

Étude de la fonction ovarienne chez les souris déficientes des enzymes hyaluronidases

Les mammifères femelles naissent avec un très grand nombre de follicules ovariens primordiaux (104-106); par contre, la grande majorité (99%) de ces follicules n’atteignent jamais la maturité et subissent l’atrésie, principalement par l’apoptose des cellules de la granulosa. Notre laboratoire a démontré que les hyaluronidases des mammifères induisent l’apoptose des cellules de la granulosa et sont impliquées dans l’atrésie des follicules mais que cet effet apoptotique ne serait pas dû à leur activité enzymatique. Notre modèle propose que les hyaluronidases aient un rôle dans les follicules non destinés à ovuler. Le but de la présente étude est d’évaluer la folliculogénèse et la fertilité des souris déficientes de ces enzymes. Les résultats montrent que la délétion de Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne des souris mais qu’il pourrait y avoir un effet compensatoire par Hyal-1 chez les souris déficientes de Hyal-3 étant donné que son expression est augmentée chez ces souris. La délétion de Hyal-1 a pour effet d’augmenter le nombre des follicules primordiaux, primaires et secondaires, particulièrement chez les souris de bas âge, et de diminuer le niveau d’apoptose des cellules de la granulosa. Afin d’évaluer la fonction de Hyal-1, -2 et -3 sans effet compensatoire entre elles, nous avons voulu créer une souris déficiente des ces 3 hyaluronidases spécifiquement dans les gonades en utilisant le système Cre/loxP. Un vecteur contenant la séquence Cre sous le contrôle du promoteur de Inhibin-α, qui conduit l’expression des gènes en aval chez les cellules somatiques des gonades, a été construit avec succès. En conclusion, cette étude nous révèle que Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne mais que la délétion de Hyal-1 augmente la folliculogénèse et diminue l’apoptose des cellules de la granulosa.

Cloning and Characterisation of the human gene gremlin promoter

L’ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire invalidante caractérisée par la perte de l’intégrité du cartilage articulaire. Les recherches tentent de comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie afin de trouver des inhibiteurs efficaces pouvant prévenir la dégradation du cartilage articulaire. Les BMPs (bone morphogenic proteins) jouent un rôle dans le processus pathophysiologique de cette maladie. Cette étude cible le rôle d’un antagoniste des BMPs, le gremlin. Nous avons étudié la régulation de l’expression de gremlin par le clonage et la caractérisation de son promoteur et en déterminant si gremlin pouvait jouer un rôle autre qu’antagoniste des BMP, en affectant l’expression d’autres gènes par l’activation d’une cascade de signalisation dans la cellule. Les résultats ont identifié une région importante dans le promoteur de gremlin qui affecte son activité basale et induite, et ont montré que le gremlin ne pouvait pas affecter l’expression génique et l’activation de signalisation intracellulaire indépendamment des BMPs. Cette étude démontre que le rôle de gremlin dans l’OA en est un essentiellement d’antagoniste des BMPs.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Régulation de l’expression du gène Six6 par les facteurs de transcription Lhx2 et Pax6 dans le contexte des cellules souches rétiniennes

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives.

Dissection du programme développemental du noyau paraventriculaire de l'hypothalamus.

Une cascade de facteurs de transcription composée de SIM1, ARNT2, OTP, BRN2 et SIM2 est requise pour la différenciation des cinq types cellulaires qui peuplent le noyau paraventriculaire (PVN) de l’hypothalamus, un régulateur critique de plusieurs processus physiologiques essentiels à la survie. De plus, l’haploinsuffisance de Sim1 est aussi une cause d’hyperphagie isolée chez la souris et chez l’homme. Nous désirons disséquer le programme développemental du PVN, via une approche intégrative, afin d’identifier de nouveaux gènes qui ont le potentiel de réguler l’homéostasie chez l’individu adulte. Premièrement, nous avons utilisé une approche incluant l’analyse du transcriptome du PVN à différents stades du développement de la souris pour identifier de tels gènes. Nous avons comparé les transcriptomes de l’hypothalamus antérieur chez des embryons de souris Sim1+/+ et Sim1-/- à E12.5 issus de la même portée. De cette manière, nous avons identifié 56 gènes agissant en aval de Sim1 dont 5 facteurs de transcription - Irx3, Sax1, Rxrg, Ror et Neurod6. Nous avons également proposé un modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur. Selon ce modèle, les gènes qui occupent un domaine médial dans la zone du manteau caractérisent des cellules qui peupleront le PVN alors que les gènes qui ont une expression latérale identifient des cellules qui donneront plus tard naissance aux structures ventrolatérales de l’hypothalamus. Nous avons aussi démontré que Sim1 est impliqué à la fois dans la différenciation, la migration et la prolifération des neurones qui peuplent le PVN tout comme Otp. Nous avons également isolé par microdissection au laser le PVN et l’hypothalamus médiobasal chez des souris de type sauvage à E14.5 pour en comparer les transcriptomes. Ceci nous a permis d’identifier 34 facteurs de transcription spécifiques au PVN et 76 facteurs spécifiques à l’hypothalamus médiobasal. Ces gènes représentent des régulateurs potentiels du développement hypothalamique. Deuxièmement, nous avons identifié 3 blocs de séquences au sein de la région 5’ d’Otp qui sont conservés chez l’homme, la souris et le poisson. Nous avons construit un transgène qui est composé d’un fragment de 7 kb contenant ces blocs de séquences et d’un gène rapporteur. L’analyse de 4 lignées de souris a montré que ce transgène est uniquement exprimé dans le PVN en développement. Nous avons généré un deuxième transgène dans lequel le fragment de 7 kb est inséré en amont de l’ADNc de Brn2 ou Sim1 et de Gfp. Nous avons obtenu quatre lignées de souris dans lesquels le profil d’expression de Brn2 et de Gfp reproduit celui d’Otp. Nous étudierons le développement du PVN et la prise alimentaire chez ces souris. En parallèle, nous croisons ces lignées avec les souris déficientes en Sim1 pour déterminer si l’expression de Brn2 permet le développement des cellules du PVN en absence de Sim1. En résumé, nous avons généré le premier transgène qui est exprimé spécifiquement dans le PVN. Ce transgène constitue un outil critique pour la dissection du programme développemental de l’hypothalamus. Troisièmement, nous avons caractérisé le développement de l’hypothalamus antérieur chez l’embryon de poulet qui représente un modèle intéressant pour réaliser des études de perte et de gain de fonction au cours du développement de cette structure. Il faut souligner que le modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur semble être conservé chez l’embryon de poulet où il est aussi possible de classer les gènes selon leur profil d’expression médio-latéral et le devenir des régions qu’ils définissent. Finalement, nous croyons que cette approche intégrative nous permettra d’identifier et de caractériser des régulateurs du développement du PVN qui pourront potentiellement être associés à des pathologies chez l’adulte telles que l’obésité ou l’hypertension.