Charakterisierung und funktionelle Analyse eines ABC-Promotors aus Solanum tuberosum

Pflanzen können Pathogene anhand von PAMPs erkennen und komplexe Abwehrmechanismen aktivieren, die zur Ausprägung der PTI führen. In der vorliegenden Arbeit wurden PAMP-induzierte Abwehrreaktionen zwischen Solanum tuberosum und Phytophthora infestans untersucht. Der Oomycet P. infestans ist der Erreger der Kraut- und Knolenfäule, der wichtigsten und wirtschaftlich bedeutendsten Krankheit der Kartoffel. Die Behandlung der anfälligen Sorte Désirée mit dem Phytophthora-spezifischen PAMP Pep-13 führt zu einer starken lokalen Abwehrantwort, die zu einer systemischen Resistenz führt. In Microarray-Analysen wurden mehr als 700 Gene identifiziert, die durch Pep-13 aktiviert werden. Der Promotor eines dieser Gene, das für einen ABCG-Halb-Transporter kodiert, sollte im Rahmen der Arbeit charakterisiert und auf seine Aktivität untersucht werden. Zunächst wurde eine ~2 kb große Promotor-Region des ABC-Transporters aus S. tuberosum (StpABC) kloniert und mehrere Klone sequenziert. Dabei konnte eine Sequenzhomologie von 94% zum nicht annotierten Kartoffelgenom von Solanum phurejia festgestellt werden. Zur weiteren Charakterisierung der StpABC-Region wurde eine in silico Sequenzanalyse durchgeführt. Dabei wurden zahlreiche mögliche cis-regulatorische Elemente einer Kernpromotor-Sequenz, sowie TFBS zur Regulation von Stress-, Licht- und Pathogen-induzierten Genen lokalisiert. Eine Eingrenzung der aktiven Promotor-Region (< 2012 Bp) konnte damit nicht erzielt werden. Die Erstellung von sGFP- und GUS- Reportergen-Konstrukten mit der StpABC-Region und die Generierung transgener Pflanzen ermöglichte eine funktionelle Analyse. (...)

Charakterisierung von Kartoffelpflanzen mit reduzierter THT-Genexpression

Diese Masterarbeit wurde im Verlauf des Sommersemesters 2014 am Leibniz Institut für Pflanzenbiochemie (IPB) in Halle angefertigt. Gegenstand dabei war die Charakterisierung von Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum cv Désirée), welche durch RNA-Interferenz reduzierte Mengen der Tyramin-Hydroxyzimtsäure-Transferase (THT) besaßen. Durch Southern- und Northern-Blot-Analysen wurden die korrekte Insertion als auch der RNAi-Effekt überprüft und bestätigt. Infizierte Blätter und die dazugehörenden Infektionstropfen wurden in Methanol gelöst und massenspektrometrisch nachgewiesen. Darauf aufbauend wurde das Wachstum von Phytophthora infestans auf transformierten Linien untersucht, wobei dessen Biomasse nach 3-tägiger Infektion durch qPCR bestimmt wurde. Während der Betreuung der transformierten Linien in Sterilkultur wurde ein Phänotyp ersichtlich. Nach Dokumentation der äußeren Erscheinungen und nach Prüfung auf Einfluss von Pathogenen, wurden diese Pflanzen für Knollenversuche im Gewächshaus ausgepflanzt und analysiert. Zuletzt wurde die Sequenz von THT analysiert und kloniert, woraufhin drei Fragmente generiert wurden, welche für weitere Versuche genutzt werden können.

Divinyl ether fatty acid synthesis in late blight-diseased potato leaves.

We conducted a study of the patterns and dynamics of oxidized fatty acid derivatives (oxylipins) in potato leaves infected with the late-blight pathogen Phytophthora infestans. Two 18-carbon divinyl ether fatty acids, colneleic acid and colnelenic acid, accumulated during disease development. To date, there are no reports that such compounds have been detected in higher plants. The divinyl ether fatty acids accumulate more rapidly in potato cultivar Matilda (a cultivar with increased resistance to late blight) than in cultivar Bintje, a susceptible cultivar. Colnelenic acid reached levels of up to approximately 24 nmol (7 microgram) per g fresh weight of tissue in infected leaves. By contrast, levels of members of the jasmonic acid family did not change significantly during pathogenesis. The divinyl ethers also accumulated during the incompatible interaction of tobacco with tobacco mosaic virus. Colneleic and colnelenic acids were found to be inhibitory to P. infestans, suggesting a function in plant defense for divinyl ethers, which are unstable compounds rarely encountered in biological systems.

Patterns of plant subcellular responses to successful oomycete infections reveal differences in host cell reprogramming and endocytic trafficking.

Adapted filamentous pathogens such as the oomycetes Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) and Phytophthora infestans (Pi) project specialized hyphae, the haustoria, inside living host cells for the suppression of host defence and acquisition of nutrients. Accommodation of haustoria requires reorganization of the host cell and the biogenesis of a novel host cell membrane, the extrahaustorial membrane (EHM), which envelops the haustorium separating the host cell from the pathogen. Here, we applied live-cell imaging of fluorescent-tagged proteins labelling a variety of membrane compartments and investigated the subcellular changes associated with accommodating oomycete haustoria in Arabidopsis and N. benthamiana. Plasma membrane-resident proteins differentially localized to the EHM. Likewise, secretory vesicles and endosomal compartments surrounded Hpa and Pi haustoria revealing differences between these two oomycetes, and suggesting a role for vesicle trafficking pathways for the pathogen-controlled biogenesis of the EHM. The latter is supported by enhanced susceptibility of mutants in endosome-mediated trafficking regulators. These observations point at host subcellular defences and specialization of the EHM in a pathogen-specific manner. Defence-associated haustorial encasements, a double-layered membrane that grows around mature haustoria, were frequently observed in Hpa interactions. Intriguingly, all tested plant proteins accumulated at Hpa haustorial encasements suggesting the general recruitment of default vesicle trafficking pathways to defend pathogen access. Altogether, our results show common requirements of subcellular changes associated with oomycete biotrophy, and highlight differences between two oomycete pathogens in reprogramming host cell vesicle trafficking for haustoria accommodation. This provides a framework for further dissection of the pathogen-triggered reprogramming of host subcellular changes.

Agrupamento de curvas de progresso de requeima, em tomateiro originado de cruzamento interespecífico

O objetivo deste trabalho foi estimar curvas de progresso de requeima, em genótipos de tomateiro, e identificar grupos de genótipos resistentes à doença. Foram avaliados 25 híbridos de tomateiro, originados de cruzamentos entre quatro variedades comerciais, um acesso do Banco de Germoplasma de Hortaliças (BGH), da Universidade Federal de Viçosa (UFV), e cinco linhagens F8 (Solanum lycopersicum x Solanum habrochaites), estas últimas selecionadas como fonte de resistência à requeima. As plantas foram inoculadas com uma mistura de esporângios de Phytophthora infestans e, em seguida, foram realizadas seis avaliações quanto à severidade de requeima, a intervalos de três dias. Ajustou-se o modelo exponencial aos dados de percentagem de severidade de requeima, e as estimativas obtidas quanto à incidência inicial da doença (y o) e taxa de progresso da doença (r) foram submetidas à análise de variância multivariada (Manova). As médias dessas estimativas, para cada genótipo, foram submetidas à análise de agrupamento. Observou-se um número ótimo de oito grupos distintos, o que possibilitou identificar genótipos resistentes e suscetíveis. Os híbridos experimentais Ikram x 73 A, Nemo-Netta x 133 A, Ikram x 163 A e Nemo-Netta x 163 A apresentaram a menor taxa de progresso de requeima e, portanto, maior resistência à doença.

Produtividade, qualidade de tubérculos e incidência de doenças em batata, influenciados pela aplicação foliar de silício

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação de silício por via foliar, na forma de ácido silícico estabilizado, sobre a incidência de doenças, produtividade e qualidade de batata. Foram realizados três experimentos: um com a cultivar Agata e outro com a Atlantic, em Botucatu, SP; e um com a cultivar Agata, em Itaí, SP. Utilizou-se delineamento de blocos ao acaso, com oito repetições. Os tratamentos consistiram de: testemunha (sem aplicação de Si) e aplicação de Si via foliar, na dose 2 L ha-1, de produto comercial com 0,8% de Si solúvel como concentrado estabilizado de ácido silícico. A dose de Si foi parcelada em quatro aplicações durante o ciclo da cultura. A aplicação de Si reduz a severidade da requeima e a incidência de canela-preta, além de aumentar a produtividade e o teor de matéria seca dos tubérculos. O fornecimento de Si via foliar aumenta a produtividade de tubérculos, independentemente de seus efeitos sobre a incidência de doenças.

Seleção simultânea para qualidade do fruto e resistência à requeima em progênies de tomateiro

O objetivo deste trabalho foi avaliar critérios de seleção em progênies de cruzamento entre a cultivar de tomateiro Santa Clara (Solanum lycopersicum) e a espécie silvestre S. habrochaites f. glabratum, quanto a atributos de qualidade dos frutos e de resistência à requeima (Phytophthora infestans). As famílias foram avaliadas em delineamento de blocos ao acaso, em dois ensaios, com duas repetições e seis testemunhas comuns a ambos os ensaios. Ganhos diretos e indiretos foram estimados entre famílias F2:3 para seleção simultânea quanto à resistência à requeima, determinada pela quantificação da área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), e quanto à acidez titulável e aos teores de sólidos solúveis dos frutos. Os critérios de seleção proporcionaram ganhos genéticos satisfatórios, adequados ao ideótipo proposto de decréscimo na AACPD e de incremento nos valores médios de sólidos solúveis e acidez titulável. A seleção direta e indireta e o índice de Mulamba & Mock resultam em ganhos individuais mais equilibrados e em maiores ganhos totais.

Potencial de hibridação entre acessos de tomateiro para pré-melhoramento quanto à resistência à requeima

Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar genitores com potencial de hibridação para o pré-melhoramento do tomateiro (Solanum lycopersicum) quanto à resistência à requeima. Foram utilizados seis acessos de tomateiro (BGH-2102, BGH-2117, BGH-2127, BGH-2130, BGH-2332 e BGH-2343) como genitores resistentes e 15 híbridos F1 originários destes genitores. Utilizou-se o delineamento de blocos ao acaso, com três repetições. As plantas foram inoculadas com uma mistura de esporângios de Phytophthora infestans, agente etiológico da requeima, na concentração de 5x103 esporângios mL-1. A área abaixo da curva de progresso da doença foi utilizada para avaliar a resistência. Realizou-se a análise dialélica, tendo-se considerado o efeito de genótipos como fixo. Estimou-se a capacidade geral e específica de combinação dos acessos. O padrão de resistência dos genitores e da maioria dos F1 foi o mesmo que o das testemunhas resistentes. Foram observados: variabilidade genética aditiva entre os genitores, predominância de efeitos gênicos não aditivos e desvios de dominância bidirecional no controle do caráter. A frequência de alelos favoráveis e divergentes para resistência à requeima é maior nos acessos BGH-2117, BGH-2127 e BGH-2343.

Relembrando Anton de Bary e sua obra fitopatológica

São descritos aspectos biográficos do cientista Heinrich Anton de Bary, natural da Alemanha, que possui os títulos Pai da Fitopatologia e criador da Moderna Micologia. Médico de formação, não exerceu a profissão, decicando-se a botânica, com grande interesse pelos talófitas. Estudou profundamente e foi responsável por grandes contribuições ao conhecimento dos fungos, algas e mixomicetes. Com menor ênfase, apresentou revelações valiosas ao estudo das bactérias. Publicou exaustivamente sobre muitos outros assuntos e as maiores contribuições à Fitopatologia e Micologia foram as pesquisas sobre a requeima da batata e ferrugens dos cereais. Faleceu aos 58 anos.

Métodos de isolamento de bactérias do filoplano de tomateiro visando populações específicas e implicações como agentes de biocontrole

Em um processo de seleção de bactérias do filoplano de tomateiro (Lycopersicon esculentum) com potencial para o controle de doenças da parte aérea da cultura, diferentes métodos de isolamento foram utilizados visando obter isolados da população total, da população da superfície foliar e isolados que habitam locais protegidos do filoplano e/ou que toleram fatores de estresse. Foi testada a capacidade de 300 isolados em controlar in vivo, as doenças causadas por Alternaria solani, Pseudomonas syringae pv. tomato e Phytophthora infestans. Os testes foram repetidos para cada um dos antagonistas selecionados, estudando-se, também, a capacidade de controlar a mancha-bacteriana, causada por Xanthomonas vesicatoria. Os resultados demonstraram haver predomínio de antagonistas provenientes de folíolos do terço superior da planta de população total ou da superfície. Entretanto, o único antagonista selecionado, isolado de folíolos do terço inferior, foi obtido de locais protegidos do filoplano e/ou capaz de tolerar fatores de estresse.

Avaliação de produtos alternativos para controle da requeima do tomateiro

Em condições de campo, avaliaram-se produtos alternativos no manejo da requeima do tomateiro (Lycopersicon esculentum), causada por Phytophthora infestans, em três experimentos (E). Compararam-se, em E1, extratos de: [pimenta (Capsicum chinense) + pimenta-do-reino (Piper nigrum) + cravo (Syzygium aromaticum) + açafrão-da-índia (Curcuma longa) + alho (Allium sativum)]; (pimenta-do-reino + cravo + alho); e (cravo + açafrão-da-índia + alho); em E2, óleo de nim (Azadirachta indica) (0,5%); leite (20%); e calda bordalesa; e em E3, preparado homeopático obtido de tecido de tomateiro com requeima (dinamização C30); mistura água-etanol; e calda bordalesa. Em E1, os extratos e a testemunha não diferiram quanto à severidade na metade da epidemia (Y50), severidade final (Ymáx), área abaixo da curva de progresso (AACPD) e taxa de progresso da doença (r). Em E2, Y50 com óleo de nim (3%) e calda bordalesa (1%) não diferiram; Ymáx foi maior com óleo de nim (44%) que com calda bordalesa (14%); leite não reduziu Ymáx; r e AACPD foram menores com óleo de nim (0,161 e 533, respectivamente) que na testemunha (0,211 e 1186, respectivamente) e semelhantes àqueles com calda bordalesa (0,156 e 130, respectivamente); r e AACPD foram similares nos tratamentos leite e testemunha. Em E3, Y50, Ymáx, AACPD e r com a mistura água-etanol e preparado homeopático foram similares aos da testemunha. A calda bordalesa foi o tratamento mais eficiente no controle da requeima, e o óleo de nim foi promissor. No manejo da doença em sistemas alternativos de produção, é necessário integrar práticas, para se potencializarem os efeitos individualizados.

Controle da requeima em tomateiro industrial com fungicidas e silicato de potássio

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação de fungicidas e silicato de potássio, no controle da requeima (Phytophthora infestans), em tomateiro industrial. Os fungicidas foram aplicados com base no sistema de previsão de Wallin e calendário fixo de pulverizações. Empregou-se o delineamento em blocos casualizados com 6 tratamentos e 4 repetições. Os tratamentos (T) foram: T1 - testemunha; T2 - dimetomorfe + clorotalonil (valores de severidade da doença (VSD = 10) + metiram; T3 - metalaxil-M + clorotalonil (VSD = 10) + metiram (o metiram foi aplicado somente na semana onde o VSD não atingiu o valor requerido para o tratamento); T4 - calendário fixo: dimetomorfe + clorotalonil, mancozeb, metalaxil-M + clorotalonil e clorotalonil, alternados semanalmente; T5 - silicato de potássio (5 g/L) e T6 - silicato de potássio (15 g/L). A severidade foi avaliada utilizando-se uma escala descritiva variando de 0 a 100 %. A severidade final foi: 100; 2,6; 12,3; 5,5; 97,6 e 96 %, respectivamente, nos tratamentos T1, T2, T3, T4, T5 e T6. A severidade foi em média, 93 % menor nos tratamentos que receberam aplicações de fungicidas em relação a testemunha. Dentre os tratamentos que empregaram sistema de previsão o 2 apresentou melhor resultado do que o 3. O tratamento 2 apresentou eficiência comparável ao calendário semanal (tratamento 4), apresentando produtividades de 62.103,73 e 52.473,33 kg/ha, respectivamente, sendo superiores aos demais tratamentos. Aplicações de silicato de potássio nas duas doses testadas não diferiram significativamente da testemunha, indicando a ineficiência do produto em controlar a requeima.

Manejo da requeima do tomateiro industrial empregando sistema de previsão

Três experimentos foram conduzidos utilizando-se o híbrido de tomateiro industrial H 7155N, em 2003 e 2004 visando adequar um sistema de previsão modificado para o uso de fungicidas no manejo da requeima causada por Phytophthora infestans. Os experimentos foram conduzidos num delineamento em blocos ao acaso com dez tratamentos e três repetições. Os fungicidas sistêmicos foram aplicados quando o valor de severidade da doença (VSD) alcançou oito, dez ou doze pontos. A alternância dos fungicidas sistêmicos com o metiram ocorreu na semana em que não foram alcançados os VSD´s. O tratamento calendário de pulverização para o controle da requeima consistiu da aplicação semanal de fungicidas após o aparecimento dos primeiros sintomas e aqueles definidos pelo sistema de previsão foram baseados nos VSD acumulados durante o experimento. A avaliação da requeima foi feita semanalmente com auxílio de uma escala descritiva de severidade e uma chave diagramática. A eficiência dos tratamentos foi comparada calculando-se a área abaixo da curva do progresso da doença, a taxa de progresso da doença (r) e produtividade de tomate. Os valores de r do melhor tratamento (dimetomorfe misturado com clorotalonil (VSD = 10) alternado com metiram variaram de 0,03 a 0,07, enquanto para o tratamento calendário semanal foi de 0,05 a 0,09 e para testemunha de 0,24 a 0,39. Dimetomorfe + clorotalonil (VSD = 10) alternado com metiram produziu em média 15,7 toneladas a mais de tomate, comparado ao tratamento calendário semanal de fungicidas. Dimetomorfe ou metalaxil-M misturado com clorotalonil (VSD = 10) baseado no sistema de previsão sem a alternância com metiram diferiu do calendário semanal baseado na severidade da doença e na produção de tomate. Os tratamentos piraclostrobina misturado com metiram (VSD = 8; VSD = 10) alternado com metiram; dimetomorfe misturado com mancozeb (VSD = 8; VSD = 10) alternado com metiram proporcionaram controle intermediário da requeima. O sistema de previsão baseado no uso de dimetomorfe misturado com clorotalonil alternado com metiram (VSD = 10) permitiu redução de uma aplicação da mistura dimetomorfe misturado com clorotalonil pulverização em dois dos três experimentos, comparados ao tratamento calendário semanal de aplicação de fungicidas, sem afetar a produção.

Efeito do silicato de potássio isoladamente ou em mistura com fungicida no controle da requeima da batateira

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da aplicação foliar de silicato de potássio, isoladamente ou em mistura com diferentes doses do fungicida, no controle da requeima, causada por Phytophthora infestans, da batateira. O experimento foi conduzido em condições de campo utilizando-se o delineamento em blocos casualizados com 8 tratamentos e 4 repetições. A cultivar de batata usada foi a Asterix. Foi utilizado o fungicida Cimoxanil + Mancozeb (60 + 700 g/Kg i.a.) e silicato de potássio na dose de 60 g/L (pH = 5,5). Os tratamentos (T) utilizados foram: T1 - Testemunha; T2 - Cimoxanil + Mancozeb (2,0 Kg/ha); T3 - Cimoxanil + Mancozeb (2,5 Kg/ha); T4 - Cimoxanil + Mancozeb (2,0 Kg/ha) + silicato de potássio; T5 - Cimoxanil + Mancozeb (2,5 Kg/ha) + silicato de potássio; T6 - Cimoxanil + Mancozeb (3,0 Kg/ha) + silicato de potássio; T7 - silicato de potássio e T8 - Cimoxanil + Mancozeb (3,0 Kg/ha). As pulverizações foram realizadas semanalmente. A severidade da requeima foi avaliada utilizando-se uma escala descritiva com notas de 0 a 100%. Os resultados da severidade foram utilizados para calcular a área abaixo da curva do progresso da requeima (AACPR). A AACPR foi de 72,5; 23,8; 18,3; 29,5; 19,7; 17,9; 68,3 e 16,3, respectivamente, nos tratamentos T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7 e T8. Os tratamentos 3, 5, 6 e 8 foram os mais eficientes (menores AACPRs e maiores rendimentos) no controle da requeima. O silicato de potássio não foi eficiente e não apresentou nenhum efeito aditivo quando misturado ao fungicida no controle da requeima.

Efficiency of phylloplane bacteria in controlling aerial tomato diseases under field conditions

The capacity of two bacteria isolated from the tomato phylloplane to control late blight (Phytophthora infestans) was investigated in the field, and compared against the effectiveness of spraying with the fungicide chlorothalonil (1.5 g a.i. L-1) or water (control). A 55% reduction in late blight intensity was observed in the leaves of the middle of the plant and 62% in those of the upper leaves when using the antagonist UFV-STB 6 (Novosphingobium capsulatum) as compared to the control. Isolate UFV-IEA 6 (Bacillus cereus) was able to reduce disease intensity by 55%, but only in the upper leaves of the tomato plants. Treatment with isolate UFV-STB 6 also led to a significant reduction in the percentage of fruits with late blight symptoms. The results demonstrate the potential of these two bacteria in controlling this disease.