Avaliação da aspirina e do ácido cafeico fenetil estersobre o reparo tecidual cutâneo

Numerosos modelos in vitro e in vivo foram desenvolvidos para estudar o reparo de lesões e identificar os mecanismos chave deste processo. Visando avaliar o processo de cicatrização utilizamos um modelo de lesão excisional total e um modelo de queimadura promovida por escaldamento. No estudo utilizando o modelo de lesão excisional total, abordamos o uso da aspirina (um inibidor não seletivo da COX) e seu efeito diferenciado sobre os sexos na cicatrização cutânea de camundongos. Observamos que os grupos fêmea controle e tratado apresentaram contração atrasada comparado aos grupos macho controle e tratado, respectivamente. Entre os grupos fêmea e macho controles, as fêmeas apresentaram menor atividade da mieloperoxidase e menor quantidade de células MIF-positivas do que os machos controle. Já entre os grupos fêmea e macho tratados, foi observado que nas fêmeas tratadas, a atividade da mieloperoxidase e a quantidade de macrófagos F4/80-positivos estavam maiores do que no grupo macho tratado. Ainda entre os grupos tratados, as fêmeas apresentaram menores níveis de hidroxiprolina e maior expressão proteica de vWF e VEGF comparado aos machos. No estudo das lesões causadas por queimadura, avaliamos as propriedades anti- inflamatórias e antioxidantes do ácido cafeico fenetil ester (CAPE) no reparo destas lesões e observamos que em 7, 14, 21 e 70 dias após a queimadura, o grupo queimado+CAPE apresentou menor área lesada, além de menor atividade da mieloperoxidase e dos níveis de nitrito do que o grupo queimado. Também foi observado que no grupo queimado+CAPE a expressão proteica de CD68 e de PECAM-1 estava reduzida comparada ao grupo queimado. Analisando os parâmetros de dano oxidativo foi observado que os níveis de MDA e de proteínas carboniladas estavam menores no grupo queimado+CAPE do que no grupo queimado, tanto no plasma quanto na lesão. Em suma, nosso estudo avaliou o processo de cicatrização de dois modelos de lesão, em roedores de diferentes espécies e em abordagens distintas. No modelo de lesão excisional total em camundongos observamos que a administração da aspirina prejudicou o processo de cicatrização em camundongos Balb/c fêmeas, mas não afetou esse processo nos machos da mesma linhagem, o que pode ser explicado pela redução dos níveis de estrógenos nas fêmeas. A utilização do CAPE na cicatrização de queimaduras em ratas comprovou sua eficácia anti-inflamatória e antioxidante devido ao grupo queimado+CAPE ter apresentado maior taxa de cicatrização, redução da resposta inflamatória, além da redução do dano oxidativo em lipídeos e proteínas comparado ao grupo queimado.

Alterações no reparo tecidual cutâneo em um modelo de resistência à insulina

A obesidade associada às alterações metabólicas, tais como a resitência à insulina, provoca significativas modificações no decorrer do processo de cicatrização. O objetivo desse estudo foi inicialmente avaliar os efeitos da resistência à insulina induzida por uma dieta com elevado teor de gordura durante o reparo tecidual. E, em seguida, investigar o papel dos macrófagos neste processo. Observamos que os animais submetidos à dieta hiperlipídica (RHL) tornaram-se intolerantes à glicose e resistentes à insulina, além de aumentarem as taxas plasmáticas de colesterol e triglicerídeos em relação aos animais alimentados com ração padrão (RP). O grupo RHL apresentou uma menor taxa de contração da lesão e reepitelização em relação ao grupo RP. Observamos ainda maior quantidade de células inflamatórias (células NOS 2-positivas, macrófagos, e neutrófilos), menor densidade de fibras do sistema colágeno e maior densidade de miofibroblastos e vasos sanguíneos no grupo RHL. O dano oxidativo estava maior no grupo RHL bem como a expressão proteica do fator de crescimento transformante-β1 (TGF-β1) e α-actina de músculo liso (α-SMA). O grupo RHL apresentou altos níveis plasmáticos de TNF-α quando comparado com o grupo RP. Além disso, a proporção das células M1 (macrófagos ativados classicamente) e M2 (macrófagos ativados alternativamente) foi a mesma em ambos os grupos. Em relação a síntese e liberação de citocinas e fatores de crescimento avaliados através dos ensaios in vitro, observamos ainda que os níveis do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β) estavam maiores no meio condicionado de macrófagos isolados dos animais do grupo RHL (MCRHL) em relacão ao meio condicionado de macrófagos isolados dos animais do grupo RP (MCRP). Além disso, os nossos resultados demonstraram claramente que os fatores solúveis produzidos por macrófagos isolados a partir de animais resistentes à insulina inibem a proliferação e a migração de fibroblastos. Através desses resultados podemos mostrar que a resistência à insulina retarda o processo de cicatrização e sugerir os macrófagos participam deste retardo.

Efeito da p53 sobre a expressão e atividade da enzima de reparo de DNA Timina-DNA Glicosilase

O câncer de esôfago é uma malignidade altamente freqüente e letal. Uma característica específica das áreas de alta incidência de câncer de esôfago é a grande proporção de duplas mutações no gene TP53, sendo, ao menos uma delas, uma transição G para A em sítios CpG. Essas transições resultam de malpareamentos GT causados pela desaminação espontânea da 5-metilcitosina em ilhotas CpG. A enzima de reparo de DNA Timina-DNA Glicosilase (TDG) é responsável pelo primeiro passo na remoção da timina de malpareamentos GT em CpG. A alta proporção de mutações em sítios CpG em câncer de esôfago das áreas de alta incidência sugere que a via de reparo de DNA iniciada pela TDG pode estar prejudicada. A presença de duplas mutações, sendo ao menos uma delas em CpG, levantou a hipótese de que a primeira mutação no TP53 reduz a atividade da via de reparo iniciada pela TDG, que acarretaria a segunda mutação em sítios CpG. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi analisar o efeito da p53 sobre a expressão e atividade da TDG. Os resultados obtidos mostram que a expressão de TDG é regulada transcricionalmente pela p53 numa gama de linhagens celulares e é induzida pelo dano ao DNA, de forma p53-dependente. Além disto, os resultados apontam um possível papel da proteína p53 ativa na migração nuclear e atividade da TDG. Estes resultados ainda nos levam à conclusão de que o silenciamento de TDG aumenta a sensibilidade à morte celular induzida por MMS quando a p53 é encontrada na forma selvagem, mas não quando esta proteína é mutada, e de que o status mutacional de TP53 parece afetar a expressão de TDG em CEE primários. Juntos esses resultados sugerem que a p53 regula o reparo de DNA mediado pela TDG e que a inativação de p53 em células tumorais pode contribuir para a aquisição de um mutator phenotype.

Papel dos receptores β-adrenérgicos no reparo cutâneo de lesões crônicas em camundongos: modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão

Os receptores β1- e β2-adrenérgicos estão presentes em inúmeras células que participam do processo de reparo como fibroblastos, queratinócitos, células inflamatórias e células endoteliais. Diversos trabalhos demonstram que estes receptores modulam o processo de reparo tecidual. Entretanto, nenhum trabalho demonstrou se o bloqueio destes receptores compromete o reparo de úlceras de pressão. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos no reparo de úlceras de pressão em camundongos, para isto utilizamos um modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão. No presente estudo, utilizamos animais que foram tratados por gavagem com propranolol (um antagonista não seletivo dos receptores β1- e β2-adrenérgicos). A administração do antagonista teve início um dia antes do início dos ciclos de isquemia e reperfusão e se manteve diariamente até a eutanásia. Para desenvolver a úlcera de pressão, um par de magnetos foi aplicado no dorso dos animais previamente depilado. O período de permanência do magneto é caracterizado como período de isquemia, enquanto sua retirada é caracterizada como período de reperfusão. Os ciclos de isquemia e reperfusão foram repetidos duas vezes, e ao final do último ciclo, duas úlceras circulares foram criadas no dorso dos animais. Os animais foram mortos 3, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após o último ciclo de isquemia, o fluxo sanguíneo da área comprimida foi nulo, 7 horas após a compressão o fluxo sanguíneo estava elevado, com níveis superiores ao da pele normal. Após 24 e 48 horas, o fluxo sanguíneo estava reduzido e abaixo dos níveis da pele normal. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou os níveis de peróxidos lipídicos 3 dias após a lesão, comprometeu a migração dos queratinócitos, levando a um aumento da proliferação epitelial, resultando em uma re-epitelização atrasada. O retardo na formação da neo-epiderme induzido pelo bloqueio destes receptores prejudicou a remoção do tecido necrótico. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou o número de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), os níveis proteicos de elastase neutrofílica 3 dias após a lesão e reduziu os níveis proteicos de MCP-1 3 dias após a lesão e os níveis proteicos de MMP-12 7 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou a proliferação celular e apoptose no tecido conjuntivo 7 dias após a lesão e aumentou a densidade de vasos sanguíneos 14 e 21 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos retardou a diferenciação miofibroblástica e reduziu os níveis proteicos de TGF-β 1/2/3 3 dias após a lesão e a contração da lesão. Vinte e um dias após a lesão, o bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou a espessura da neo-epiderme e a expressão de tenascina-C em fibroblastos e reduziu a deposição de colágeno. Em conclusão, o bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos atrasa o reparo tecidual em úlceras de pressão.

Caracterização de juntas soldadas por Arame Tubular com proteção gasosa do aço ferrítico ASTM A335 P91, antes e após situação de duplo reparo.

Pouco se sabe a respeito das consequências da operação de reparo nas propriedades mecânicas e metalúrgicas das juntas do aço ASTM A335 grau P91 soldadas por Arame Tubular. Neste trabalho foi realizado um estudo para analisar e caracterizar juntas de um tubo do aço P91 soldadas pelo processo Arame Tubular com proteção gasosa, antes e após situação de duplo reparo. Foram utilizadas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV), análise química semiquantitativa por EDS (Energy Dispersive Spectroscopy), microscopia óptica (MO), além da obtenção de medidas de microdureza Vickers e realização de ensaios de impacto e tração à temperatura ambiente. A macrografia revelou a existência de uma nova zona termicamente afetada formada no centro da junta reparada e a análise micrográfica mostrou que esta zona apresentou uma pequena tendência a formação de grãos menores do que na zona de fusão que sofreu reparo, além disso, a região tinha grãos colunares que não são característicos de uma zona termicamente afetada e quantidade de carbonetos menor comparativamente. Não houve variações significativas nos valores de tração e microdureza. Os ensaios de impacto revelaram baixos valores de energia absorvida na zona de fusão do 2 reparo, no entanto, todas as outras zonas avaliadas das juntas com e sem reparo apresentaram valores dentro das especificações.

Efeitos da associação de biomateriais com doadores de óxido nítrico no reparo tecidual cutâneo de camundongos

A aplicação tópica de doadores de óxido nítrico é conhecida pelos seus efeitos benéficos no reparo tecidual cutâneo. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da associação de biomateriais com doadores de óxido nítrico no reparo tecidual cutâneo de camundongos. Camundongos swiss machos foram submetidos a lesões excisionais por punch de biópsia de 8 mm no dorso. Os animais foram separados em 4 grupos (n=6 em cada grupo) de acordo com a aplicação do curativo de polivinil álcool e hidrogel sobre a lesão de punch: a) grupo polivinil álcool com grupos tiol e Pluronic F-127 (PVA-SH/F127) - tratado com hidrogel sem S- nitrosoglutationa (GSNO) e filme sem óxido nítrico; b) grupo polivinil álcool S-nitrosado (PVA-SNO/F127-GSNO) - tratado com hidrogel contendo GSNO e filme com óxido nítrico; c) grupo PVA-SNO - tratado apenas com filme óxido nítrico e d) grupo PVA-SNO/ F127 - tratado com hidrogel sem GSNO e filme com óxido nítrico. Os animais foram tratados por 7 dias consecutivos com aplicação diária de curativos com seus respectivos biomateriais. Após 7 dias de tratamento, foram retirados os curativos e as lesões foram deixadas cicatrizar por segunda intenção. O grupo tratado com filme de PVA-SNO (d) associado ao hidrogel F127, comparado com os demais grupos descritos acima, apresentou melhora no reparo tecidual, melhora da contração da lesão, diminuição do gap epitelial e densidade celular, aceleração da fase inflamatória, aumento da diferenciação miofibroblástica e aumento da expressão de colágeno do tipo III (p<0,05, ao menos). Com base nesses dados, a combinação de filmes PVA liberadores de óxido nítrico com F-127 pode representar uma nova abordagem para o tratamento de lesões cutâneas.

Estudo do fator de forma de área em reparo com chapa colada em tubulações com furo

Este trabalho tem por finalidade o estudo da resistência à pressão hidrostática do reparo realizado com chapa de aço de baixo carbono, colada com adesivo estrutural à base de epóxi em tubulações de aço com furo. Tubulações de parede fina, sob pressão interna, a tensão na direção longitudinal é a metade da tensão circunferencial do tubo, deste modo, o fator de forma da área do reparo, ou seja, a variação das dimensões da chapa nas direções longitudinal e circunferencial do tubo foi investigado. A influência da força de falha do reparo, quando varia-se a dimensão da chapa nas direções citadas, foram analisadas estatisticamente utilizando-se um planejamento fatorial de experimentos. Altos valores de resistência hidrostática do reparo foram encontrados (em torno de 240 bar) quando comparados com as pressões normais de trabalho (em torno de 70 bar) de uma tubulação similar as utilizadas nos testes. Os resultados da pressão de falha do reparo dos 10 grupos analisados apresentaram desvios padrão pequenos, menor que 12 %, demonstrando a eficiência dos procedimentos adotados na confecção do reparo. Os estudos demonstram a não existência de um fator de forma na resistência do reparo devido a variação nas dimensões da chapa nas direções longitudinal e circunferencial do tubo bem como a alta influência na resistência do reparo quando aumenta a área da chapa. Os resultados apontam para o desenvolvimento de um novo procedimento de reparo de contingência.

Estudo de polimorfismos nos genes TP53 e p21(WAF1) e do perfil imunohistoquímico das proteínas p53, p21(WAF1), p16(INK4a) e ciclina D1 pela técnica de Tissue Microarray (TMA) e sua importância para o desenvolvimento e/ou severidade das neoplasias cervicais

O câncer de colo do útero é o terceiro tipo de câncer mais frequente em mulheres no mundo, e a infecção persistente pelo papilomavirus humano (HPV) oncogênico é condição necessária, mas não suficiente para seu desenvolvimento. As oncoproteínas virais E6 e E7 interferem direta ou indiretamente na ação de várias proteínas celulares. Entretanto, as variantes proteicas, resultantes de polimorfismos genéticos, podem apresentar comportamento distinto mediante a infecção pelo HPV. O objetivo deste estudo foi avaliar possíveis associações entre polimorfismos nos genes TP53 (p53 PIN3, p53 72C>G) e p21 (p21 31C>A) e o desenvolvimento de neoplasias cervicais, considerando os níveis de expressão das proteínas p53, p21, p16 e ciclina D1, e fatores de risco clássicos para o câncer cervical. Foram selecionadas 466 mulheres residentes no Rio de Janeiro, 281 com diagnóstico histopatológico de neoplasia cervical de baixo (LSIL) e alto grau (HSIL) e câncer (grupo de casos) e 185 sem história atual ou pregressa de alteração citológica do colo uterino (grupo controle). A técnica de PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase - polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), foi empregada na análise dos polimorfismos p53 72C>G e p21 31C>A, usando as enzimas de restrição BstUI e BsmaI, respectivamente. A avaliação do polimorfismo p53 PIN3 (duplicação de 16 pb) foi feita por meio da análise eletroforética direta dos produtos de PCR. A expressão das proteínas p53, p21, p16, ciclina D1 e Ki-67 e a pesquisa de anticorpos anti-HPV 16 e HPV pool foram avaliadas por imunohistoquímica (Tissue Microarray - TMA) em 196 biópsias do grupo de casos. O grupo controle se mostrou em equilíbrio de Hardy-Weinberg em relação aos três polimorfismos avaliados. As distribuições genotípicas e alélicas relativas a p53 PIN3 e p53 72C>G nos grupos controles e de casos não apresentaram diferenças significativas, embora o genótipo p53 72CC tenha aumentado o risco atribuído ao uso de contraceptivos das pacientes apresentarem lesões mais severas (OR=4,33; IC 95%=1,19-15,83). O genótipo p21 31CA(Ser/Arg) conferiu proteção ao desenvolvimento de HSIL ou câncer (OR=0,61, IC 95%=0,39-0,97), e modificou o efeito de fatores de risco associados à severidade das lesões. A interação multiplicativa de alelos mostrou que a combinação p53 PIN3A1, p53 72C(Pro) e p21 31C(Ser), representou risco (OR=1,67, IC95%=1,03-2,72) e a combinação p53 PIN3A1, p53 72C(Pro) e p21 31A(Arg) conferiu efeito protetor (OR=0,26, IC95%=0,08-0,78) para o desenvolvimento de HSIL e câncer cervical. Observou-se correlação positiva da expressão de p16 e p21 e negativa da ciclina D1 com o grau da lesão. A distribuição epitelial de p16, Ki-67, p21 e p53 se mostrou associada à severidade da lesão. Os polimorfismos analisados não apresentaram associação com a expressão dos biomarcadores ou positividade para HPV. Nossos resultados sugerem a importância do polimorfismo p21 31C>A para o desenvolvimento das neoplasias cervicais e ausência de correlação dos polimorfismos p53 PIN3 e p53 72C>G com a carcinogênese cervical, embora alguns genótipos tenham se comportado como modificadores de risco. Nossos resultados de TMA corroboram o potencial de uso de biomarcadores do ciclo celular para diferenciar as lesões precursoras do câncer cervical.

Porfirinas e Terapia Fotodinâmica em Neoplasias

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Autoradiographic and scintillation analysis of 5-aminolevulinic acid permeation through epithelialised tissue: Implications for topical photodynamic therapy of superficial gynaecological neoplasias

Purpose. Aminolevulinic acid (5-ALA) diffusion through both keratinised and non-keratinised tissue, used as a model tissue substrates, was evaluated, together with the depth of permeation and the concentration achieved following delivery from bioadhesive patch and proprietary cream formulations. Materials and Methods. Moisture-activated, bioadhesive patches loaded with 5-ALA at concentrations of 19.0, 38.0 and 50.0 mg cm(-2) and an o/w cream (20% w/w 5-ALA) were radiolabelled with C14 5-ALA and applied to excised human vaginal tissue and porcine skin. After 1, 2 and 4 h, tissue was sectioned in two orientations and the 5-ALA concentration at specific depths determined using autoradiography and liquid scintillation counting (LSC). Results. The stratum corneum was a significant barrier to 5-ALA permeation, with concentrations in tissue dependent on application time and drug loading. 5-ALA was detected at 6 mm using autoradiography after 2 h, with LSC showing phototoxic concentrations at 2.375 mm after 4 h of application. Inclusion of oleic acid and dimethyl sulphoxide in bioadhesive patches increased 5-ALA significantly in neonate porcine tissue, but only for patches cast from blends containing 5% w/w oleic acid. Conclusions. The bioadhesive patch described delivered 5-ALA to depths of at least 2.5 mm in tissue types indicative of vulval skin, suggesting that photodynamic therapy of deep vulval intraepithelial neoplasia is feasible using this means of bioadhesive 5-ALA delivery.

Mortalidade por neoplasias malignas na população residente próximo de minas de urânio em Portugal : Epidemiologia

RESUMO - Introdução: O encerramento das minas de urânio em Portugal tem suscitado preocupação no que respeita aos eventuais efeitos que as radiações emitidas e os agentes químicos presentes terão na saúde das populações. Para esclarecer a existência de tal efeito foi delineado um programa de investigação em que o presente estudo se enquadra. Sendo conhecido que as populações expostas a minas de urânio, nomeadamente os mineiros, têm risco acrescido de sofrer de neoplasias, especialmente de «neoplasias da traqueia, dos brônquios e do pulmão», foi este o grupo de neoplasias seleccionado para constituir a hipótese principal do estudo. Assim, o estudo pretendeu verificar se existe associação entre exposição a minas de urânio e suas escombreiras (especialmente à mina da Urgeiriça, no concelho de Nelas) e a mortalidade por alguns grupos de neoplasias malignas, nomeadamente as «neoplasias malignas da traqueia, dos brônquios e do pulmão». Material e métodos: Trata-se de um estudo «ecológico» em que se consideraram «expostos» os residentes no concelho de Nelas, bem como no conjunto de concelhos com minas de urânio, e «não expostos» os residentes nos restantes concelhos das NUTS Dão-Lafões e Beira Interior Norte e Serra da Estrela. A análise centrou-se no cálculo, para cada concelho ou grupo de concelhos, das razões padronizadas de mortalidade (RPM) por «neoplasias malignas da traqueia, dos brônquios e do pulmão», por «neoplasia maligna do estômago» e por «todas as neoplasias malignas » no período de vinte anos compreendido entre 1980 e 1999. Resultados: Tomando os dois sexos em conjunto, o concelho de Nelas teve a RPM mais elevada para as «neoplasias malignas da traqueia, dos brônquios e do pulmão» (RPM = 133; p = 0,003). Teve também o valor mais elevado no sexo masculino (RPM = 126, não significativo) e o segundo mais elevado no sexo feminino (RPM = 142, não significativo). A razão das RPM concelho de Nelas/concelhos limítrofes de Nelas foi 1,46, p = 0,002 (homens: 1,50 p = 0,003; mulheres: 1,27, não significativo). As razões das RPM concelho de Nelas/concelhos com minas (1,94, p = 0,001) e concelho de Nelas/concelhos sem minas (1,57, p = 0,001) foram claramente superiores a 1. Pelo contrário, as RPM por «neoplasia maligna do estômago » foram sobretudo elevadas nos concelhos da NUTS Beira Interior Norte, que inclui grande parte do distrito da Guarda, (Trancoso: 154, p = 0,000; Sabugal: 146, p = 0,000), embora se tenham observado valores elevados em alguns concelhos da NUTS Dão-Lafões (Vila Nova de Paiva: 154, p = 0,001). Saliente-se que os dois valores mais baixos ocorreram nos concelhos de Tábua (RPM = 57; p = 0,000) e de Nelas (RPM = 60; p = 0,000). Para o conjunto de «todas as neoplasias malignas» as RPM dos vários concelhos variaram entre 62 e 100 sem que a distribuição desses valores sugerisse qualquer associação positiva relevante. Discussão: Os resultados mostraram que a população do concelho de Nelas teve, no período estudado, um risco acrescido de morrer por «neoplasias malignas da traqueia, dos brônquios e do pulmão» quando comparado com a dos concelhos limítrofes e restantes concelhos das NUTS estudadas. A existência da mina da Urgeiriça e da sua escombreira é uma possível causa desse excesso de mortalidade. Ele poderá ter sido gerado, por um lado, através da existência de uma percentagem elevada de ex-mineiros, bem como, por outro lado, através de uma exposição ambiental geral, facto este que é sustentado pela ocorrência de excesso de mortalidade tanto em homens como em mulheres. O excesso de mortalidade por aquele grupo de neoplasias pode ainda ter origem noutras exposições cujo potencial papel é discutido.

Detección de mutaciones en el oncogen k - ras en neoplasias epiteliales colorrectales

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialidad en Biología Molecular e Ingenieria Genética) UANL

Determinación de la frecuencia de mutaciones en el gen supresor de tumores p53 en neoplasias epiteliales colorrectales

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialiad en Biología Molecular e Ingeniería Genética) UANL