鳜IL-1β基因的克隆及原核表达

用RACE PCR获得了鳜白介素-1β(IL-1β)的全长cDNA.鳜IL-1β的cDNA全长为1298 nt(核苷酸),其5′非编码区包含UTR 93 nt;3′非编码区包含452 nt;其开放阅读框内包含753 nt,翻译成251个氨基酸.将鳜IL-1β克隆到原核表达载体pET-32a上,在大肠杆菌Rosetta- gami(DE3)内以包涵体形式得以高效表达.

干旱和复水条件下转基因甘薯的光合特性

以转铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因甘薯(TS)及未转基因甘薯(NT)为实验材料,研究在旱后复水条件下转基因甘薯及未转基因甘薯抗氧化酶活性和光合特性变化。结果显示,连续36 h胁迫条件下,TS和NT的SOD活性都先降低后升高,但TS的SOD活性始终高于NT。胁迫至24 h时,TS的SOD活性约为NT的1.2倍,复水后二者SOD活性都下降。持续胁迫,TS的APX活性先升高后降低,NT与之相反,复水后TS和NT的APX活性都是先升高后降低,复水12 h,TS的APX活性是NT的1.5倍。水分胁迫条件下TS的膜质受伤害程度要轻于NT,胁迫24 h,复水12 h,NT的MDA含量均约为TS的1.2倍。胁迫12 h,TS和NT净光合速率都下降,继续胁迫,TS净光合速率开始上升,NT几乎保持不变,胁迫36 h,TS的净光合速率约为NT的1.5倍。复水后二者净光合速率都开始上升,复水12 h,TS净光合速率约为NT的3倍。胁迫时TS、NT胞间CO2浓度(Ci)都逐渐增大,胁迫36 h时NT胞间CO2浓度显著高于TS,是其1.4倍。实验结果表明,同时转入SOD、APX抗氧化基因后,在...

Effect of neurotropic factors on survival of transplanted embryonic inner ear tissues

This paper addresses cochlear transplantation and presents a study on the effect of brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3) on the survival of transplanted embryonic inner ear tissues.

Altered Neurotrophin, Neuropeptide, Cytokines and Nitric Oxide Levels in Autism

Introduction: Modifications in neurotrophins, neuropeptides, cytokines and nitric oxide (NO) levels in autism may represent different biological aspects of the disease. In the present study we investigate simultaneously all these variables as an attempt to clarify their interrelationships in autism. Methods: Plasma levels of vasoactive intestinal peptide (VIP), neurotrophin-3 (NT-3), cytokines and nitric oxide (NO) were determined in children with DSM-IV autistic disorder (n = 24) and in age- and gender-matched healthy controls (n = 24). VIP, NT-3, IFN-gamma and IL-1 beta levels were measured by ELISA, TNF-alpha, IL-10, IL-6, IL-4, IL-2 were evaluated by flow cytometry, and NO by Griess reaction. Results: Plasma levels of VIP, IFN-gamma and NO were significantly higher and NT-3 plasma levels were significantly lower in children with autism, compared to the healthy subjects. In children with autism there was a positive correlation between plasma levels of NO and IFN-gamma. Discussion: Our results indicate the presence of altered levels of neurotrophin and neuropeptide in infantile autism and provide additional evidence that higher levels of IFN-gamma may be associated with increased oxidative stress in autism.

Intrazelluläre Lokalisation und synaptische Ausschüttung der Neurotrophine in hippokampalen Neuronen und die Bedeutung von BDNF bei hippokampaler synaptischer Plastizität

Die Mitglieder der Neurotrophin-Familie (NGF, BDNF, NT-3 und NT-4) sind sekretierte Neuropeptide, die eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung von Nervenzellen und bei der Modulation der synaptischen Transmission spielen. Wenngleich eine aktivitätsabhängige Sekretion von BDNF bereits gezeigt werden konnte, wurden die subzelluläre Expression und die Ausschüttung der anderen Neurotrophine bislang nur unzureichend charakterisiert. Um die Expression und die Ausschüttung aller Neurotrophine unter identischen Bedingungen untersuchen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit das Expressionsmuster und die synaptische Ausschüttung GFP-markierter Neurotrophine in dissoziierten hippokampalen Neuronen mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenz-Videomikroskopie zeitaufgelöst untersucht. Zwei Phänotypen konnten unterschieden werden: der distale vesikuläre Expressionstyp mit Neurotrophin-beinhaltenden Vesikeln in distalen Neuriten, und der proximale Expressionstyp mit einer diffusen Neurotrophin-Verteilung in den Neuriten und Neurotrophin-beinhaltenden Vesikeln im Soma des Neurons und in den proximalen Dendriten. Der distale vesikuläre Phänotyp entsprach einer Verteilung des entsprechenden Neurotrophins in die sekretorischen Granula des aktivitätsabhängigen Sekretionsweges, während der proximale Phänotyp den Transport eines Neurotrophins in den konstitutiven Sekretionsweg widerspiegelte. Alle Neurotrophine erreichten in hippokampalen Neuronen prinzipiell beide Sekretionswege. Jedoch gelangten BDNF und NT-3 mit einer größeren Effizienz in den regulierten Sekretionsweg als NT-4 und NGF (BDNF: in 98% aller Zellen, NT-3: 85%, NT-4: 23% und NGF: 46%). Neurotrophine besitzen, wie es für sekretorische Peptide üblich ist, eine Vorläufersequenz, die während der Reifung des Proteins proteolytisch abgespalten wird. Die Fusion dieser Präpro-Sequenz von BDNF mit der Sequenz des maturen NT-4 bewirkte einen effizienteren Transport von NT-4 in die sekretorischen Granula des regulierten Sekretionsweges, und zeigte die große Bedeutung der Präpro-Sequenz für das zelluläre Verteilungsmuster von Neurotrophinen. In Neuronen, in denen die Neurotrophine in den regulierten Sekretionsweg transportiert wurden, konnte eine aktivitätsabhängige Sekretion der Neurotrophine an postsynaptische Strukturen glutamaterger Synapsen beobachtet werden. Die aktivitätsabhängige postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine zeigte eine Heterogenität in der Kinetik der Sekretion (exponentieller Abfall des Neurotrophin-Signals mit Zeitkonstanten von tau = 121 bis 307s). Die Präinkubtion mit dem Protonen-Ionophor Monensin, welcher die Neutralisation des intragranulären pH-Wertes und somit die Solubilisierung der dicht gepackten Proteinstrukturen in den Vesikeln erzwingt, erhöhte die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung auf den Wert des unter physiologischen Bedingungen schnellsten Neurotrophins NT-4. Dennoch blieb die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung im Vergleich zur Neurotransmitter-Ausschüttung langsam (tau = 13 ± 2 s). Diese Daten belegen eindeutig, dass die Neutralisation der sekretorischen Granula die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung kritisch determiniert und die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung im Vergleich zur konventionellen Neurotransmitter-Ausschüttung langsam erfolgt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Neurotrophin BDNF effizient in distale vesikuläre Strukturen von CA1 Pyramidenzellen organotypischer Schnittkulturen des Hippokampus sortiert wird. Die basalen elektrischen Eigenschaften von CA1 Pyramidenzellen BDNF-defizienter Mäuse sind vergleichbar zu den Eigenschaften von Wildtyp Mäusen. Sowohl das Eigenpotential der CA1 Pyramidenzellen, die Form der Aktionspotentiale als auch die evozierten Antworten der CA1 Pyramdenzellen auf eine gepaarte präsynaptische Stimulation der Schaffer-Kollateralen zeigten bei BDNF-/- -, BDNF+/- - und BDNF+/+ -Mäusen keine signifikanten Unterschiede. Die Fähigkeit der CA1 Pyramidenzellen auf eine hochfrequente Reizung mit einer Langzeitpotenzierung (LTP) der postsynaptischen Ströme zu reagieren ist jedoch bei den BDNF-defizienten Mäusen beinträchtigt. Eine verminderte Induktion von LTP war in den BDNF-defizienten Mäusen nach tetanischer Stimulation der präsynaptischen Schaffer-Kollateralen und simultaner postsynaptischer Depolarisation der CA1 Pyramidenzelle zu beobachten.

Signalling mechanisms affecting regulated neurotrophin secretion in hippocampal neurons

Die Neurotrophine aus Säugetiere BDNF und NT-3 sind von Neuronen sekretierte Wachstumsfaktoren. Ferner sind Neurotrophine in verschiedene Formen der aktivitätsabhängigen synaptische Plastizität involviert. Obwohl die Ausschüttung von Neurotrophine aus Synapsen beschrieben worden ist, sind die intrazellulären Signalkaskaden, die die synaptische Ausschüttung von Neurotrophine regulieren, bei weitem nicht verstanden. Deswegen ist die Analyse der Sekretion von Neurotrophine auf subzellulärer Ebene erforderlich, um die genaue Rolle von präsynaptische und postsynaptische NT-Sekretion in der synaptischen Plastizität aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kulturen von dissoziierten hippocampalen Neuronen aus Ratten mit grün fluoreszierenden Protein-markierten Konstrukten von BDNF und NT-3 transfiziert und Neurotrophine-enthaltenden Vesikeln durch die Colokalisierung mit dem cotransfizierten postsynaptischen Marker PSD-95-DsRed an glutamatergen Synapsen identifiziert. Depolarisationsinduzierte Sekretion von BDNF und NT-3 wurde per Direktaufnahme am Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die unvermittelte postsynaptische Depolarisation mit erhöhtem Kalium, in Gegenwart von Inhibitoren der synaptischen Transmission, erlaubte die Untersuchung der Signalwege, die am postsynaptischen Sekretionsprozess der Neurotrophinvesikel beteiligt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die depolarisationsinduzierte postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine durch Calcium-Einstrom ausgelöst wird, entweder über L-Typ-spannungsabhängige Calcium-Kanäle oder über NMDA-Rezeptoren. Eine anschließende Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern über Ryanodin-Rezeptoren ist für den Sekretionsprozess erforderlich. Die postsynaptische Neurotrophinausschüttung wird durch KN-62 und KN-93 gehemmt, was auf eine unmittelbare Abhängigkeit von aktiver alpha-Calcium-Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) hinweist. Der Inhibitor der cAMP/Proteinkinase A (PKA), Rp-cAMP-S, sowie der NO-Donor, SNP, minderten die Neurotrophinausschüttung. Hingegen blieben die Erhöhung des intrazellulären cAMP und der NO-Synthase-Inhibitor L-NMMA ohne Wirkung. Mit dem Trk-Inhibitor K252a konnte gezeigt werden, dass autokrine Neurotrophin-induzierte Neurotrophinausschüttung nicht an der synaptischen Freisetzung der Neurotrophine beiträgt und, dass BDNF seine eigene postsynaptische Sekretion nicht auslöst. Freisetzungsexperimente mit dem Fluoreszenz-Quencher Bromphenolblau konnten den Nachweis erbringen, dass asynchrone und anhaltende Fusionsporenöffnung von Neurotrophinvesikeln während der Sekretion stattfindet. Wegen der im Vergleich zum komplexen Sekretionsprozess schnellen Fusionsporenöffnung, scheint die Freisetzungsgeschwindigkeit von Neurotrophine durch ihre Diffusion aus dem Vesikel begrenzt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine starke Abhängigkeit der aktivitätsabhängigen postsynaptischen Neurotrophinausschüttung vom Calcium-Einstrom, von der Freisetzung von Calcium aus internen Speichern, von der Aktivierung der CaMKII und einem intakten Funktion der PKA, während der Trk-Signalweg, die Aktivierung von Natrium-Kanäle und NO-Signale nicht erforderlich sind.

Efeito da adição da torta de dendê no perfil fermentativo da silagem do resíduo da extração do palmito da pupunha (Bactris gasipaes Kunth).

A extração de palmito da pupunha, na região Sul do estado da Bahia, vem gerando grande quantidade de derivados, que podem ser uma alternatia de alimentação para os ruminantes na forma de silagem. Podendo, assim, solucionar o destino desses co-produtos e, desta forma, gerar tecnologias voltadas para o uso sustentável dos recursos naturais associados ao ecossistema regional. O objetivo do trabalho foi avaliar o perfil fermentativo das silagens do co-produto agroindustrial da extração do palmito da pupunha in natura, aditivada com torta de dendê (10% do peso verde) e emurchecida. Utilizou-se silos PVC com 10 cm de diâmetros x 40 cm de comprimento. As aberturas dos silos ocorreram aos 1, 3, 5, 7, 14, 28 e 56 dias após a ensilagem. Os valores de pH não apresentaram diferença significativa (P>0,05) entre os tratamentos tendo como média (3,82) no dia 56, no entanto esses valores apresentaram padrão de mudança cúbica ao longo dos dias com o valor mínimo sendo atingido no dia 14 para todos os tratamentos. A adição da torta de dendê na silagem elevou os teores de MS (21,06%) e PB (7,79%), reduziu os valores de N-NH3/NT (3,73%) e de perda de MS (0,82) apresentando diferença significativa (P<0,05) para os demais tratamentos. A silagem do co-produto da extração do palmito da pupunha aditivada com torta de dendê melhorou os parâmetros de fermentação e o valor de PB. podendo ser uma alternativa para alimentação dos ruminantes.

Meningococcal disease - 2 NT cases in August 1997 - The view from CDC

On 1 August 1997, the Friday afternoon of the start of a three day weekend (NT Picnic Day Monday 4 August) a case of suspected meningococcal disease was notified to CDC Katherine by an experienced, long serving, local GP...

A 22-nt artificial microRNA mediates widespread RNA silencing in Arabidopsis

It is known that 22-nucleotide (nt) microRNAs (miRNAs) derived from asymmetric duplexes trigger phased small-interfering RNA (phasiRNA) production from complementary targets. Here we investigate the efficacy of 22-nt artificial miRNA (amiRNA)-mediated RNA silencing relative to conventional hairpin RNA (hpRNA) and 21-nt amiRNA-mediated RNA silencing. CHALCONE SYNTHASE (CHS) was selected as a target in Arabidopsis thaliana due to the obvious and non-lethal loss of anthocyanin accumulation upon widespread RNA silencing. Over-expression of CHS in the pap1-D background facilitated visual detection of both local and systemic RNA silencing. RNA silencing was initiated in leaf tissues from hpRNA and amiRNA plant expression vectors under the control of an Arabidopsis RuBisCo small subunit 1A promoter (SSU). In this system, hpRNA expression triggered CHS silencing in most leaf tissues but not in roots or seed coats. Similarly, 21-nt amiRNA expression from symmetric miRNA/miRNA* duplexes triggered CHS silencing in all leaf tissues but not in roots or seed coats. However, 22-nt amiRNA expression from an asymmetric duplex triggered CHS silencing in all tissues, including roots and seed coats, in the majority of plant lines. This widespread CHS silencing required RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE6-mediated accumulation of phasiRNAs from the endogenous CHS transcript. These results demonstrate the efficacy of asymmetric 22-nt amiRNA-directed RNA silencing and associated phasiRNA production and activity, in mediating widespread RNA silencing of an endogenous target gene. Asymmetric 22-nt amiRNA-directed RNA silencing requires little modification of existing amiRNA technology and is expected to be effective in suppressing other genes and/or members of gene families.

NT-ProBNP levels in saliva and its clinical relevance to heart failure

Background: Current blood based diagnostic assays to detect heart failure (HF) have large intra-individual and inter-individual variations which have made it difficult to determine whether the changes in the analyte levels reflect an actual change in disease activity. Human saliva mirrors the body's health and well being and similar to 20% of proteins that are present in blood are also found in saliva. Saliva has numerous advantages over blood as a diagnostic fluid which allows for a non-invasive, simple, and safe sample collection. The aim of our study was to develop an immunoassay to detect NT-proBNP in saliva and to determine if there is a correlation with blood levels. Methods: Saliva samples were collected from healthy volunteers (n = 40) who had no underlying heart conditions and HF patients (n = 45) at rest. Samples were stored at -80 degrees C until analysis. A customised homogeneous sandwich AlphaLISA((R)) immunoassay was used to quantify NT-proBNP levels in saliva. Results: Our NT-proBNP immunoassay was validated against a commercial Roche assay on plasma samples collected from HF patients (n = 37) and the correlation was r(2) = 0.78 (p<0.01, y = 1.705 x +1910.8). The median salivary NT-proBNP levels in the healthy and HF participants were <16 pg/mL and 76.8 pg/mL, respectively. The salivary NT-proBNP immunoassay showed a clinical sensitivity of 82.2% and specificity of 100%, positive predictive value of 100% and negative predictive value of 83.3%, with an overall diagnostic accuracy of 90.6%. Conclusion: We have firstly demonstrated that NT-proBNP can be detected in saliva and that the levels were higher in heart failure patients compared with healthy control subjects. Further studies will be needed to demonstrate the clinical relevance of salivary NT-proBNP in unselected, previously undiagnosed populations.

A rapid and cost-effective method of producing recombinant proBNP and NT-proBNP variants in Escherichia coli for immunoassay of heart failure

The measurements of plasma natriuretic peptides (NT-proBNP, proBNP and BNP) are used to diagnose heart failure but these are expensive to produce. We describe a rapid, cheap and facile production of proteins for immunoassays of heart failure. DNA encoding N-terminally His-tagged NT-proBNP and proBNP were cloned into the pJexpress404 vector. ProBNP and NT-proBNP peptides were expressed in Escherichia coli, purified and refolded in vitro. The analytical performance of these peptides were comparable with commercial analytes (NT-proBNP EC50 for the recombinant is 2.6 ng/ml and for the commercial material is 5.3 ng/ml) and the EC50 for recombinant and commercial proBNP, are 3.6 and 5.7 ng/ml respectively). Total yield of purified refolded NT-proBNP peptide was 1.75 mg/l and proBNP was 0.088 mg/l. This approach may also be useful in expressing other protein analytes for immunoassay applications. To develop a cost effective protein expression method in E. coli to obtain high yields of NT-proBNP (1.75 mg/l) and proBNP (0.088 mg/l) peptides for immunoassay use.

Performance of hybrid buffer Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) layers doped with plasmonic silver nanoparticles

We compare the performance of a typical hole transport layer for organic photovoltaics (OPVs), Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT:PSS) thin film with a series of PEDOT:PSS layers doped with silver (Ag) nanoparticles (NPs) of various size distributions. These hybrid layers have attracted great attention as buffer layers in plasmonic OPVs, although there is no report up to date on their isolated performance. In the present study we prepared a series of PEDOT:PSS layers sandwiched between indium tin oxide (ITO) and gold (Au) electrodes. Ag NPs were deposited on top of the ITO by electron beam evaporation followed by spin coating of PEDOT:PSS. Electrical characterization performed in the dark showed linear resistive behavior for all the samples; lower resistance was observed for the hybrid ones. It was found that the resistivity of the samples decreases with increasing the particle's size. A substantial increase of the electric field between the ITO and the Au electrodes was seen through the formation of current paths through the Ag NPs. A striking observation is the slight increase in the slope of the current density versus voltage curves when measured under illumination for the case of the plasmonic layers, indicating that changes in the electric field in the vicinity of the NP due to plasmonic excitation is a non-vanishing factor. © 2014 Published by Elsevier B.V. All rights reserved.