Efeitos do agente antiproliferativo de origem marinha ET-743 sobre o ciclo celular, apoptose e conteúdo de proteína Hsp70 em culturas de glioma humano

Ecteinascidina 743 (ET-743) é uma nova droga isolada de um tunicado marinho, a Ecteinascidia turbinata, que está na fase III dos estudos clínicos por sua marcada atividade anticâncer. Apesar de seu mecanismo de ação não estar completamente elucidado, tem sido demonstrado que a ET-743 se liga ao DNA formando adutos covalentes com o N2 da guanina. Além disso, a ET-743 tem sido relatada como potente inibidora da transcrição. No presente estudo, utilizou-se como modelo para a investigação dos efeitos antiproliferativos deste composto a linhagem celular derivada de glioblastoma humano, U-251 MG. Uma vez que o foco principal de atenção nos estudos sobre o mecanismo de ação da ET-743 esteja concentrado em suas interações com o DNA, a autora buscou avaliar outros aspectos de sua atividade antiproliferativa, quais sejam, o seu efeito sobre a distribuição das células no ciclo celular, sobre a atividade de enzimas associadas ao processo de apoptose, bem como sobre o conteúdo celular da proteína Hsp70. Em incubações de 0,5 nM por 48 h, a ET-743 causou um significante acúmulo das células na fase G2M do ciclo celular, o mesmo ocorrendo com doses mais elevadas (1,0 e 1,5) e incubações mais prolongadas (72 h). A ET-743 induziu morte celular dose-dependente e este efeito foi significativamente prevenido pelo inibidor de caspases z-VAD-fmk. Contudo, não foi observado aumento significativo nos níveis de Hsp70 após tratamento com ET-743. Considerando que alta expressão de Hsp70 é um dos principais mecanismos de proteção das células em condições de estresse, incluindo-se o tratamento com drogas citotóxicas, a não elevação de seus níveis na presença da ET-374 pode estar, ao menos em parte, relacionada à citotoxicidade produzida por este agente na linhagem estudada.

Efeito das isoflavonas da soja daidzeína e genisteína em células MCF-7, HB4 e OVCAR-3: estudo da citotoxicidade, indução de apoptose, cinética de proliferação celular e expressão gênica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Sinalização celular para apoptose em linhagem celular de adenocarcinoma (MCF-7) e carcinoma ductal invasivo de mama (ZR 7531) tratados com alcalódes isolados de Pterogyne nitens

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Exposição à concentração subletal de metilmercúrio: genotoxicidade e alterações na proliferação celular

O mercúrio é um metal que se destaca dos demais por se apresentar líquido em temperatura e pressão normais. Este xenobiótico se apresenta como a maior fonte de poluição em várias partes do mundo e tem como característica ser altamente tóxico ao Sistema Nervoso Central (SNC). O despejo é na forma líquida diretamente no solo e leito dos rios. Este metal pesado é complexado com vários elementos presentes no solo ou sedimentos sendo convertido à metilmercúrio (MeHg) pela microbiota aquática. O MeHg apresenta a capacidade de se acumular ao longo da cadeia trófica, um evento conhecido como biomagnificação, o qual afeta diretamente a vida humana. Nesse sentido, a Região Amazônica se destaca por possuir todos os componentes necessários para a manutenção do ciclo biogeoquímico do mercúrio, além de populações cronicamente expostas a este metal pesado, sendo este fato considerado um problema de saúde pública. Tem-se conhecimento que este xenobiótico após a exposição aguda a altas doses promove desordens relacionadas ao surgimento de processos degenerativos no SNC, entretanto, os efeitos a baixas concentrações ainda não são totalmente conhecidos. Nesse sentido, se destacam as células gliais que atuam como mediadores no processo de neurotoxicidade desse metal, principalmente em baixas concentrações. Apesar de este tipo celular exibir um importante papel no processo de intoxicação mercurial, a ação deste metal sobre as células glias é pouco conhecida, principalmente sobre o genoma e a proliferação celular. Desta forma, este trabalho se propõe a avaliar o efeito da exposição a este xenobiótico em baixa concentração sobre o material genético e a proliferação celular em células da linhagem glial C6. As avaliações bioquímica (atividade mitocondrial – medida pelo ensaio de MTT –) e morfofuncional (integridade da membrana – avaliada pelo ensaio com os corantes BE e AA –) confirmaram a ausência de morte celular após a exposição ao metal pesado na concentração de 3 μM por um intervalo de 24 horas. Mesmo sem promover processos de morte celular, o tratamento com esta concentração subletal de MeHg foi capaz de aumentar significativamente os níveis dos marcadores de genotoxicidade (fragmentação do DNA, formação de micronúcleos, pontes nucleoplásmica e brotos nucleares). Ao mesmo tempo, foi possível observar uma alteração no ciclo celular através do aumento do índice mitótico e uma mudança no perfil do ciclo celular com aumento da população celular nas fases S e G2/M, sugerindo um aprisionamento nessa etapa. Esta mudança no ciclo celular, provocada por 24h de exposição ao MeHg, foi seguida de uma redução no número de células viáveis e confluência celular 24h após a retirada do MeHg e substituição do meio de cultura, além do aumento no tempo de duplicação da cultura do mesmo. Este estudo demonstrou pela primeira vez que a exposição ao metilmercúrio em concentração baixa e subletal é capaz de promover eventos genotóxicos e distúrbios na proliferação celular em células de origem glial.

Proliferação celular em gestações naturais e de conceptos bovinos transgênicos e clonados, que expressam a proteína fluorescente verde (GFP)

Pós-graduação em Ciência e Tecnologia Animal - FEIS

Citotoxicidade do ácido peracético: avaliação metabólica, estrutural e de morte em fibroblastos L929

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação da técnica imunohistoquímica como método de deteção da apoptose a nível celular

A apoptose constitui um processo fisiológico de morte celular, caracterizado por alterações morfológicas distintas e mecanismos bioquímicos e moleculares bem definidos. O seu papel de destaque em numerosos eventos biológicos e importantes processos patológicos conduziu a um crescente interesse na investigação dos mecanismos celulares que regulam o processo apoptótico. A aplicação de metodologias capazes de identificar células apoptóticas despoletou um enorme desenvolvimento de técnicas. No entanto, as propriedades demonstradas por estes ensaios nem sempre se aplicam ao estudo de amostras tecidulares, pelo que a escolha dos diferentes métodos deverá ser criteriosamente avaliada, tendo em conta a aplicação pretendida e as alterações morfológicas que se pretendem detetar. Das várias técnicas disponíveis para deteção da apoptose em tecidos, muitos investigadores recomendam o método TUNEL, o qual se baseia na marcação de produtos endonucleossómicos resultantes da fragmentação do DNA. Outros métodos histoquímicos também disponíveis incluem a deteção do citocromo c, libertado da mitocôndria ou a deteção das proteínas pró e anti-apoptóticas, Bax, Bidm e Bcl-2, envolvidas nos mecanismos intrínsecos da apoptose. Mais recentemente, a marcação de produtos específicos resultantes da clivagem de proteínas alvo pelas caspases, tem vindo a ser considerada uma abordagem promissora. Como principal objectivo deste trabalho pretendeu-se avaliar a técnica imunohistoquímica como método de deteção da apoptose a nível celular, em tecidos animais, tendo por base o método TUNEL, o qual permite a deteção de fragmentos de DNA. Os resultados obtidos permitiram concluir que, apesar do método TUNEL possuir as suas limitações ao nível da sensibilidade e especificidade, o mesmo constitui um mecanismo imunohistoquímico útil na deteção de células apoptóticas. Contudo, segundo opinião de vários autores, adverte-se para a necessidade da aplicação de pelo menos dois métodos imunohistoquímicos como forma de validar a ocorrência do processo apoptótico, razão pela qual se optou pela deteção do citocromo c citosólico como método complementar, uma vez que a sua libertação para o espaço citosólico se encontra implicada na ativação da apoptose.

Aplicação de técnicas de detecção de apoptose versus proliferação celular no estudo do mastocitoma canino

A apoptose é um mecanismo de morte celular programada que ocorre naturalmente nos tecidos. Alterações neste mecanismo podem resultar na formação de neoplasias. O mastocitoma é uma das neoplasias cutâneas mais frequente em canídeos. O fator de prognóstico mais utilizado é o grau histológico. Porém, devido à imprevisibilidade desta neoplasia é necessário um melhor conhecimento do comportamento da mesma para se melhorarem competências em oncologia. Neste projeto foram estudados 23 amostras de mastocitomas caninos de variadas idades, raça e sexo, que foram submetidas à técnica de imunohistoquímica de modo a analisar a expressão de dois marcadores pró-apoptóticos (TUNEL e Bax), um marcador antiapoptótico (Bcl-2) e um marcador proliferativo (Ki-67). A expressão de TUNEL, Bcl-2 e Ki-67 aumentou do grau I para o grau III do mastocitoma e a de Bax diminuiu. Houve também uma diminuição na expressão de Bax e Bcl-2 no mastocitomas de grau II e um ligeiro aumento na expressão de Ki-67 na mesma classe tumoral. Observou-se assim maior atividade anti-apoptótica e aumento da proliferação celular, associados a um ao prolongamento na sobrevivência das células neoplásicas e, consequentemente, a um pior prognóstico, no grau de malignidade mais severo o grau III.

Os efeitos das queimadas na Amazônia em nível celular e molecular

The Amazon holds over half of the planet's remaining tropical forests and comprises the largest biodiversity in the world, accounting for approximately 60 % of the Brazilian territory. However, deforestation fires in the region causes serious problems to exposed human. The aim of this study was to evaluate the chemical compounds as well as the cellular and molecular effects after exposure to organic material extracted from particulate matter less than 10 µm (PM10) in the Amazon region. As for the chemical composition, n-alkanes analysis showed a prevalence of anthropogenic influence during the fires in the region. In addition, there was a predominance of monosaccharides from biomass burning markers. Also, the Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) and their derivatives have also been identified in samples collected in the Amazon. By using the PAH concentrations was possible to calculate the BaP-equivalent and it was found that the dibenz(a) anthracene contributes with 83% to potential carcinogenic risk. As for the potential mutagenic risk, the benzo (a) pyrene is the HPA that has a major contribution in this analysis. It may be noted that the retene was the most abundant PAH. This compound was genotoxic and cause death by necrosis in the human lung cells. In biological tests, the data showed that organic PM10 is capable of causing genetic damage in both plant cells and in human lung cells. This damage cause an arrest in the G1 phase of the cell cycle exposed, increasing the expression of p53 and p21. Additionally, the PM10 caused cell death by apoptosis, increasing the foci of histone - H2AX. Given these results, it is important to emphasize the reduction and better control of biomass burning in the Amazon region thus improving the quality of health of the population being exposed. As clearly stated recently by the World Health Organization, the reduction of air pollution could save millions of lives annually.

Avaliação do efeito da inibição do reparo de sítios abásicos na resposta inflamatória celular

Base excision repair (BER) proteins has been associated with functions beyond DNA repair. Apurynic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) is a multifunctional protein involved in a plethora of cellular activities, such as redox activation of transcription factors, RNA processing and DNA repair. Some studies have described the action of the protein 8-oxoguanine (OGG1) in correcting oxidized lesions in promoters as a step in the transcription of pro-inflammatory cytokines. Despite being especially important in redox activation of transcription factors such as nuclear factor κB (NF-κB) and AP- 1, the repair activity of APE1 has not yet been associated with the inflammatory response. In this study, experimental and bioinformatic analysis approaches have been used to investigate the relationship between inhibition of the repair of abasic sites in DNA by MX, a synthetic molecule designed to inhibt the repair activity of APE1, and the modulation of the inflammatory response. The results showed that treatment of monocytes with lipopolysaccharide (LPS) and MX reduced the expression of cytokines, chemokines and toll-like receptors, and negatively regulated biological immune processes, as macrophages activation, and NF-κB and tumor necrosis factor (TNF-α) and interferon pathways, without inducing cell death. The transcriptomic analysis suggests that LPS/MX treatment induces mitochondrial dysfunction, endoplasmic reticulum stress and activation of autophagy pathways, probably activated by impairment of cellular energy and/or the accumulation of nuclear and mitochondria DNA damage. Additionally, it is proposed that the repair activity of APE1 is required for transcription of inflammatory genes by interaction with abasic sites at specific promoters and recruitment of transcriptional complexes during inflammatory signaling. This work presents a new perspective on the interactions between the BER activity and the modulation of inflammatory response, and suggests a new activity for APE1 protein as modulator of the immune response in a redox-independent manner.

Mecanismos de neurotoxicidade induzidos pela Dopamina e pela 6–OH-dopamina num modelo celular humano: efeito da presença de extratos de algas com elevada capacidade antioxidante

O aumento da esperança média de vida tem elevado a prevalência de doenças neurodegenerativas, como é o caso da doença de Parkinson. Nos últimos anos a procura de novas soluções terapêuticas, assim como a minimização dos efeitos dos tratamentos atualmente utilizados tem promovido a procura de novas soluções. Deste modo, o objetivo deste trabalho consistiu no estudo dos mecanismos moleculares de neurotoxicidade induzidos pela dopamina (DA) e 6-hidroxidopamina (6-OHDA) num modelo celular do neuroblastoma humano (SH-SY5Y), bem como na avaliação do potencial neuroprotetor de extratos de algas com elevada capacidade antioxidante. O efeito neurotóxico da DA e 6-OHDA, assim como o efeito protetor dos extratos das algas com maior atividade antioxidante (Sargassum muticum, Saccorhiza polyschides, Padina pavonica, Codium tomentosum, Ulva compressa) foi avaliado através da viabilidade celular das células SH-SY5Y utilizando o método de MTT. De modo a compreender os efeitos induzidos na viabilidade celular pela DA e 6-OHDA procedeu-se ao estudo da atividade da caspase-3, alterações do potencial mitocondrial e quantificação de H2O2. Os resultados demonstraram um claro efeito dependente da concentração da DA (30-3000μM) e 6-OHDA (10-1000μM) na viabilidade celular das células SH-SY5Y, bem como do tempo de exposição (6-48h). No que diz respeito a prevenção do efeito neurotóxico da DA (1000μM (56,41±5,05% de células viáveis); 24h) e 6-OHDA (100μM (66,76±3,24% de células viáveis);24h) pelos extratos das algas (1mg/mL; 24h) verificou-se que os extratos que apresentaram um efeito preventivo mais marcado pertencem as algas Sargassum muticum (82,37±6,41% de células viáveis e 115,8±8,53% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (89,26±8,62% de células viáveis e 106,51±4,26% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e Codium tomentosum (81,28±3,68% de células viáveis e 103,17±7,25% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). A morte celular induzida pela DA e pela 6-OHDA foi acompanhada pelo aumento da atividade da caspase-3 quando comparado com o controlo (DA - 66,46±1,49fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto; 6-OHDA - 22,56±1,71fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto; controlo – 4,8 ±0,48fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto), pela presença de elevadas quantidades de peróxido de hidrogénio (H2O2) (363,81±28,58 % do controlo e 214,26 ± 8,46 % do controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e pela despolarização da membrana mitocondrial (162,3±2,34 % do controlo e 144,7±2,87 % do controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). Por sua vez, durante o tratamento com extratos das algas (1mg/mL) na presença de DA e 6-OHDA verificou-se uma inibição da atividade da caspase-3 induzida pelas algas Sargassum muticum (2,53±2,49fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto e 4,52±1,36 fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (4,71±0,70fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto e 2,73±1,11 fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e Codium tomentosum (17,05±1,72fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto e 2,58±1,77fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). De igual modo verificou-se uma diminuição da produção de H2O2 pelas células SH-SY5Y na presença dos extratos das algas Sargassum muticum (132,58 ± 10,68% controlo), Saccorhiza polyschides (150,54 ± 23,54% controlo) e Codium tomentosum (54,074 ± 6,66% do controlo), quando expostas a 6-OHDA, contudo não se verificou o mesmo efeito na presença de DA. Relativamente ao potencial mitocondrial observou-se uma inibição da despolarização mitocondrial induzida pela DA e 6-OHDA nas células SH-SY5Y pela presença dos extratos das algas Sargassum muticum (135,7±2,97% controlo e 49,3±1,17% controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (126,7±5,46% controlo e 94,3±1,70% controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). Os resultados obtidos demonstraram o potencial citoprotetor dos extratos de algas sobre efeitos neurotóxicos induzidos pela DA e 6-OHDA no modelo celular SH-SY5Y. O efeito protetor é mediado pela diminuição da condição de stress oxidativo, com redução da produção de H2O2, diminuição da atividade da caspase-3 e prevenção da alteração do potencial mitocondrial induzido pela DA e 6-OHDA. Conclui-se que os extratos de algas produzem moléculas bioativas com elevado potencial antioxidante, podendo ser uma fonte promissora de novos compostos neuroprotetores com aplicação terapêutica para doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson.

Aderência, invasão e persistência intracelular de estreptococos do grupo B em células epiteliais respiratórias A549

Estreptococos do grupo B (EGB) comumente colonizam adultos saudáveis, sem sintomas, mas sob certas circunstâncias possui a capacidade de invadir tecidos do hospedeiro, evadir da detecção imunológica e causar doenças invasivas graves. Por conseguinte, os EGB continuam sendo uma das principais causas de mortalidade neonatal, pneumonia, sepse e meningite. Contudo, a patogênese desta infecção ainda está pouco elucidada. O sorotipo V é freqüentemente associado à doença invasiva em mulheres adultas não gestantes e o segundo mais prevalente em mulheres grávidas. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a aderência, invasão e persistência intracelular de amostras pertencentes ao sorotipo V (88641-vagina/portador e 90186-sangue/paciente) usando as células epiteliais respiratórias A549. As amostras de EGB demonstraram capacidade de aderir e invadir as células epiteliais A549, mas somente a amostra 90186-sangue apresentou maior invasão quando comparada com a de vagina (P <0.001). Ambas as amostras demonstraram persistência intracelular sem replicação no interior das células A549. Apenas o isolado 90186-sangue sobreviveu dentro das células epiteliais até 24h de incubação (P <0,05). A fusão dos lisossomas das células epiteliais com vacúolos contendo bactérias foi observada em células A549 tratadas com Lyso Tracker Grenn DND-26 para todas as amostras testadas. Nossos dados indicam pela primeira vez que as amostras viáveis do sorotipo V permanecem dentro de vacúolos ácidos epiteliais. Curiosamente, a amostra 90186- sangue induziu vacuolização celular e a amostra 88641-vagina promoveu a morte celular após 7h de incubação. Finalmente, nossos resultados aumentam o nosso conhecimento sobre eventos celulares da fagocitose e da patogênese das doenças invasivas promovidas pelos EGB.

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Variantes no gene MBL2 codificador da Lectina Ligante de Manose (MBL): implicações na leishmaniose visceral humana

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população por conferirem vantagem seletiva aos heterozigotos. Em relação aos 3 principais polimorfismos existentes na região promotora, verificamos ser a variante -221G (Y) a mais frequente (88%) seguida de +4C (P) (73%) e de -550C (L) (67%). Identificamos oito haplótipos em MBL2 num total de 644 cromossomos avaliados, em 30 combinações diferentes, sendo HYPA e LYQA os mais frequentes e HYPD e HYPB os mais raros. Todos os portadores de combinações de haplótipos homozigotos para alelos defectivos apresentaram níveis séricos de MBL indetectáveis. Os genótipos LYQA/LYQA e HYPA/HYPA apresentaram as maiores concentrações médias de MBL no soro. A combinação entre SNPs no éxon 1 e na região promotora do gene MBL2 resulta em grande variação nas concentrações de MBL em indivíduos saudáveis. Consideramos que o conjunto de dados gerados é uma contribuição valiosa que poderá ser expandida para outros cenários.

Análise da citotoxicidade do extrato do fruto de juçara (Euterpe oleracea Mart.) do Maranhão em células malignas humanas

A juçara, Euterpe oleracea Mart., fruta indígena da Amazônia Legal, é rica em fitoquímicos com atividades anti-oxidante, antiinflamatória e anti-câncer. Este estudo tem por objetivo analisar os efeitos do extrato hidroalcoólico da casca, caroço e fruto total da juçara em diferentes linhagens de células malignas humana. Os frutos foram coletados no Parque da Juçara, localizado no Maracanã, município de São Luís, seguida da confecção da excicata que se mantém registrada no Herbário Rosa Mochel do Núcleo de Estudos Biológicos da Universidade Estadual do Maranhão. Os extratos hidroalcoólicos da casca, caroço e fruto total foram extraidos no Laboratório de Farmacologia e Psicobiologia da UERJ. As linhagens celulares utilizadas nos ensaios foram MCF-7 (adenocarcinoma de mama), CACO-2 e HT-20 (adenocarcinoma colo retal) e adenocarcinoma na mama (MDA-MB-468). As linhagens foram tratadas com 10, 20 e 40g/mL dos extratos por 24 e 48 horas e feitas às análises. Células MCF-7 controle apresentaram núcleo proeminente com nucléolos evidentes. Após tratamento com o extrato hidroalcoólico da casca da juçara, as células mostraram morfologia arredondada com retração do citoplasma. O ensaio de viabilidade com MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)) demonstrou uma redução na viabilidade das células. Após 48 horas, o tratamento das células com 20g/mL do extrato da casca reduziu a viabilidade sendo que o efeito citotóxico do tratamento com 40g/mL do extrato da casca foi potencializado. Células tratadas com 10g/mL do extrato do caroço de juçara apresentavam-se arredondadas com consequente redução no volume celular. A concentração 20g/mL de extrato hidroalcoólico do caroço, causou severa redução no volume das células e ocasionou o surgimento de vacúolos intracelulares. O mesmo foi observado após tratamento com 40g/mL. O tratamento com 40g/mL do extrato hidroalcoólico do fruto total, modificou drasticamente a morfologia das células MCF-7 causando vacuolização e aparente lise com perda do conteúdo citoplasmático e o ensaio da viabilidade com MTT demonstrou redução na viabilidade das células MCF-7 tratadas com 20 e 40g/mL após 24 horas de tratamento. Análises por MET (Microscopia Eletrônica de Transmissão) demonstraram o surgimento de vesículas autofágicas, cuja comprovação deu-se com a identificação da expressão da proteína LC3BII na membrana do autofagossoma pela técnica de Western Blotting. Mediante o demonstrado pelos experimentos, com as linhagens MCF-7 e MDA-MB-468, confirma-se que as frações isoladas do extrato do caroço da juçara, promove modificações celulares indicativas de autofagia a partir de 10g/mL, em 24 horas. O núcleo permaneceu íntegro, não apresentando características de núcleo apoptótico. Os dados são conclusivos para ocorrência de morte celular por autofagia em linhagem celulares de carcinoma de mama MCF-7 quando tratadas com extrato hidroalcoólico da casca, caroço e fruto total da juçara do Maranhão, agente quimiopreventivo no câncer de mama estrogênio-dependente.