Infecção de mycobacterium bovis em células fagocíticas: estratégia aplicada ao diagnóstico da tuberculose bovina

Neste trabalho foram estudadas as interacções entre Mycobacterium bovis e células hospedeiras, na perspectiva de aplicar os conhecimentos resultantes desse estudo ao melhoramento do diagnóstico da tuberculose bovina. Foi estudada a dinâmica da infecção de células fagocíticas com estirpes de M. bovis, com ênfase para a invasão e multiplicação intracelular das micobactérias. Avaliações efectuadas por citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e contagem de colónias demonstraram que as micobactérias invadiram e replicaram em todos os modelos celulares, sendo que as células epiteliais de pulmão de bovino foram as mais permissivas ao seu crescimento. Foi nas células macrofágicas J774 e THP-1 que se verificaram as maiores concentrações micobacterianas, pelo que foram utilizadas para a detecção e identificação de M. bovis por um método molecular. A optimização da extracção de DNA, por um processo mecânico, e o desenvolvimento do método de PCR-RFLP baseado no gene gyrB, com controlo interno, permitiram a identificação de M. bovis. A sensibilidade deste método foi de 100% quando aplicado a estirpes isoladas e apenas de 40% quando utilizado directamente em amostras de macerados de tecidos de bovinos com tuberculose. Uma pré-incubação (3 dias) das amostras nas culturas celulares contribuiu para melhorar significativamente a sensibilidade (77%) do PCR-RFLP gyrB. A cultura celular, como matriz a ser utilizada para aumentar a quantidade de M. bovis presente em amostras biológicas, revela-se um método promissor para o diagnóstico laboratorial rápido, específico e sensível da tuberculose bovina. ### - Summary - Interactions between Mycobacterium bovis and host cells were studied with the purpose to apply the outcome knowledge in the improvement of bovine tuberculosis diagnosis. The dynamic of infection of four cell models with three strains of M. bovis was evaluated, with emphasis given to the invasion and intracellular multiplication of mycobacteria. Assessments by flow cytometry, fluorescence microscopy and colony counting showed that every cell models permitted the replication of mycobacteria, although bovine lung epithelial cells had been the most permissive one. The highest mycobacteria) load was found, however, in J774 and THP-1 macrophages, and hence these cells were used for the optimization of a molecular method for detection and identification of M. bovis. The optimisation of a DNA extraction step, by a mechanical process, and the development of PCR-RFLP based on gyrB gene, with an internal control, allowed the identification of M. bovis. The sensitivity of this method was 100% when applied to isolated strains and only 40% when directly used on samples of macerated of tissues from cattle with tuberculosis. Assays in which a pre-incubation step (three days) of biological samples in cell cultures was introduced significantly improved the sensitivity (77%) of the gyrB PCR-RFLP. Cell cultures as a support for growth and rapid isolation of M. bovis is a promising method for the specific, sensitive and rapid laboratorial diagnosis of bovine tuberculosis.

Human factors required for mycobacterium tuberculosis macrophage infection

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

O escarro induzido no diagnóstico das doenças pulmonares em pacientes positivos ao vírus da imunodeficiência humana

A indução de escarro é uma técnica utilizada amplamente para monitorar a inflamação de vias aéreas, porém sua importância como ferramenta diagnóstica de doenças pulmonares em pacientes imunocomprometidos ainda necessita de melhor definição. Com o objetivo de determinar o seu rendimento no diagnóstico das doenças pulmonares em pacientes positivos ao HIV, no período de janeiro de 2001 a setembro de 2002, foram avaliados todos os pacientes com idade superior a 14 anos, infectados com o vírus da imunodeficiência humana, admitidos no Hospital Nereu Ramos (Florianópolis – Santa Catarina – Brasil). Foram incluídos no estudo aqueles indivíduos que apresentavam manifestações clínicas do aparelho respiratório há pelo menos 7 dias, associadas, ou não, a sinais radiológicos de doença pulmonar. Também foram incluídos indivíduos assintomáticos do ponto de vista respiratório, mas que apresentavam alterações no radiograma de tórax. Todos os pacientes foram submetidos à avaliação clínica, radiológica e laboratorial e realizaram a indução de escarro, seguida pela broncofibroscopia, lavado broncoalveolar e biópsia pulmonar transbrônquica. As amostras obtidas foram processadas para bacterioscopia pelo método de Gram e Ziehl-Neelsen, cultura quantitativa para bactérias, exame micológico direto, cultura para micobactérias e fungos, pesquisa de citomegalovírus e Pneumocystis jiroveci, bem como celularidade total e diferencial. De um total de 547 pacientes, 54 com idade média de 35,7 anos foram incluídos no estudo. Destes, 79,6% pertencentes ao sexo masculino e 85,2% caucasianos. A contagem média de linfócitos TCD4+ foi de 124,8/mm3. O padrão radiológico mais comum foi o intersticial (44,4%). A pesquisa de agente etiológico resultou negativa em 7 pacientes, sendo que nos 47 casos restantes foram isolados 60 agentes. Dentre os agentes isolados, 46,7% foram P. jiroveci; 33,5% bactérias piogênicas e 16,7% M. tuberculosis. O escarro induzido apresentou sensibilidade de 57,5%, especificidade de 42,9%, valor preditivo positivo de 87,1%, valor preditivo negativo de 13,0% e acurácia de 55,6%. Estes resultados sugerem que, nesta população, a análise do escarro induzido é um procedimento simples, seguro e com bom rendimento diagnóstico.

Identificação e diferenciação do Mycobacterium tuberculosis pela amplificação do DNA das regiões intergênicas dos operons inhA e pIC

Entre as doenças causadas por bactérias do gênero Mycobacterium, a tuberculose por M. tuberculosis é a mais conhecida. O diagnóstico da doença é feito utilizando-se um conjunto de exames que possibilitam a identificação da mesma (WATT, 2000). Contudo, sabe-se que o diagnóstico combinado de microscopia direta e com o posterior isolamento em meio de cultivo é o “padrão-ouro”. A principal desvantagem desse método é que tal bactéria possui um crescimento lento (cerca de 8 semanas). Recentemente, a detecção de doenças através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem proporcionado avanços significativos no diagnóstico. O uso da amplificação específica de genes, para identificar a M. tuberculosis, tais como rDNA 16S, IS6110 ou a região intergênica senX3-regX3, tem apresentado algumas restrições, ao nível de confiabilidade e sensibilidade, para a aplicação da técnica de PCR. O presente estudo mostra a construção e a aplicação de um novo alvo para a aplicação da PCR no diagnóstico da tuberculose, baseado no ensaio da diferença de organização gênica do operon plcA, B e C diferenciando a M. tuberculosis das demais micobactérias. Neste trabalho, foram examinadas 273 amostras de pacientes com suspeita de tuberculose, sendo estas submetidas ao estudo comparativo da técnica de PCR versus cultivo (padrão ouro). A PCR amplificou fragmentos de 439pb. Os resultados mostram 93,7% de acurácia para PCR/Cultivo (p<000,1), 93,1% de sensibilidade com intervalo de confiança de 88,7-96,0 e especificidade de 96,4% com intervalo de confiança de 96,4-99,4. O valor da estatística Kappa (k) foi de 0,82 com erro padrão de 0,041, demonstrando um alinhamento quase perfeito para a verificação do grau de concordância entre os testes. Desta forma, o uso desta nova região para a amplificação da PCR se mostra uma importante e confiável ferramenta no diagnóstico específico da tuberculose. Outra região que compreende parte dos genes mbaA e inhA foi utilizada para diferenciar o Complexo tuberculosis do Complexo avium. Porém, novos experimentos serão necessários para o emprego desta região como uma ferramenta de diagnóstico.

Isolation of Mycobacterium spp. in milk from cows suspected or positive to tuberculosis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Estudo da atividade antimicobacteriana de extratos vegetais do cerrado brasileiro

Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR

Isolamento e identificação de micobacterias e microrganismos indicadores de contaminação em águas tratadas provenientes do sistema de abstecimento público de Araraquara-SP

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Estudo da epidemiologia molecular da tuberculose em pacientes de Araraquara-SP, no período de 2002 à 2006

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Estudo estrutural de proteínas alvo de Mycobacterium tuberculosis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Pesquisa de Micobacterium Leprae e outras microbactérias em Tatus Selvagens

Pós-graduação em Doenças Tropicais - FMB

Efeito da infecção com Strongyloides venezuelensis no desenvolvimento da encefalite autoimune (EUA)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Adenopatia cervical tuberculosa em crianças: aspectos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais

A tuberculose constitui um sério problema de saúde pública, sendo o M. tuberculosis o principal agente da doença no Brasil. Entre as formas extra pulmonares, a ganglionar periférica é uma das mais freqüentes na infância, apesar de pouco estudada. Com o objetivo de avaliar a incidência e conhecer os aspectos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais da tuberculose ganglionar foram atendidas no ambulatório do Hospital Ofir Loiola, no período de janeiro de 1995 a dezembro de 1996, 73 crianças entre 0-14 anos, de ambos os sexos, portadoras de linfadenopatia cervical. A amostra foi dividida em dois grupos: o primeiro constituído por 61 crianças com adenopatias de outras etiologias e o segundo formado de 12 pacientes com etiologia tuberculosa. Nesse período, para as adenopatias tuberculosas, a taxa anual de incidência na área metropolitana de Belém, por 100 mil habitantes, foi de 1,03 e para o grupo de outras etiologias a incidência foi de 4,27 e 6,15 para os anos de 1995 e 1996, respectivamente. Verificou-se que a maioria das adenopatias na infância foram inespecíficas (64,4%), entretanto, quando consideradas somente as de etiologia conhecida, o risco relativo de ser tuberculose foi de 1,17. A análise comparativa entre os dois grupos não revelou diferença estatisticamente significativa no que tange à faixa etária, sexo, estado nutricional, apresentação clínica inicial, cadeias ganglionares comprometidas e características dos linfonodos. Em ambos foi observado maior incidência em pré-escolares e no sexo masculino. O comprometimento do estado nutricional pode ter contribuído para o aumento da morbidade em 41,7% dos casos de tuberculose. A presença de massa cervical constitui a queixa principal nos dois grupos embora durante o exame tenha sido constatado comprometimento ganglionar generalizado em 75,1% das crianças com adenopatia tuberculosa. Quanto à duração dos sintomas, os casos de adenopatia tuberculosa foram atendidos a partir do primeiro mês de doença e tiveram como manifestação clínica abscesso frio em 25% dos casos. A fonte de infecção foi identificada em 1/3 dos pacientes. A reação tuberculínica com leitura >10mm foi positiva em 63,6% das crianças tuberculosas. Entre os exames bacteriológicos realizados, a cultura constituiu o elemento fundamental para o diagnóstico de tuberculose, obtendo-se 100% de positividade nos exames realizados; a baciloscopia foi de menor importância. O exame histopatológico com lesão granulomatosa compatível com tuberculose foi observado em 88,9% dos casos. O comprometimento pulmonar associado esteve presente em 27, 3% das crianças tuberculosas. A resposta à terapêutica com esquema padronizado pelo Ministério da Saúde foi satisfatória, não tendo sido observados efeitos colaterais aos medicamentos utilizados.

Valorização do diagnóstico laboratorial, na identificação de Rhodococcus equi isolado do escarro de pacientes suspeitos de tuberculose

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Acúmulo de colesterol por Mycobacterium smegmatis como possível modulador da biossíntese de lipomanana e lipoarabinomanana

A parede celular micobacteriana é uma característica marcante do gênero Mycobacterium, apresentando lipídios e glicoconjugados bioativos, como fosfatidilinositol manosídeos (PIMs), lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM). A infecção crônica no interior de macrófagos pulmonares é relacionada com o acúmulo de colesterol na célula hospedeira, conferindo uma fonte alternativa de energia e carbono para o bacilo manter suas funções fisiológicas. Com base na atividade imunomoduladora desses glicoconjugados e na adaptação em outro ambiente no interior da célula hospedeira infectada, propomos investigar a possível modulação da biossíntese de LM/LAM em Mycobacterium smegmatis (saprofítico), após o cultivo em meio mínimo (MM) suplementado com glicerol e/ou colesterol. Como resultados, obtivemos que o bacilo, mesmo sendo saprofítico, foi capaz de acumular colesterol e influenciar na fisiologia bacteriana por apresentar um crescimento lento com densidade bacteriana comprometida. Além disso, o colesterol diminuiu o acúmulo de PIMs e promoveu mudanças morfológicas e de agregação bacteriana, mesmo mantendo a parede celular com sua característica físico-química específica (resistência a descoloração por álcool e ácido). A mudança mais marcante induzida pelo consumo do colesterol foi na biossíntese de LAM, que apresentou migração eletroforética diferenciada, compatível às massas moleculares maiores, assemelhando-se a de bacilos não saprofíticos (de 25 – 30 KDa para 30 – 50 KDa). Estes resultados mostram que o colesterol, quando utilizado como principal alternativa de fonte de energia e carbono, pode induzir mudanças fisiológicas em micobactérias, principalmente na biossíntese de LAM, uma das principais moléculas imunoreguladoras presente na parede celular. Estes dados sugerem que micobactérias podem sofrer mudanças semelhantes no interior de granulomas, e que estas mudanças podem ajudar na evolução da tuberculose para a forma crônica multibacilar, marcada por um aspecto imunodeficiente contra o bacilo.

Composto de prata com aspartame, processo de preparação do composto e agente bactericida obtido a partir do composto

Especialmente desenvolvido contra as micobactérias. O dito composto apresentando a composição e ser preparado pela reação entre Aspartame e nitrato de prata em meio neutro, possuindo a atividade bactericida contra as micobactérias a saber: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium malmoense e Mycobacterium kansasii.