Molekulare Grundlagen der Immunkontrolle des murinen Cytomegalovirus in Gegenwart viruskodierter Immunevasine

Die Kontrolle der Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) wird primär durch antivirale CD8 T-Zellen vermittelt. Während der Koevolution zwischen Virus und Wirt wurden Immunevasionsmechanismen entwickelt, die direkt die Expression der Peptid-MHC-Klasse-I-Komplexe an der Zelloberfläche beeinflussen und es dem Virus ermöglichen, der Immunkontrolle des Wirtes zu entkommen. Da HCMV und das murine CMV (mCMV) zum Teil analoge Strategien zur Modulation des MHC-Klasse-I-Antigen-Präsentationswegs entwickelt haben, wurde in der vorliegenden Arbeit auf das experimentelle Modell mit mCMV zurückgegriffen. Die für die Immunevasion verantwortlichen Genprodukte m04/gp34, m06/gp48 und m152/gp40 werden aufgrund ihres regulatorischen Einflusses auf die Antigenpräsentation als vRAPs (viral regulators of antigen presentation) bezeichnet. Diese interferieren mit dem Transport Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Moleküle und reduzieren in ihrer konzertierten Wirkung die Präsentation viraler Peptide an der Zelloberfläche.rnDie Transplantation hämatopoietischer Zellen nach Immunoablation stellt eine etablierte Therapieform bei malignen hämatologischen Erkrankungen dar. Zwischen Immunoablation und der Rekonstitution des Immunsystems sind die Empfänger der transferierten Zellen stark immunsupprimiert und anfällig für eine CMV-Erkrankung bei Reaktivierung des Virus. Neben der Gabe antiviraler Medikamente ist der adoptive Transfer antiviraler CD8 T-Zellen eine vielversprechende Therapiemöglichkeit, um reaktivierende CMV zu kontrollieren, bis das körpereigene Immunsystem wieder funktionsfähig ist. Obwohl im murinen Modell sehr wohl etabliert, stellen im humanen System die eingeschränkte Wirkung und die Notwendigkeit der konsequenten Gabe hoher Zellzahlen gewisse logistische Schwierigkeiten dar, welche die Methode bisher von der klinischen Routine ausschließen.rnDas murine Modell sagte eine Rolle von IFN-γ voraus, da Depletion dieses Zytokins zu einer verminderten Schutzwirkung gegen die mCMV-Infektion führt.rnIm ersten Teil dieser Arbeit sollte ein möglicher inhibitorischer Effekt von m04 auf m152 untersucht werden, der bei der Rekombinanten Δm06W beobachtet wurde. Mit neu generierten Viren (Δm06L1+2) konnte dieser Effekt allerdings nicht bestätigt werden. Bei Δm06W fehlte jedoch eine höher N-glykosylierte Isoform des m152-Proteins. Um zu untersuchen, ob die N-Glykosylierung von m152 für seine Funktion notwendig ist, wurde ein rekombinantes Virus generiert, das in Folge einer Deletion aller 3 N-Glykosylierungssequenzen nur eine nicht-glykosylierte Isoform des m152-Proteins bilden kann. In Übereinstimmung mit der zwischenzeitlich publizierten Kristallstruktur das Komplexes von m152 und dem Liganden RAE-1 des aktivierenden NK-Zellrezeptors NKG2D konnte erstmals gezeigt werden, dass die Funktionen von m152 in der adaptiven und in der angeborenen Immunität auch von der nicht N-glykosylierten Isoform wahrgenommen werden können.rnIm zweiten Teil der Arbeit sollte mit Hilfe eines Sets an vRAP Deletionsmutanten der Einfluss von IFN γ auf die einzeln oder in Kombination exprimierten vRAPs untersucht werden. Es zeigte sich, dass Vorbehandlung der Zellen mit IFN-γ die Antigenprozessierung nach Infektion stark erhöht und die vRAPs dann nicht mehr in der Lage sind, die Präsentation aller Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Komplexe zu verhindern. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass vorher nicht-schützende CD8 T-Zellen Schutz vermitteln können, wenn das Gewebe der Rezipienten konstitutiv mit IFN-γ versorgt wird. Die zusätzliche Gabe von IFN-γ stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, den adoptiven Transfer als Therapie in der klinischen Routine einzusetzen.

Kinetics of ocular and systemic antigen-specific T-cell responses elicited during murine cytomegalovirus retinitis

Cytomegalovirus (CMV) reactivation in the retina of immunocompromized patients is a cause of significant morbidity as it can lead to blindness. The adaptive immune response is critical in controlling murine CMV (MCMV) infection in MCMV-susceptible mouse strains. CD8(+) T cells limit systemic viral replication in the acute phase of infection and are essential to contain latent virus. In this study, we provide the first evaluation of the kinetics of anti-viral T-cell responses after subretinal infection with MCMV. The acute response was characterized by a rapid expansion phase, with infiltration of CD8(+) T cells into the infected retina, followed by a contraction phase. MCMV-specific T cells displayed biphasic kinetics with a first peak at day 12 and contraction by day 18 followed by sustained recruitment of these cells into the retina at later time points post-infection. MCMV-specific CD8(+) T cells were also observed in the draining cervical lymph nodes and the spleen. Presentation of viral epitopes and activation of CD8(+) T cells was widespread and could be detected in the spleen and the draining lymph nodes, but not in the retina or iris. Moreover, after intraocular infection, antigen-specific cytotoxic activity was detectable and exhibited kinetics equivalent to those observed after intraperitoneal infection with the same viral dose. These data provide novel insights of how and where immune responses are initiated when viral antigen is present in the subretinal space.

Interaction between conventional dendritic cells and natural killer cells is integral to the activation of effective antiviral immunity

Dendritic cells (DCs) regulate various aspects of innate immunity, including natural killer (NK) cell function. Here we define the mechanisms involved in DC - NK cell interactions during viral infection. NK cells were efficiently activated by murine cytomegalovirus ( MCMV) - infected CD11b(+) DCs. NK cell cytotoxicity required interferon-alpha and interactions between the NKG2D activating receptor and NKG2D ligand, whereas the production of interferon-gamma by NK cells relied mainly on DC-derived interleukin 18. Although Toll-like receptor 9 contributes to antiviral immunity, we found that signaling pathways independent of Toll-like receptor 9 were important in generating immune responses to MCMV, including the production of interferon-alpha and the induction of NK cell cytotoxicity. Notably, adoptive transfer of MCMV-activated CD11b(+) DCs resulted in improved control of MCMV infection, indicating that these cells participate in controlling viral replication in vivo.