On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

Chimpanzees and supporting models in the study of malaria pre-erythrocytic stages

Chimpanzees are being used in the study of immune response to Plasmodium falciparum malaria pre-erythrocytic stages (MPES). Responses induced by immunisation with recombinant/synthetic antigens and by irradiated sporozoites are being evaluated in a model system that is phylogenetically close to humans and that is amenable to limited manipulation not possible in humans. The value of chimpanzees for the in-depth study of immunological mechanisms at work in MPES-induced protection are discussed. A total number of 7 chimpanzees have been used to evaluate the immune response to recombinant antigens, and 5 have been challenged with large numbers of sporozoites, followed by surgical liver-wedge resection, in order to generate infected liver tissue for histological and immunological studies. As a complementary model, SCID mice carrying live, transplanted human and primate hepatocytes have been inoculated with sporozoites and infection of transplanted cells has been monitored by histological and immunological methods. In ongoing experiments chimpanzees are being immunised with MPES-derived lipopeptides that have been shown to overcome MHC restriction in mice, and with irradiated sporozoites.

The human immunodeficiency virus preventive vaccine research at the French National Agency for acquired immunodeficiency syndrome research

The human immunodeficiency virus/acquired immunodeficiency syndrome (HIV/AIDS) epidemic is of unprecedented gravity and is spreading rapidly, notably in the most disadvantaged regions of the world. The search for a preventive vaccine is thus an absolute priority. For over 10 years the French National Agency for AIDS research (ANRS) has been committed to an original program combining basic science and clinical research. The HIV preventive vaccine research program run by the ANRS covers upstream research for the definition of immunogens, animal models, and clinical research to evaluate candidate vaccines. Most researchers in 2004 believe that it should be possible to obtain partial vaccine protection through the induction of a strong and multiepitopic cellular response. Since 1992, the ANRS has set up 15 phases I and II clinical trials in order to evaluate the safety and the capacity of the candidate vaccines for inducing cellular immune responses. The tested candidate vaccines were increasingly complex recombinant canarypox viruses (Alvac) containing sequences coding for certain viral proteins, utilized alone or combined with other immunogens (whole or truncated envelope proteins). ANRS has also been developing an original strategy based on the utilization of lipopeptides. These comprise synthetic fragments of viral proteins associated with lipids that facilitate the induction of a cellular immune response. These approaches promptly allowed the assessment of a prime-boost strategy combining a viral vector and lipopeptides.

Effect of two types of biosurfactants on phenanthrene availability to the bacterial bioreporter Burkholderia sartisoli strain RP037.

Biosurfactants are tensio-active agents that have often been proposed as a means to enhance the aqueous solubility of hydrophobic organic contaminants, such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Biosurfactant-producing bacteria such as those belonging to the genus Pseudomonas might therefore enhance PAH availability to PAH-degrading bacteria. We tested the effects of two types of biosurfactants produced by Pseudomonas sp., cyclic lipopeptides and rhamnolipids, on phenanthrene bioavailability. Bioavailability was judged from growth rates on phenanthrene and from specific induction of a phenanthrene-responsive GFP-reporter in Burkholderia sartisoli strain RP037. Co-culturing of strain RP037 with the lipopeptide-producing bacterium Pseudomonas putida strain PCL1445 enhanced GFP expression compared to a single culture, but this effect was not significantly different when strain RP037 was co-cultivated with a non-lipopeptide-producing mutant of P. putida. The addition of partially purified supernatant extracts from the P. putida lipopeptide producer equally did not unequivocally enhance phenanthrene bioavailability to strain RP037 compared to controls. In contrast, a 0.1% rhamnolipid solution strongly augmented RP037 growth rates on phenanthrene and led to a significantly larger proportion of cells in culture with high GFP expression. Our data therefore suggest that biosurfactant effects may be strongly dependent on the strain and type of biosurfactant.

European guidelines for antifungal management in leukemia and hematopoietic stem cell transplant recipients: summary of the ECIL 3--2009 update.

In 2005, several groups, including the European Group for Blood and Marrow Transplantation, the European Organization for Treatment and Research of Cancer, the European Leukemia Net and the Immunocompromised Host Society created the European Conference on Infections in Leukemia (ECIL). The main goal of ECIL is to elaborate guidelines, or recommendations, for the management of infections in leukemia and stem cell transplant patients. The first sets of ECIL slides about the management of invasive fungal disease were made available on the web in 2006 and the papers were published in 2007. The third meeting of the group (ECIL 3) was held in September 2009 and the group updated its previous recommendations. The goal of this paper is to summarize the new proposals from ECIL 3, based on the results of studies published after the ECIL 2 meeting: (1) the prophylactic recommendations for hematopoietic stem cell transplant recipients were formulated differently, by splitting the neutropenic and the GVHD phases and taking into account recent data on voriconazole; (2) micafungin was introduced as an alternative drug for empirical antifungal therapy; (3) although several studies were published on preemptive antifungal approaches in neutropenic patients, the group decided not to propose any recommendation, as the only randomized study comparing an empirical versus a preemptive approach showed a significant excess of fungal disease in the preemptive group.

Regulation of antibiotic production in root-colonizing Peudomonas spp. and relevance for biological control of plant disease.

Certain strains of fluorescent pseudomonads are important biological components of agricultural soils that are suppressive to diseases caused by pathogenic fungi on crop plants. The biocontrol abilities of such strains depend essentially on aggressive root colonization, induction of systemic resistance in the plant, and the production of diffusible or volatile antifungal antibiotics. Evidence that these compounds are produced in situ is based on their chemical extraction from the rhizosphere and on the expression of antibiotic biosynthetic genes in the producer strains colonizing plant roots. Well-characterized antibiotics with biocontrol properties include phenazines, 2,4-diacetylphloroglucinol, pyoluteorin, pyrrolnitrin, lipopeptides, and hydrogen cyanide. In vitro, optimal production of these compounds occurs at high cell densities and during conditions of restricted growth, involving (i) a number of transcriptional regulators, which are mostly pathway-specific, and (ii) the GacS/GacA two-component system, which globally exerts a positive effect on the production of extracellular metabolites at a posttranscriptional level. Small untranslated RNAs have important roles in the GacS/GacA signal transduction pathway. One challenge in future biocontrol research involves development of new strategies to overcome the broad toxicity and lack of antifungal specificity displayed by most biocontrol antibiotics studied so far.

Calcium-Mediated Induction of Paradoxical Growth following Caspofungin Treatment Is Associated with Calcineurin Activation and Phosphorylation in Aspergillus fumigatus.

The echinocandin antifungal drug caspofungin at high concentrations reverses the growth inhibition of Aspergillus fumigatus, a phenomenon known as the "paradoxical effect," which is not consistently observed with other echinocandins (micafungin and anidulafungin). Previous studies of A. fumigatus revealed the loss of the paradoxical effect following pharmacological or genetic inhibition of calcineurin, yet the underlying mechanism is poorly understood. Here, we utilized a codon-optimized bioluminescent Ca(2+) reporter aequorin expression system in A. fumigatus and showed that caspofungin elicits a transient increase in cytosolic free Ca(2+) ([Ca(2+)]c) in the fungus that acts as the initial trigger of the paradoxical effect by activating calmodulin-calcineurin signaling. While the increase in [Ca(2+)]c was also observed upon treatment with micafungin, another echinocandin without the paradoxical effect, a higher [Ca(2+)]c increase was noted with the paradoxical-growth concentration of caspofungin. Treatments with a Ca(2+)-selective chelator, BAPTA [1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid], or the L-type Ca(2+) channel blocker verapamil abolished caspofungin-mediated paradoxical growth in both the wild-type and the echinocandin-resistant (EMFR-S678P) strains. Concomitant with increased [Ca(2+)]c levels at higher concentrations of caspofungin, calmodulin and calcineurin gene expression was enhanced. Phosphoproteomic analysis revealed that calcineurin is activated through phosphorylation at its serine-proline-rich region (SPRR), a domain previously shown to be essential for regulation of hyphal growth, only at a paradoxical-growth concentration of caspofungin. Our results indicate that as opposed to micafungin, the increased [Ca(2+)]c at high concentrations of caspofungin activates calmodulin-calcineurin signaling at both a transcriptional and a posttranslational level and ultimately leads to paradoxical fungal growth.

Membrane interaction of a new synthetic antimicrobial lipopetide sp-85 with broad spectrum activity

Antimicrobial peptides offer a new class of therapeutic agents to which bacteria may not be able todevelop genetic resistance, since their main activity is in the lipid component of the bacterial cell mem-brane. We have developed a series of synthetic cationic cyclic lipopeptides based on natural polymyxin,and in this work we explore the interaction of sp-85, an analog that contains a C12 fatty acid at theN-terminus and two residues of arginine. This analog has been selected from its broad spectrum antibac-terial activity in the micromolar range, and it has a disruptive action on the cytoplasmic membrane ofbacteria, as demonstrated by TEM. In order to obtain information on the interaction of this analog withmembrane lipids, we have obtained thermodynamic parameters from mixed monolayers prepared withPOPG and POPE/POPG (molar ratio 6:4), as models of Gram positive and Gram negative bacteria, respec-tively. LangmuirBlodgett films have been extracted on glass plates and observed by confocal microscopy,and images are consistent with a strong destabilizing effect on the membrane organization induced bysp-85. The effect of sp-85 on the membrane is confirmed with unilamelar lipid vesicles of the same com-position, where biophysical experiments based on fluorescence are indicative of membrane fusion andpermeabilization starting at very low concentrations of peptide and only if anionic lipids are present.Overall, results described here provide strong evidence that the mode of action of sp-85 is the alterationof the bacterial membrane permeability barrier.

Self-assembling amphiphilic peptides

The self-assembly of several classes of amphiphilic peptides is reviewed, and selected applications are discussed. We discuss recent work on the self-assembly of lipopeptides, surfactant-like peptides and amyloid peptides derived from the amyloid-β peptide. The influence of environmental variables such as pH and temperature on aggregate nanostructure is discussed. Enzyme-induced remodelling due to peptide cleavage and nanostructure control through photocleavage or photo-cross-linking are also considered. Lastly, selected applications of amphiphilic peptides in biomedicine and materials science are outlined.

Evaluation of rhamnolipid and surfactin to reduce the adhesion and remove biofilms of individual and mixed cultures of food pathogenic bacteria

Biofilms represent a great concern for food industry, since they can be a source of persistent contamination leading to food spoilage and to the transmission of diseases. To avoid the adhesion of bacteria and the formation of biofilms, an alternative is the pre-conditioning of surfaces using biosurfactants, microbial compounds that can modify the physicochemical properties of surfaces changing bacterial interactions and consequently adhesion. Different concentrations of the biosurfactants, surfactin from Bacillus subtilis and rhamnolipids from Pseudomonas aeruginosa, were evaluated to reduce the adhesion and to disrupt biofilms of food-borne pathogenic bacteria. Individual cultures and mixed cultures of Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Salmonella Enteritidis were studied using polystyrene as the model surface. The pre-conditioning with surfactin 0.25% reduced by 42.0% the adhesion of L monocytogenes and S. Enteritidis, whereas the treatment using rhamnolipids 1.0% reduced by 57.8% adhesion of L monocytogenes and by 67.8% adhesion of S. aureus to polystyrene.Biosurfactants were less effective to avoid adhesion of mixed cultures of the bacteria when compared with individual cultures. After 2 h contact with surfactin at 0.1% concentration, the pre-formed biofilms of S. aureus were reduced by 63.7%, L. monocytogenesby 95.9%, S. Enteritidis by 35.5% and the mixed culture biofilm by 58.5%. The rhamnolipids at 0.25% concentration removed 58.5% the biofilm of S. aureus, 26.5% of L monocytogenes, 23.0% of S. Enteritidis and 24.0% the mixed culture after 2 h contact. In general, the increase in concentration of biosurfactants and in the time of contact decreased biofilm removal percentage. These results suggest that surfactin and rhamnolipids can be explored to control the attachment and to disrupt biofilms of individual and mixed cultures of the food-borne pathogens. (C) 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Mimicking the pre-hairpin intermediate of gp41

A novel screening platform for potential retroviral fusion inhibitors on the basis of fully functional membrane‐anchored coiled coil lipopeptide receptors has been established. The work comprises the scrutiny of lateral organization of functional lipids in phase separated bilayers and an in‐depth investigation of the biophysical properties of lipopeptide‐based receptors. Lateral sorting of lipids was detected by the recognition of streptavidin of biotinylated lipids in phase separated bilayers and by nanoscopic patterns in mixed fluorocarbon / hydrocarbon lipid bilayers, employing temperature controlled atomic force microscopy (AFM) as a versatile characterization method. Particular features of fluorocarbon bilayers were additionally investigated in great detail by means of ellipsometry and ATR‐IR spectroscopy. Lipopeptide‐receptors were synthesized on the basis of a robust and reliable in situ coupling reaction by coupling terminal cysteine modified receptor‐peptides to a maleimide functionalized lipid bilayer. Receptor functionality of the lipopeptides was visualized by specific binding of vesicles and nanoparticles tracked by a multiplicity of characterization methods, such as AFM, ellipsometry, CLSM and fluorescence spectroscopy. Finally, in situ coupling of viral peptides, originating from the fusion protein of HIV resulted in a mimic of the pre‐hairpin intermediate of gp41. Structural analysis of N36‐lipopepides by means of CD‐spectroscopy in combination with FT‐IR spectroscopy revealed a coiled coil assembly of lipopeptides, which render the aggregates fully functional receptors for potent fusion inhibitors. Thereby, reversible inhibitor binding of T20 and the corresponding C‐ peptides was detected by AFM and ellipsometry, rendering coiled coil lipopeptides a new promising technique for screening of retroviral fusion inhibitors.

Potential of lipid core peptide technology as a novel self-adjuvanting vaccine delivery system for multiple different synthetic peptide immunogens

This study demonstrates the effectiveness of a novel self-adjuvanting vaccine delivery system for multiple different synthetic peptide immunogens by use of lipid core peptide (LCP) technology. An LCP formulation incorporating two different protective epitopes of the surface antiphagocytic M protein of group A streptococci (GAS)-the causative agents of rheumatic fever and subsequent rheumatic heart disease-was tested in a murine parenteral immunization and GAS challenge model. Mice were immunized with the LCP-GAS formulation, which contains an M protein amino-terminal type-specific peptide sequence (8830) in combination with a conserved non-host-cross-reactive carboxy-terminal C-region peptide sequence (J8) of the M protein. Our data demonstrated immunogenicity of the LCP-8830-J8 formulation in B10.BR mice when coadministered in complete Freund's adjuvant and in the absence of a conventional adjuvant. In both cases, immunization led to induction of high-titer GAS peptide-specific serum immunoglobulin G antibody responses and induction of highly opsonic antibodies that did not cross-react with human heart tissue proteins. Moreover, mice were completely protected from GAS infection when immunized with LCP-8830-J8 in the presence or absence of a conventional adjuvant. Mice were not protected, however, following immunization with an LCP formulation containing a control peptide from a Schistosoma sp. These data support the potential of LCP technology in the development of novel self-adjuvanting multi-antigen component vaccines and point to the potential application of this system in the development of human vaccines against infectious diseases.

Increased adjuvant activity of minimal CD8 T cell peptides incorporated into lipid-core-peptides

A problem facing the use of subunit peptide and protein vaccines is their inability to stimulate protective immune responses. Many different approaches have been utilized to overcome this inefficient immune activation. The approach we have taken is to modify the vaccine antigen so that it now has adjuvant properties. To do this, multiple copies of minimal CD8 T cell epitopes were attached to a poly lysine lipid core. These constructs are known as lipid-core-peptides (LCP). The research presented here examines the adjuvant activity of LCP. Using mouse models, we were able to show that LCP were indeed able to activate antigen-presenting cells in vitro and to activate cytotoxic T-cell responses in vivo. More importantly, LCP were able to stimulate the development of a protective antitumour immune response.

Lipidation and glycosylation of a T cell antigen receptor (TCR) transmembrane hvdrophobic peptide dramatically enhances in vitro and in vivo function

A T cell antigen receptor (TCR) transmembrane sequence derived peptide (CP) has been shown to inhibit T cell activation both in vitro and in vivo at the membrane level of the receptor signal transduction. To examine the effect of sugar or lipid conjugations on CP function, we linked CP to 1-aminoglucosesuccinate (GS), N-myristate (MYR), mono-di-tripalmitate (LP1, LP2, or LP3), and a lipoamino acid (LA) and examined the effects of these compounds on T cell activation in vitro and by using a rat model of adjuvant-induced arthritis, in vivo. In vitro, antigen presentation results demonstrated that lipid conjugation enhanced CP's ability to lower IL-2 production from 56.99% +/- 15.69 S.D. observed with CP, to 12.08% +/- 3.34 S.D. observed with LA. The sugar conjugate GS resulted in only a mild loss of in vitro activity compared to CP (82.95% +/- 14.96 S.D.). In vivo, lipid conjugation retarded the progression of adjuvant-induced arthritis by approximately 50%, whereas the sugar. conjugated CP, GS, almost completely inhibited the progression of arthritis. This study demonstrates that hydrophobic peptide activity is markedly enhanced in vitro and in vivo by conjugation to lipids or sugars. This may have practical applications in drug delivery and bioavailability of hydrophobic peptides. (c) 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.

Method for the synthesis of highly pure vaccines using the lipid core peptide system

Traditional vaccines consisting of whole attenuated microorganisms, killed microorganisms, or microbial components, administered with an adjuvant (e.g. alum), have been proved to be extremely successful. However, to develop new vaccines, or to improve upon current vaccines, new vaccine development techniques are required. Peptide vaccines offer the capacity to administer only the minimal microbial components necessary to elicit appropriate immune responses, minimizing the risk of vaccination associated adverse effects, and focusing the immune response toward important antigens. Peptide vaccines, however, are generally poorly immunogenic, necessitating administration with powerful, and potentially toxic adjuvants. The attachment of lipids to peptide antigens has been demonstrated as a potentially safe method for adjuvanting peptide epitopes. The lipid core peptide (LCP) system, which incorporates a lipidic adjuvant, carrier, and peptide epitopes into a single molecular entity, has been demonstrated to boost immunogenicity of attached peptide epitopes without the need for additional adjuvants. The synthesis of LCP systems normally yields a product that cannot be purified to homogeneity. The current study describes the development of methods for the synthesis of highly pure LCP analogs using native chemical ligation. Because of the highly lipophilic nature of the LCP lipid adjuvant, difficulties (e.g. poor solubility) were experienced with the ligation reactions. The addition of organic solvents to the ligation buffer solubilized lipidic species, but did not result in successful ligation reactions. In comparison, the addition of approximately 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) proved successful, enabling the synthesis of two highly pure, tri-epitopic Streptococcus pyogenes LCP analogs. Subcutaneous immunization of B10.BR (H-2(k)) mice with one of these vaccines, without the addition of any adjuvant, elicited high levels of systemic IgG antibodies against each of the incorporated peptides. Copyright (c) 2006 European Peptide Society and John Wiley & Sons, Ltd.