Thylakoid Protein Phosphorylation in Regulation of Photosynthesis

Once the seed has germinated, the plant is forced to face all the environmental changes in its habitat. In order to survive, plants have evolved a number of different acclimation systems. The primary reaction behind plant growth and development is photosynthesis. Photosynthesis captures solar energy and converts it into chemical form. Photosynthesis in turn functions under the control of environmental cues, but is also affected by the growth, development, and metabolic state of a plant. The availability of solar energy fluctuates continuously, requiring non-stop adjustment of photosynthetic efficiency in order to maintain the balance between photosynthesis and the requirements and restrictions of plant metabolism. Tight regulation is required, not only to provide sufficient energy supply but also to prevent the damage caused by excess energy. The very first reaction of photosynthesis is splitting of water into the form of oxygen, hydrogen, and electrons. This most fundamental reaction of life is run by photosystem II (PSII), and the energy required for the reaction is collected by the light harvesting complex II (LHCII). Several proteins of the PSII-LHCII complex are reversibly phosphorylated according to the energy balance between photosynthesis and metabolism. Thylakoid protein phosphorylation has been under extensive investigation for over 30 years, yet the physiological role of phosphorylation remains elusive. Recently, the kinases behind the phosphorylation of PSII-LHCII proteins (STN7 and STN8) were identified and the knockout mutants of these kinases became available, providing powerful tools to elucidate the physiological role of PSII-LHCII phosphorylation. In my work I have used the stn7 and stn8 mutants in order to clarify the role of PSII-LHCII phosphorylation in regulation and protection of the photosynthetic machinery according to environmental cues. I show that STN7- dependent PSII-LHCII protein phosphorylation is required to balance the excitation energy distribution between PSII and PSI especially under low light intensities when the excitation energy transfer from LHC to PSII and PSI is efficient. This mechanism differs from traditional light quality-induced “state 1” – “state 2” transition and ensures fluent electron transfer from PSII to PSI under low light, yet having highest physiological relevance under fluctuating light intensity. STN8-dependent phosphorylation of PSII proteins, in turn, is required for fluent turn-over of photodamaged PSII complexes and has the highest importance upon prolonged exposure of the photosynthetic apparatus to excess light.

Regulation of photosynthetic electron transfer in plant chloroplasts

This thesis focuses on the molecular mechanisms regulating the photosynthetic electron transfer reactions upon changes in light intensity. To investigate these mechanisms, I used mutants of the model plant Arabidopsis thaliana impaired in various aspects of regulation of the photosynthetic light reactions. These included mutants of photosystem II (PSII) and light harvesting complex II (LHCII) phosphorylation (stn7 and stn8), mutants of energy-dependent non-photochemical quenching (NPQ) (npq1 and npq4) and of regulation of photosynthetic electron transfer (pgr5). All of these processes have been extensively investigated during the past decades, mainly on plants growing under steady-state conditions, and therefore many aspects of acclimation processes may have been neglected. In this study, plants were grown under fluctuating light, i.e. the alternation of low and high intensities of light, in order to maximally challenge the photosynthetic regulatory mechanisms. In pgr5 and stn7 mutants, the growth in fluctuating light condition mainly damaged PSI while PSII was rather unaffected. It is shown that the PGR5 protein regulates the linear electron transfer: it is essential for the induction of transthylakoid ΔpH that, in turn, activates energy-dependent NPQ and downregulates the activity of cytochrome b6f. This regulation was shown to be essential for the photoprotection of PSI under fluctuations in light intensity. The stn7 mutants were able to acclimate under constant growth light conditions by modulating the PSII/PSI ratio, while under fluctuating growth light they failed in implementing this acclimation strategy. LHCII phosphorylation ensures the balance of the excitation energy distribution between PSII and PSI by increasing the probability for excitons to be trapped by PSI. LHCII can be phosphorylated over all of the thylakoid membrane (grana cores as well as stroma lamellae) and when phosphorylated it constitutes a common antenna for PSII and PSI. Moreover, LHCII was shown to work as a functional bridge that allows the energy transfer between PSII units in grana cores and between PSII and PSI centers in grana margins. Consequently, PSI can function as a quencher of excitation energy. Eventually, the LHCII phosphorylation, NPQ and the photosynthetic control of linear electron transfer via cytochrome b6f work in concert to maintain the redox poise of the electron transfer chain. This is a prerequisite for successful plant growth upon changing natural light conditions, both in short- and long-term.

Pigment orientation changes detected by low temperature linear dichroism spectroscopy: cold-hardening transition in phycobilisome-containing organisms

Low temperature (77K) linear dichroism spectroscopy was used to characterize pigment orientation changes accompanying the light state transition in the cyanobacterium, Synechococcus sp. pee 6301, and cold-hardening in winter rye (Secale cereale L. cv. Puma). Samples were oriented for spectroscopy using the gel squeezing method (Abdourakhmanov et aI., 1979) and brought to 77K in liquid nitrogen. The linear dichroism (LD) spectra of Synechococcus 6301 phycobilisome/thylakoid membrane fragments cross-linked in light state 1 and light state 2 with glutaraldehyde showed differences in both chlorophyll a and phycobilin orientation. A decrease in the relative amplitude of the 681nm chlorophyll a positive LD peak was observed in membrane fragments in state 2. Reorientation of the phycobilisome (PBS) during the transition to state 2 resulted in an increase in core allophycocyanin absorption parallel to the membrane, and a decrease in rod phycocyanin parallel absorption. This result supports the "spillover" and "PBS detachment" models of the light state transition in PBS-containing organisms, but not the "mobile PBS" model. A model was proposed for PBS reorientation upon transition to state 2, consisting of a tilt in the antenna complex with respect to the membrane plane. Linear dichroism spectra of PBS/thylakoid fragments from the red alga, Porphyridium cruentum, grown in green light (containing relatively more PSI) and red light (containing relatively more PSll) were compared to identify chlorophyll a absorption bands associated with each photosystem. Spectra from red light - grown samples had a larger positive LD signal on the short wavelength side of the 686nm chlorophyll a peak than those from green light - grown fragments. These results support the identification of the difference in linear dichroism seen at 681nm in Synechococcus spectra as a reorientation of PSll chromophores. Linear dichroism spectra were taken of thylakoid membranes isolated from winter rye grown at 20°C (non-hardened) and 5°C (cold-hardened). Differences were seen in the orientation of chlorophyll b relative to chlorophyll a. An increase in parallel absorption was identified at the long-wavelength chlorophyll a absorption peak, along with a decrease in parallel absorption from chlorophyll b chromophores. The same changes in relative pigment orientation were seen in the LD of isolated hardened and non-hardened light-harvesting antenna complexes (LHCII). It was concluded that orientational differences in LHCII pigments were responsible for thylakoid LD differences. Changes in pigment orientation, along with differences observed in long-wavelength absorption and in the overall magnitude of LD in hardened and non-hardened complexes, could be explained by the higher LHCII monomer:oligomer ratio in hardened rye (Huner et ai., 1987) if differences in this ratio affect differential light scattering properties, or fluctuation of chromophore orientation in the isolated LHCII sample.

Funktionsanalysen der Domänen des Vacuolin B und die Rolle des filamentösen Actins am Vacuolin B-positiven Kompartiment im endocytotischen Transit in Dictyostelium discoideum

Ähnlich wie in Säugerzellen ist das neutrale Postlysosom in Dictyostelium discoideum von einem Coat aus filamentösem Actin umgeben. In dieser Arbeit wurde der Frage nach der Funktion dieses Actin-Cytoskeletts am späten Endosom nachgegangen. Hierzu wurde zunächst eine Analyse der Domänen des Vacuolin B durchgeführt, das als bisher spätester bekannter Marker im Endocytoseweg in Dictyostelium discoideum das neutrale, postlysosomale Kompartiment dekoriert. In einer Yeast Two Hybrid-Analyse wurden die Bereiche des Vacuolin B identifiziert, die für eine Selbst-Interaktion des Proteins notwendig und ausreichend sind. Es handelt sich dabei um die coiled-coil-Domäne und einen daran anschließenden, 18 Aminosäuren langen, alpha-helicalen Abschnitt. Diesem helicalen Bereich scheint die Funktion einer modifizierenden, die coiled-coil-Ausbildung vermittelnden oder initiierenden Faltungseinheit zuzukommen. Sie weist jedoch nicht die typischen Merkmale einer trigger-Helix auf. Lokalisationsuntersuchungen mit GFP-Deletionskonstrukten zeigten, dass es einen Zusammenhang zwischen Interaktionsfähigkeit und Bindung des Vacuolin an die Oberfläche später Endosomen gibt: Eine korrekte Lokalisation und Membranassoziation waren nur dann zu beobachten, wenn in der Yeast Two Hybrid-Analyse eine Interaktion nachgewiesen werden konnte. Es wurden die für die Lokalisation und Assoziation mit der vacuolären Membran notwendigen Sequenzbereiche identifiziert; diese waren jedoch nicht hinreichend. Vermutlich sind hierfür auch Sequenzen des N-Terminus notwendig. Die erhobenen Daten legen weiterhin eine Bedeutung der hydrophoben Domäne des Vacuolin B für die korrekte Faltung des Proteins nahe. Im Anschluss an die Domänenanalyse wurde Vacuolin dazu benutzt, durch Herstellung von Hybridproteinen Actin-interagierende Proteine gezielt an das späte Endosom zu transportieren. Es wurde deren Einfluss auf den lokalen Actin Coat und den endocytotischen Transit untersucht. Zwei Actin-bindende Proteine mit depolymerisierender Wirkung konnten im Rahmen dieser Arbeit getestet werden, nämlich Severin und Cofilin. Die Schwächung des lokalen Actin Coats durch das Vorhandensein von Severin an der späten Vacuole war nicht eindeutig festzustellen. Severin am Postlysosom führte nicht zu einer Veränderung der Transitkinetik von Flüssigphasenmarker. Allerdings konnte ein Defekt in der Phagocytose festgestellt werden. Es könnte hierbei ein Zusammenhang zwischen der Mobilisierung von intrazellulärem Calcium während der Partikelaufnahme und der Calcium-abhängigen Regulation der Severin-Aktivität bestehen. Das Hybridprotein aus Vacuolin und Cofilin zeigte neben einer Assoziation mit der vacuolären Membran auch eine Lokalisation im Cytoplasma und Cortex der Zellen. Mit der Lokalisation im Cytoplasma und Cortex korrelierte eine Veränderung der endocytotischen Aktivität. Das Vacuolin-Cofilin-Fusionsprotein am Postlysosom rief einen Verlust des lokalen Actin Coats hervor. Dies führte zu einer traubenförmigen Assoziation der späten Endosomen; exocytotische Parameter blieben jedoch unbeeinflusst. Aufgrund der hier erhobenen Daten kann vermutet werden, dass der Actin Coat am Postlysosom dazu dient, eine Agglutination dieser Endosomen zu inhibieren. Dies könnte ein Schutzmechanismus zum Ausschluss von Docking- und Fusionsereignissen sein.

Effect of market-driven minigrids on the frequency stabilization process of isolated middle-sized power grids

Neueste Entwicklungen in Technologien für dezentrale Energieversorgungsstrukturen, erneuerbare Energien, Großhandelsenergiemarkt, Mini- und Mikronetze, verteilte Intelligenz, sowie Informations- und Datenübertragungstechnologien werden die zukünftige Energiewelt maßgeblich bestimmen. Die derzeitigen Forschungsbemühungen zur Vernutzung aller dieser Technologien bilden die Voraussetzungen für ein zukünftiges, intelligentes Stromnetz. Dieses neue Konzept gründet sich auf die folgenden Säulen: Die Versorgung erfolgt durch dezentrale Erzeugungsanlagen und nicht mehr durch große zentrale Erzeuger; die Steuerung beeinflusst nicht mehr allein die Versorgung sondern ermöglich eine auch aktive Führung des Bedarf; die Eingabeparameter des Systems sind nicht mehr nur mechanische oder elektrische Kenngrößen sondern auch Preissignale; die erneuerbaren Energieträger sind nicht mehr nur angeschlossen, sondern voll ins Energienetz integriert. Die vorgelegte Arbeit fügt sich in dieses neue Konzept des intelligenten Stromnetz ein. Da das zukünftige Stromnetz dezentral konfiguriert sein wird, ist eine Übergangsphase notwendig. Dieser Übergang benötigt Technologien, die alle diese neue Konzepte in die derzeitigen Stromnetze integrieren können. Diese Arbeit beweist, dass ein Mininetz in einem Netzabschnitt mittlerer Größe als netzschützende Element wirken kann. Hierfür wurde ein neues Energiemanagementsystem für Mininetze – das CMS (englisch: Cluster Management System) – entwickelt. Diese CMS funktioniert als eine von ökonomischorientierte Betriebsoptimierung und wirkt wie eine intelligente Last auf das System ein, reagierend auf Preissignale. Sobald wird durch eine Frequenzsenkung eine Überlastung des Systems bemerkt, ändert das Mininetz sein Verhalten und regelt seine Belastung, um die Stabilisierung des Hauptnetzes zu unterstützen. Die Wirksamkeit und die Realisierbarkeit des einwickelten Konzept wurde mit Hilfe von Simulationen und erfolgreichen Laborversuchen bewiesen.

Bodengewölbe unter ruhender und nichtruhender Belastung bei Berücksichtigung von Bewehrungseinlagen aus Geogittern

Die Forschungsarbeit beschäftigt sich schwerpunktmäßig mit der Ausbildung von Bodengewölben über punkt- und linienförmigen Auflagerungen und der Stabilisierung des Gewölbebereiches durch horizontale Bewehrungseinlagen aus Geokunststoffen. Während das Tragverhalten entsprechender Bodengewölbe unter ruhenden Belastungen bereits wissenschaftlich erforscht ist untersucht die Dissertation vornehmlich das Gewölbeverhalten unter nichtruhenden Belastungen. Da die Gewölbemodelle primär im Verkehrswegebau als geokunststoffbewehrte Erdschichten über Pfahlelementen (GEP) ausgeführt werden, ist für die Praxis die Untersuchung der Auswirkung einer nichtruhenden Belastung (Verkehrslast) von besonderer Bedeutung. Methodisch wurden umfangreiche großmaßstäbliche Modellversuche (Maßstab 1:3) zur Gewölbeausbildungen am Pfahlrasterausschnitt sowie am Dammquerschnitt mit Berücksichtigung der Böschungssituation vorgenommen. Die Modellversuche wurden in einer differenzierten numerischen Analyse mit der Methode der finiten Elemente (FEM) verifiziert. Die zyklischen FEM-Modelle basierten dabei auf einem zyklisch-viskoplastischen Stoffansatz. Aufbauend auf den Modellversuchsergebnissen wurden schließlich modifizierte analytische Berechnungsansätze entwickelt. Zusammenfassend kann es bei zyklischen Beanspruchungen im unbewehrten System zu einer Gewölberückbildung und zu erhöhten Systemverformungen kommen. Die Größe der Gewölberückbildung ist abhängig von der Überdeckungshöhe, der Belastungsfrequenz, der Lastzyklenzahl sowie der zyklischen Belastungsamplitude in Relation zur statischen Überlagerungsspannung. Mit abnehmender Höhe, zunehmender Frequenz, zunehmender Zyklenzahl und Belastungsamplitude tritt eine Gewölbereduktion verstärkt ein. Eine erhöhte Primärspannung kann dazu führen, dass die Bodengewölbe überdrückt werden und dadurch gegenüber zyklischer Beanspruchung stabiler sind. Auch bei Anordnung von Bewehrungslagen sind ähnliche Effekte zu beobachten wie im unbewehrten Fall. Mit zunehmender zyklischer Beanspruchung behindern die eingebauten Geokunststoffe allerdings die Ausbildung der Scherfugen, reduzieren dadurch die Setzungen, erhöhen die Lastumlagerung auf die Pfähle und stabilisieren dadurch das System. Aus den Modellversuchen wurde ein vereinfachter Ansatz für die vorhandenen analytischen Berechnungsverfahren in Form eines Gewölbereduktionsfaktors k abgeleitet, mit dem näherungsweise auch für praktische Fälle eine erste Abschätzung der Gewölbereduktion infolge nichtruhender Belastung möglich ist. Ergänzend zu dem Hauptthema der Gewölbeausbildung unter nichtruhenden Lasten unter-sucht die Forschungsarbeit die allgemeine Verwendbarkeit der FEM-Methode zur Berechnung eines GEP-Systems unter ruhender und nichtruhender Belastung, beurteilt die derzeit gültigen Spreizdruckansätze sowie den derzeitigen Verankerungsnachweis für eingelegte Geokunststofflagen und untersucht die Lastabtragung im Geogitter bei dreieckrasterförmiger Lagerung.

Composition and stability of organic matter fractions in soils under different land use regimes

Soil organic matter (SOM) vitally impacts all soil functions and plays a key role in the global carbon (C) cycle. More than 70% of the terrestric C stocks that participate in the active C cycle are stored in the soil. Therefore, quantitative knowledge of the rates of C incorporation into SOM fractions of different residence time is crucial to understand and predict the sequestration and stabilization of soil organic carbon (SOC). Consequently, there is a need of fractionation procedures that are capable of isolating functionally SOM fractions, i.e. fractions that are defined by their stability. The literature generally refers to three main mechanisms of SOM stabilization: protection of SOM from decomposition by (i) its structural composition, i.e. recalcitrance, (ii) spatial inaccessibility and/or (iii) interaction with soil minerals and metal ions. One of the difficulties in developing fractionation procedures for the isolation of functional SOM fractions is the marked heterogeneity of the soil environment with its various stabilization mechanisms – often several mechanisms operating simultaneously – in soils and soil horizons of different texture and mineralogy. The overall objective of the present thesis was to evaluate present fractionation techniques and to get a better understanding of the factors of SOM sequestration and stabilization. The first part of this study is attended to the structural composition of SOM. Using 13C cross-polarization magic-angle spinning (CPMAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, (i) the effect of land use on SOM composition was investigated and (ii) examined whether SOM composition contributes to the different stability of SOM in density and aggregate fractions. The second part of the present work deals with the mineral-associated SOM fraction. The aim was (iii) to evaluate the suitability of chemical fractionation procedures used in the literature for the isolation of stable SOM pools (stepwise hydrolysis, treatments using oxidizing agents like Na2S2O8, H2O2, and NaOCl as well as demineralization of the residue obtained by the NaOCl treatment using HF (NaOCl+HF)) by pool sizes, 13C and 14C data. Further, (iv) the isolated SOM fractions were compared to the inert organic matter (IOM) pool obtained for the investigated soils using the Rothamsted Carbon Model and isotope data in order to see whether the tested chemical fractionation methods produce SOM fractions capable to represent this pool. Besides chemical fractionation, (v) the suitability of thermal oxidation at different temperatures for obtaining stable SOC pools was evaluated. Finally, (vi) the short-term aggregate dynamics and the factors that impact macroaggregate formation and C stabilization were investigated by means of an incubation study using treatments with and without application of 15N labeled maize straw of different degradability (leaves and coarse roots). All treatments were conducted with and without the addition of fungicide. Two study sites with different soil properties and land managements were chosen for these investigations. The first one, located at Rotthalmünster, is a Stagnic Luvisol (silty loam) under different land use regimes. The Ah horizons of a spruce forest and continuous grassland and the Ap and E horizons of two plots with arable crops (continuous maize and wheat cropping) were examined. The soil of the second study site, located at Halle, is a Haplic Phaeozem (loamy sand) where the Ap horizons of two plots with arable crops (continuous maize and rye cropping) were investigated. Both study sites had a C3-/C4-vegetational change on the maize plot for the purpose of tracing the incorporation of the younger, maize-derived C into different SOM fractions and the calculation of apparent C turnover times of these. The Halle site is located near a train station and industrial areas, which caused a contamination with high amounts of fossil C. The investigation of aggregate and density fractions by 13C CPMAS NMR spectroscopy revealed that density fractionation isolated SOM fractions of different composition. The consumption of a considerable part (10–20%) of the easily available O-alkyl-C and the selective preservation of the more recalcitrant alkyl-C when passing from litter to the different particulate organic matter (POM) fractions suggest that density fractionation was able to isolate SOM fractions with different degrees of decomposition. The spectra of the aggregate fractions resembled those of the mineral-associated SOM fraction obtained by density fractionation and no considerable differences were observed between aggregate size classes. Comparison of plant litter, density and aggregate size fractions from soil under different land use showed that the type of land use markedly influenced the composition of SOM. While SOM of the acid forest soil was characterized by a large content (> 50%) of POM, which contained high amounts of spruce-litter derived alkyl-C, the organic matter in the biologically more active grassland and arable soils was dominated by mineral-associated SOM (> 95%). This SOM fraction comprised greater proportions of aryl- and carbonyl-C and is considered to contain a higher amount of microbially-derived organic substances. Land use can alter both, structure and stability of SOM fractions. All applied chemical treatments induced considerable SOC losses (> 70–95% of mineral-associated SOM) in the investigated soils. The proportion of residual C after chemical fractionation was largest in the arable Ap and E horizons and increased with decreasing C content in the initial SOC after stepwise hydrolysis as well as after the oxidative treatments with H2O2 and Na2S2O8. This can be expected for a functional stable pool of SOM, because it is assumed that the more easily available part of SOC is consumed first if C inputs decrease. All chemical treatments led to a preferential loss of the younger, maize-derived SOC, but this was most pronounced after the treatments with Na2S2O8 and H2O2. After all chemical fractionations, the mean 14C ages of SOC were higher than in the mineral-associated SOM fraction for both study sites and increased in the order: NaOCl < NaOCl+HF ≤ stepwise hydrolysis << H2O2 ≈ Na2S2O8. The results suggest that all treatments were capable of isolating a more stable SOM fraction, but the treatments with H2O2 and Na2S2O8 were the most efficient ones. However, none of the chemical fractionation methods was able to fit the IOM pool calculated using the Rothamsted Carbon Model and isotope data. In the evaluation of thermal oxidation for obtaining stable C fractions, SOC losses increased with temperature from 24–48% (200°C) to 100% (500°C). In the Halle maize Ap horizon, losses of the young, maize-derived C were considerably higher than losses of the older C3-derived C, leading to an increase in the apparent C turnover time from 220 years in mineral-associated SOC to 1158 years after thermal oxidation at 300°C. Most likely, the preferential loss of maize-derived C in the Halle soil was caused by the presence of the high amounts of fossil C mentioned above, which make up a relatively large thermally stable C3-C pool in this soil. This agrees with lower overall SOC losses for the Halle Ap horizon compared to the Rotthalmünster Ap horizon. In the Rotthalmünster soil only slightly more maize-derived than C3-derived SOC was removed by thermal oxidation. Apparent C turnover times increased slightly from 58 years in mineral-associated SOC to 77 years after thermal oxidation at 300°C in the Rotthalmünster Ap and from 151 to 247 years in the Rotthalmünster E horizon. This led to the conclusion that thermal oxidation of SOM was not capable of isolating SOM fractions of considerably higher stability. The incubation experiment showed that macroaggregates develop rapidly after the addition of easily available plant residues. Within the first four weeks of incubation, the maximum aggregation was reached in all treatments without addition of fungicide. The formation of water-stable macroaggregates was related to the size of the microbial biomass pool and its activity. Furthermore, fungi were found to be crucial for the development of soil macroaggregates as the formation of water-stable macroaggregates was significantly delayed in the fungicide treated soils. The C concentration in the obtained aggregate fractions decreased with decreasing aggregate size class, which is in line with the aggregate hierarchy postulated by several authors for soils with SOM as the major binding agent. Macroaggregation involved incorporation of large amounts maize-derived organic matter, but macroaggregates did not play the most important role in the stabilization of maize-derived SOM, because of their relatively low amount (less than 10% of the soil mass). Furthermore, the maize-derived organic matter was quickly incorporated into all aggregate size classes. The microaggregate fraction stored the largest quantities of maize-derived C and N – up to 70% of the residual maize-C and -N were stored in this fraction.

Das ER-lokalisierte Protein Farinelli und seine möglichen Interaktionspartner in der Spermatogenese von Drosophila melanogaster

Dem Farinelli-Protein wird eine Funktion als hodenspezifisches VAP-Protein zugesprochen (Renner, 2001). Mit Hilfe des ER-Markers PDI konnte Fan eindeutig dem ER zugeordnet werden. Fan stellt dabei ein integrales Membranprotein dar, welches nur durch Detergenz- Behandlung in Lösung zu bringen war. Durch den Einsatz zweier Fragment-Konstrukte (fan∆MSP-GFP und fanMSP-GFP) von Fan wurde die Relevanz der MSP-Domäne für die männliche Fertilität dokumentiert. Das Fusionsprotein Fan∆MSP-GFP lag aufgrund der verbliebenen Transmembrandomäne weiterhin im ER vor. Dennoch konnte der sterile Phänotyp der fanJo-Männchen, die keinerlei Fan-Protein enthalten, durch das Einbringen des Fusionskonstrukts nicht gerettet werden. MSP-GFP für sich allein konnte keine Verbindung mit dem ER eingehen und zeigte eine diffuse Fluoreszenz. Im Rahmen der Dissertation wurden mehrere, durch das yeast two hybrid-System ermittelte, mögliche Interaktionspartner von Fan analysiert. Das Protein CG5194 konnte als einziges wie Fan dem ER zugeordnet werden. Seine Expression beschränkte sich aber auf die Spermatocytenphase und ist somit kürzer als die von Farinelli. Nach Einkreuzen der GFP-Fusionskonstrukte in die fan-Nullmutante konnte CG5194 nicht mehr am ER der Spermatocyten beobachtet werden, sondern lag innerhalb des Cytoplasmas diffus verteilt vor. Auch bei der Western Blot-Analyse konnte das Protein von CG5194 nur noch in der Überstand-Fraktion mit den ungebundenen Proteinen nachgewiesen werden. Lag in der fan-Nullmutante ausschließlich das Fan∆MSP-GFP-Fusionsprotein vor, konnte die ER-Lokalisation von CG5194 ebenfalls nicht beibehalten werden. Mit Hilfe einer Fragment-Analyse konnte gezeigt werden, dass in den männlichen Gonaden das erste Exon von CG5194 für die Interaktion mit Fan entscheidend ist. Innerhalb der Ovarien dagegen ist das zweite Exon für die Lokalisation im ER notwendig. Demzufolge ist neben einem anderen Interaktionspartner als Fan auch eine andere Domäne im Protein für die ER-Lokalisation in der weiblichen Keimbahn entscheidend. Durch den Einsatz von antisense- und RNAi-Konstrukten konnte ein steriler Phänotyp bei den Männchen erzeugt werden. Überraschenderweise zeigten die Tiere erst einen Defekt während der Spermatiden-Differenzierung. Bereits während der Diplomarbeit wurde 98A im Kopfbereich der elongierten Spermatiden nachgewiesen. Mittels einer DNA-Färbung sowie durch die Colokalisation mit dem Akrosom-Protein Sneaky wurde 98A dem Bereich des Akrosoms zugeordnet. Sneaky taucht jedoch bereits früher als 98A in den Keimzellen auf. Die Erzeugung eines sterilen Phänotyps durch den Einfluss eines RNAi-Konstrukts gelang nicht. Entweder ist 98A für die Fertilität von Drosophila nicht relevant oder aber seine Funktion kann von anderen Proteinen übernommen werden.

Translationskontrolle in der Spermatogenese von Drosophila: Charakterisierung eines regulatorischen mRNP-Komplexes

Während der Spermatogenese von Drosophila werden viele mRNAs zwar vor der Meiose transkribiert, dann aber durch Komplexbildung mit Proteinen stillgelegt und erst am Ende der Spermienentwicklung durch Veränderung desselben für die Translation freigegeben. Ein Beispiel hierfür ist die Mst87F mRNA. Während das cis-agierende Sequenzelement in der RNA seit langem bekannt ist, gestaltete sich die Suche nach den trans-agierenden RNA-bindenden Proteinen schwierig. In meiner Diplomarbeit (Stinski, 2007) waren mithilfe von präparativen Shift-Experimenten (Auftrennung von RNP-Komplexen im elektrischen Feld) zwei vielversprechende Kandidaten identifiziert worden, die Proteine Exuperantia (Exu) und Purity of Essence (Poe). Ziel der vorliegenden Dissertation war zum einen die Aufklärung der Funktion dieser Kandidatenproteine und zum anderen die Identifizierung weiterer Kandidaten, die an der Komplexbildung und damit an der Regulation beteiligt sind. Dabei war die Hoffnung, sowohl Proteine zu finden, die die Repression vermitteln, als auch solche, die am Ende die Aktivierung ermöglichen. Durch eine Affinitätsreinigung, in der Mst87F-RNA mit einem ms2-Tag versehen über das MS2-Maltose binding protein an eine Amylose-Matrix gebunden und schließlich die Komplexe mit Maltose wieder eluiert wurden, ließen sich erneut das Exu-Protein und drei neue Kandidaten identifizieren: CG3213, CG12470 und CG1898. Das Protein Exu hat eindeutig eine Funktion bei der Translationskontrolle: seine Abwesenheit führt zum Abbau der kontrollierten mRNAs. Die Inkubation mit exu-defizientem Protein-Extrakt (aus Hoden) unterstützt keine RNP-Komplexbildung und aufgereinigtes Exu-His Fusionsprotein kann auch nicht direkt an die Mst87F mRNA binden. Ein exu-defizienter Proteinextrakt lässt sich aber durch die Zugabe von rekombinantem Exu-His komplettieren und es entsteht wieder ein starker mRNP-Komplex. Dies beweist, dass das Experiment im Prinzip korrekt verläuft und dass Exu für die Komplexbildung entscheidend ist. Darüber hinaus konnten durch eine Co-Immunpräzipitation mit dem Exu-GFP Fusionsprotein sowohl interagierende Proteine als auch in die RNP-Komplexe einbezogene mRNAs nachgewiesen werden. Vielversprechende Kandidatenproteine stammen von den Genen CG3213, dfmr1 und CG12470. Die durch cDNA-Synthese in den Komplexen nachgewiesenen mRNAs sind in aller Regel solche, die der Translationskontrolle unterworfen sind. Damit ist gezeigt, dass Exu Teil eines großen Proteinkomplexes ist oder zumindest mit ihm assoziiert ist, der auf viele translationskontrollierte Transkripte Einfluss nimmt. Die Mst87F mRNA wird zum Zeitpunkt der Translationsaktivierung sekundär polyadenyliert, das heißt ihre Länge wird größer und heterogen. In einer Mutante für das Kandidatengen poe wurde diese sekundäre Polyadenylierung plötzlich nicht mehr beobachtet und die RNA blieb auch bei Translationsaktivierung so groß wie in den frühen Stadien. So ergab sich die Möglichkeit, endlich zu prüfen, ob die sekundäre Polyadenylierung für die Translationsaktivierung von essentieller Bedeutung ist. Eine Serie von Fusionskonstrukten mit funktionstüchtigem TCE verhielten sich alle gleich. Die sekundäre Polyadenylierung fand nicht statt, aber das Transkript des Fusionsgens wurde zum richtigen Zeitpunkt translatiert. Somit ist dieser Prozess zumindest nicht generell für eine Translation zu diesem späten Zeitpunkt in der Spermiogenese notwendig. Ein quantitativer Effekt kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren konnten mit antisense Konstrukten mutante Phänotypen erzeugt werden. Solche Männchen waren ausnahmslos steril, was die Wichtigkeit des Proteins Poe für den Prozess der Spermienreifung belegt. Die Defekte zeigen sich spät während der Individualisierung, was mit der vermuteten Funktion übereinstimmen würde. Das Kandidatenprotein dFMR1 bindet allein an die Mst87F RNA und trägt zur Stärke des beobachtbaren Komplexes bei. Die Komplexbildung zeigt Salzabhängigkeit, wie sie für dFMR1 in anderen Zusammenhängen dokumentiert wurde. Dies unterstützt die obige Aussage und suggeriert, dass dFMR1 die Basis für den Komplexaufbau bildet. Das CPEB-homologe Kandidatenprotein Orb2 bindet ebenfalls allein an die Mst87F mRNA, hat aber keinen Einfluss auf die Repression oder die sekundäre Polyadenylierung. Eine Beteiligung an der Regulation wäre demnach eindeutig unterschiedlich zu der in anderen Fällen dokumentierten Rolle. Die Expression der Kandidatengene CG1898, CG3213 und CG12470 ist konform mit einer unterschiedlichen Beteiligung an der Translationskontrolle. Das erste Protein ist nur in prämeiotischen Stadien, das zweite durchgängig und das dritte nur in postmeiotischen Stadien nachzuweisen, was einer Funktion bei der Stillegung, während der gesamten inaktiven Phase bzw. bei der Aktivierung entsprechen könnte. Die verschiedenen Experimente identifizieren in mehreren Fällen die gleichen Kandidatenproteine und untermauern damit deren Bedeutung. Sie lassen vielfach konkrete Schlüsse auf die Art der Interaktionen zu, welche in einem Schema zusammengefasst werden.

Untersuchung der Eignung von Kräutern zur Sodenproduktion

Als Kräuter werden alle krautigen Pflanzen, die nicht zu den Gehölzen und zu den Gräsern zählen, bezeichnet. Sie erfüllen wichtige Funktionen bei der Förderung von Insekten und der Ästhetik von Landschaften und tragen zur Verbesserung des Grundfutters landwirtschaftlicher Nutztiere bei. Ansaaten von Kräutern in geschlossene Vegetationsdecken und bei Neuanlagen sind durch deren langandauernde Entwicklungsphasen sehr schwierig zu realisieren. Eine innovative Option zur Etablierung in Grünlandbeständen kann die Herstellung von Kräutersoden sein. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Eignung von Kräutern zur Sodenproduktion. Durch unterschiedliche Merkmale von Kräutern und Gräsern können Probleme bei der Entwicklung von Kräutersoden auftreten. In dieser Arbeit sind verschiedene Anbauversuche mit Wurzelkürzungen und Ertragsbestimmungen sowie Sodenverpflanzungen, die Ermittlung eines optimalen Trägermaterials und Untersuchungen zur Entwicklung eines Sodenschneidersystems durchgeführt worden. Wurzelkürzungen an Kräutern ergaben, dass die Bildung der Gesamtwurzelmasse, der Wurzelneubildung und der Masse des Oberbewuchses bei einzelnen Kräutern nur z.T. im Zusammenhang mit der Schnitttiefe stehen und die Entwicklungsstadien der Kräuter keine signifikanten Unterschiede aufzeigen. Hieraus ergibt sich, dass ein Wurzelschnitt generell möglich ist, jedoch verschiedenen Arte von Kräutern unterschiedlich stark auf diesen reagieren. Zu den Entwicklungsstadien, zum Ertrag des Bewuchses und zum Anwurzelungsverhalten von Kräutersoden können in Abhängigkeit vom Vorzuchtsort und im Vergleich zu Fertigrasen keine abschließenden Aussagen getroffen werden. Es besteht daher weiterer Forschungsbedarf. Ein kombinierter Anbau mit Untergräsern eignet sich durch die wuchsverdrängende Wirkung nicht zur Stabilisierung von Kräutersoden. Es konnte aber gezeigt werden, dass Trägermaterial aus Kokosfaser durch die hohe Zugfestigkeit und der Langlebigkeit des Materials geeignet ist. Demzufolge könnte es bei der Produktion von Kräutersoden eine wichtige Rolle spielen. Das Design von Sodenschneidertechnik aus dem Fertigrasenanbau kann nicht auf die Erzeugung von Kräutersoden übertragen werden, da Kräuter andere Wurzelmerkmale als Gräser haben und sich daher spezielle Anforderungen ergeben. Für einen erfolgreichen Schälvorgang von Kräutersoden bedarf es der Entwicklung einer speziell angepassten Technik. Denkbar währe die Verwendung oszillierender Schneideorgane, welche den Schneidevorgang besser ermöglichen könnten. Dadurch, dass ein flacher Wurzelschnitt bei Kräutern erfolgen kann, ist eine Erzeugung von Kräutersoden möglich. Aufgrund von morphologischen Unterschieden zwischen Kräutern und Gräsern unterscheiden sich diese in ihren Anforderungsprofilen, die Techniken der Fertigrasenproduktion können somit nicht direkt auf eine Kräutersodenproduktion übertragen werden. Mit dieser Arbeit fand ein erster Ansatz zur technischen Entwicklung einer Kräutersodenproduktion statt. Die Versuche haben gezeigt, dass noch viele Fragen bei der Entwicklung von Kräutersoden offen sind.

Auswirkung der Rückführung von Kurzumtriebsplantagen in Acker- und Grünlandnutzung auf Boden C-Fraktionen

Bei der Rückführung von Kurzumtriebsplantagen (KUP) in konventionelle landwirtschaftliche Nutzung erfolgt zur Saatbettvorbereitung für die Folgekulturen eine intensive Bodenbearbeitung, um Wurzeln und Erntereste zu zerkleinern und in den Boden einzuarbeiten. Dies erhöht einerseits die Mineralisierung der unter KUP akkumulierten organischen Bodensubstanz (OBS), andererseits werden dem Boden hohe Mengen an Kohlenstoff (C) mit den Ernteresten zugeführt. In dieser Arbeit wurde an den Standorten Georgenhof Pappel, Georgenhof Weide und Wachtum Pappel in einem Feldversuch untersucht, wie sich unterschiedliche Bodenbearbeitungstiefen von 5, 15 und 30 cm während der Rückführung der langjährig bewirtschafteten KUPs in Acker- und Grünlandnutzung auf die C-Dynamik im Boden auswirken. Im Mittelpunkt stand dabei die Überprüfung der Annahme, ob durch eine reduzierte Bodenbearbeitung und eine nachfolgende Grünlandnutzung die Mineralisierung der OBS gemindert werden kann. Die nach der letzten Holzernte auf den Flächen verbliebenen und in den Boden eingearbeiteten oberirdischen Erntereste führten dem Boden, neben der in der zerkleinerten Wurzelbiomasse gespeicherten C-Menge von 1-9 t C ha-1, zusätzlich zwischen 12 und 17 t C ha-1 zu. Der Anstieg der freien, leichten organischen Fraktion des Bodens direkt nach dem Umbruch der Flächen sowie im Zuge der Bodenbearbeitung verfügbar gewordene leicht abbaubare organische Verbindungen, steigerten die mikrobielle Aktivität. Dies führte trotz der intensiven Bodenbearbeitung zu einer Erhöhung des mit Makroaggregaten assoziierten C nach dem Fräsen der Flächen. Die erneute Bodenbearbeitung der Ackerparzellen ein Jahr nach dem Umbruch führte an allen Standorten und in allen Bearbeitungstiefen durch die Zerstörung von Makroaggregaten jedoch zu einer Abnahme des C in dieser Fraktion. Demgegenüber zeigte sich durch die ausbleibende Bodenbearbeitung unter Grünlandnutzung auf beiden Flächen am Georgenhof eine bessere Stabilisierung des C in den Makroaggregaten. Am Standort Wachtum nahm der C in der Makroaggregatfraktion auch unter Grünland ab, da die Aggregierung und somit auch die physikalische Stabilisierung der organischen Substanz in diesem sandigeren Boden gering ist. Dies spiegelte sich in Verlusten von 10% in der leichten organischen Fraktion wider. Die mikrobielle Biomasse nahm innerhalb eines Jahres an allen Standorten ab, verursacht durch die abnehmende Verfügbarkeit der organischen Substanz, was sich in gesunkenen Cmik/Corg Verhältnisse niederschlug. Dennoch hat ein Jahr nach dem Umbruch der KUPs die in den Ernteresten gespeicherte C Menge auf allen Flächen im Zuge des fortschreitenden mikrobiellen Abbaus um bis zu 23 t C ha-1 abgenommen. Da sich keine Änderung in der Gesamtkohlenstoffmenge des Mineralbodens feststellen ließ, wurden mögliche Mineralisationsverluste der OBS durch Abbauprodukte der Erntereste ausgeglichen. Am Standort Georgenhof Weide zeigte sich dabei in den tiefen Fräsvarianten eine geringere Abnahme der in den Ernteresten gespeicherten C-Menge gegenüber den flachen Fräsvarianten. Ebenso deutete ein höheres C/N Verhältnis der Erntereste unter Grünland gegenüber Ackernutzung auf allen drei Flächen auf einen verlangsamten Abbau der Erntereste hin. In einem Inkubationsversuch im Labor wurde das hohe N-Immobilisierungspotential der eingearbeiteten Kronen- und Wurzelreste insbesondere zu Abbaubeginn der Erntereste nachgewiesen. Eine ansteigende N-Immobilisierung nach einer zusätzlichen N-Gabe deutete an, dass eine N-Düngung im Feld möglicherweise erst nach Abbau der leicht verfügbaren Verbindungen der Erntereste empfehlenswert ist. Höhere Ergosterol/Cmik Verhältnisse nach Einarbeitung der Erntereste zeigten den gestiegenen Anteil an saprotrophen Pilzen in der mikrobiellen Gemeinschaft an. Ein Jahr nach der Rückführung der KUPs in landwirtschaftliche Nutzung deuteten die C-Verluste aus den labilen Bodenfraktionen erste Verluste des organischen Kohlenstoffs des Mineralbodens an. Allerdings ließ sich noch kein eindeutiger Einfluss der unterschiedlichen Frästiefen oder Nachnutzungen auf die C-Fraktionen im Mineralboden feststellen, so dass sich im Hinblick auf die anfangs gestellte Annahme einer verringerten C-Mineralisierung durch eine reduzierte Bodenbearbeitung noch keine Aussage treffen lässt.

Die Biogenese von Chlorophyll-a/b-bindenden Lichtsammelkomplexen : Topographie des Apoproteins bei der Thylakoidinsertion

Die Biogenese von Chlorophyll-a/b-bindenden Lichtsammelkomplexen: Topographie des Apoproteins bei der Thylakoidinsertion Der wichtigste Chlorophyll a/b-bindende Lichtsammelkomplex höherer Pflanzen ist der an Photosystem II assoziierte LHCII. Die kerncodierten Apoproteine dieses Pigment-Protein Komplexes werden posttranslational in den Chloroplasten importiert und mit Hilfe des plastidären

Zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen zur Faltung und Pigmentbindung des Lichtsammlerproteins LHC II aus Photosystem II

Zusammenfassung Der Lichtsammlerkomplex (LHCII) aus PhotosystemII hoeherer Pflanzen kann in vitro rekonstituiert werden. Es werden drei Reaktionszeiten (<10 s; <1 min; <10 min) aufgeloest. Dabei werden bei allen Reaktionszeiten Pigmente durch das Apoprotein gebunden. Chlorophylle (Chl a und Chl b) und Xanthophylle wirken limitierend auf die Rekonstitution. Chl a beschleunigt die zweite Reaktionszeit, ein ausgeglichenes Chl a/b-Verhaeltnis verkürzt die dritte Reaktionszeit. Ein molekularer Mechanismus als Interpretation dieser Effekte wird vorgeschlagen. Native Lipide verlaengern nichtspezifisch die Rekonstitution. Abiotische Faktoren haben einen spezifischen Einfluss auf die Rekonstitution. Spezifische Einfluesse der o. a. Bedingungen auf die thermische Stabilitaet des rekonstituierten LHCII wurden bestimmt.

Identifikation und Charakterisierung molekularer Komponenten des Verbindungsciliums der Photorezeptoren von Vertebraten

Photorezeptorzellen sind aus funktionell und morphologisch unterschiedlichen Kompartimenten aufgebaut: Einem lichtsensitiven Außensegment, das über ein nichtmotiles modifiziertes Cilium mit dem metabolisch aktiven Innensegment verbunden ist. Die Membranen des Außensegments werden kontinuierlich erneuert. Diese Prozesse erfordern die Translokation von Proteinen der Signaltransduktionskaskade vom Syntheseort im Innensegment in das Außensegment. Der intrazelluläre Transport der Proteine erfolgt durch das Verbindungscilium als einzige direkte cytoplasmatische Brücke zwischen den beiden Kompartimenten. Die Cytoskelettproteine des Verbindungsciliums sind maßgeblich an diesen Transportprozessen, sowie an der Ausbildung der Disk-Membranen und Funktion des Ciliums als Diffusionsbarriere beteiligt. Trotz dieser, für die Aufrechterhaltung der Photorezeptorzelle wichtigen Funktionen, sind bislang nur wenige molekulare Strukturkomponenten des Verbindungsciliums bekannt und funktionell charakterisiert. Um weitere Proteinkomponenten des Ciliums zu identifizieren, wurde eine biochemisch-molekularbiologische Strategie angewandt. Detergenzextrahierte Cilienapparate von Rinderphotorezeptorzellen wurden zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt. Das affinitätsgereinigte Antiserum, mit Antikörpern gegen Epitope der unterschiedlichen Proteine des Verbindungsciliums, wurde anschließend zur Durchmusterung einer Rattenretina cDNA-Expressionsbank verwendet. Positive Klone wurden isoliert, sequenziert, und deren 3´- und 5´-terminale cDNA-Sequenzen in Datenbankrecherchen analysiert. Neben Klonen, die für Fragmente von bereits bekannten photorezeptorspezifischen Proteinen kodieren, Klonen mit Homologien zu EST´s, und Klonen ohne Homologien zu in Datenbanken enthaltenen Einträgen, wurden 8 cDNA-Klone isoliert, die für bisher unbekannte Cytoskelettproteine des Verbindungsciliums kodieren. Zwei dieser Proteine wurden näher charakterisiert: Das Mikrotubuli-Bindungsprotein EB2p und das Aktin-Bindungsprotein Flightless (Flip). Indirekte Immunofluoreszenzmarkierungen mit Antikörpern gegen EB1p, die mit EB2p kreuzreagieren, wurden EB-Proteine im Verbindungscilium und Basalkörper der Rezeptorzellen lokalisiert. Funktionell trägt Rn EB2p vermutlich zur Stabilisierung der axonemalen Mikrotubuli bei, und dürfte durch Interaktion mit cytoplasmatischem Dynein an retrograden Transportprozessen im Verbindungscilium beteiligt sein. Das Aktin-Bindungsprotein Flightless ist ein cytoplasmatisches Protein mit einer N-terminalen LRR-Domäne, die Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen vermittelt. C-terminal weist Flip zwei Segmente mit Homologien zu Gelsolin auf. Indirekte Immunofluoreszenzmarkierungen und immuno-elektronenmikroskopische Analysen zeigen, daß Flip im Verbindungscilium in der subzellulären Domäne zwischen den axonemalen Mikrotubulipaarringen und der Plasmamembran lokalisiert ist. Im Außensegment der Photorezeptorzellen liegt Flip an den Disk-Membranen assoziiert vor. Flip verfügt vermutlich über zwei Funktion: Membran-assoziiert dürfte es Aktinfilamente an den Membranen der Außensegmente verankern. Im Verbindungscilium hingegen könnte es die ciliären Aktinfilamente modifizieren, die Transportwege für aktin-assoziierte Motorproteine sind. Flip und EB2p sind möglicherweise an den intrazellulären Transportprozessen durch das Verbindungscilium beteiligt.Die in der vorliegenden Arbeit angewandte Methode konnte erfolgreich zur Isolierung bislang unbekannter Proteine des Verbindungsciliums eingesetzt werden. Darüberhinaus wurde Flip auch in den ciliären Sinneszellen des Riechepithels und den mechanorezeptiven Haarzellen des Innenohrs identifiziert. Erkenntnisse über die molekulare Zusammensetzung des ciliären Cytoskeletts von Photorezeptorzellen können daher auch auf andere ciliäre Sinneszellen angewandt werden. Dies ermöglicht einen besseren Einblick in die allgemeine Funktion cilärer Cytoskelettstrukturen sensorischer Zellen.

Untersuchungen über Wechselwirkungen zwischen Proteinen der Leber und dem großen Hüllprotein des Hepatitis-B-Virus

Zusammenfassung:Im Infektionszyklus des Hepatitis-B-Virus spielt das große L-Hüllprotein mit seiner einzigartigen PräS1-Domäne eine zentrale Rolle. Es vermittelt die Bindung und Aufnahme in die Leberzelle, die Verpackung der Nukleokapside in die Virushülle, die Regulation der cccDNA-Amplifikation und eine transkriptionelle Aktivierung in der Wirtszelle. Zur Erfüllung seiner vielfältigen Aufgaben benötigt das L-Protein Unterstützung durch Wirtzellfaktoren, von denen einige im Rahmen dieser Untersuchung durch Verwendung von PräS1-Konstrukten als Fängerproteine im Hefe-Zwei-Hybrid-System identifiziert wurden. Mehrere Klone, die im Hefe-Zwei-Hybrid-Test mit dem C-terminalen PräS1-Fängerprotein (Aminosäure 44-108) isoliert worden waren, enthielten Teile der cDNA von gamma2-Adaptin, einem mutmaßlichen Mitglied der Clathrin-Adaptor-Proteine. Diese sind für intrazelluläre Membrantransportprozesse mittels clathrinumhüllter Vesikel verantwortlich. Unter den interagierenden Klonen, die mit dem N-terminalen Konstrukt des L-Proteins (Aminosäure 1-70) isoliert worden waren, befand sich überproportional häufig eine cDNA, die der schweren Kette H4 der Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitor-Familie homolog war. H4 besitzt vermutlich bei der 'Akute-Phase-Reaktion', die Entzündungen folgt, und bei der Stabilisierung der extrazellulären Matrix physiologische Bedeutung. Weitere Klone kodierten für die Serinprotease C1r. Diese ist Bestandteil des C1-Komplex, der ersten Komponente des klassischen Komplementsystems. Die Spezifität der Bindung zwischen den positiven Klonen und der PräS1-Domäne wurde in weiteren biochemischen Interaktionstests bestätigt, sodaß H4, C1r und gamma2-Adaptin als Wirtszellfaktoren in der Physiologie des Hepatitis-B-Virus wahrscheinlich eine Rolle spielen.Abstract:Little is known about host cell factors necessary for hepatitis B virus assembly and infectivity. Central to virogenesis is the large L envelope protein that mediates hepatocyte receptor binding, envelopment of viral capsids, regulation of supercoiled DNA amplification and transcriptional transactivation. To assess its multiple functions and host-protein assistance involved, we here initiated a yeast two-hybrid screen using the L-specific preS1 domain as bait to screen a human liver cDNA library for L-interacting proteins. One of the most prominent cDNAs interacting with aminoacid sequence 44-108 of L-protein encodes for gamma2-adaptin, a novel clathrin adaptor-related protein responsible for protein sorting and trafficking. Among the clones interacting with the N-terminal construct of L-protein (aminoacid sequence 1-70), a frequently isolated cDNA corresponds to the gene for inter-alpha-trypsin family heavy chain H4, likely to be involved in acute inflammatory phase response and stabilization of extracellular matrices. Some other interacting clones were found to carry the cDNA for the serine protease C1r, a subunit of the C1 complex which initiates the classical complement cascade. The specificity of the interaction between the positive clones and the preS1 domain was further confirmed in independent biochemical experiments. Taken together, the results suggest a role for H4, C1r and gamma2-adaptin as host-cell factors in L-mediated process of viral biogenesis and/or pathogenesis.