Farmacogenomica della Clofarabina nel trattamento delle Leucemie Acute pediatriche: identificazione di nuovi bersagli molecolari e del profilo genomico associato all’efficacia terapeutica del farmaco antitumorale

In quest’ultimi decenni si è assistito ad un notevole miglioramento nella terapia delle Leucemie Acute (LA) pediatriche, nonostante tutto si assiste oggi ad una fase di plateau della curva di sopravvivenza e le leucemie continuano a costituire la principale causa di morte pediatrica per malattia. Ulteriori progressi nel trattamento delle LA potrebbero essere ottenuti mediante studi di farmacogenomica che, identificando le componenti genetiche associate alla risposta individuale ai trattamenti farmacologici, consentono il disegno di terapie personalizzate e tumore-specifiche, ad alta efficacia e bassa tossicità per ciascun paziente. Il lavoro svolto è stato, dunque, finalizzato allo studio della farmacogenomica del farmaco antitumorale Clofarabina (CLO) nel trattamento delle LA pediatriche al fine di identificare marcatori genetici predittivi di risposta delle cellule leucemiche al farmaco, delucidare i meccanismi di resistenza cellulare ed individuare nuovi bersagli verso cui indirizzare terapie più mirate ed efficaci. L’analisi in vitro della sensibilità alla CLO di blasti provenienti da pazienti pediatrici affetti da Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL) e Mieloide (LAM) ha consentito l’identificazione di due sottopopolazioni di cellule LAL ad immunofenotipo T a diversa sensibilità alla CLO. Mediante DNA-microarrays, si è identificata la “signature” genetica specificamente associata alla diversa risposta delle cellule LAL-T al farmaco. Successivamente, la caratterizzazione funzionale dei geni differenziali e l’analisi dei pathways hanno consentito l’identificazione specifica di potenziali biomarcatori di risposta terapeutica aprendo nuove prospettive per la comprensione dei meccanismi di resistenza cellulare alla CLO e suggerendo un nuovo bersaglio terapeutico per le forme LAL-T a bassa sensibilità al farmaco. In conclusione, nel lavoro svolto si sono identificati set di geni e pathways di rilievo biologico per la risposta delle cellule LAL-T alla CLO suggerendo marcatori genetici in grado di identificare i soggetti eleggibili per il trattamento o verso cui disegnare terapie innovative. Il lavoro è paradigma per l’applicazione della farmacogenomica in altre neoplasie.

Sulle tracce di Michel Leiris: possessione e medicina tradizionale nell’Etiopia settentrionale. Dimensione teatrale, religiosa, terapeutica, socio-politica.

La tesi si divide in due parti: nella prima si esamina l'esperienza etnografica condotta da M. Leiris durante la missione Dakar-Gibuti (1931-33) con riferimento alla studio della possessione a Gondar. Nella seconda parte si dà conto del lavoro sul terreno condotto dalla dottoranda nel Wollo a contatto con guaritori. Seguono appendici documentarie e iconografiche.

Studi preliminari per la realizzazione di una cella a biocombustibile alimentata a NADH e ossigeno

Scopo del presente lavoro di ricerca è lo sviluppo in vitro di un processo elettrochimico che mimi la fosforilazione ossidativa, interfacciato ad una cella a biocombustibile, nell’ottica di sostituire il procedimento artificiale a quello naturale. Ciò permetterebbe di veicolare gli elettroni generati dal metabolismo cellulare su un circuito esterno, sfruttandoli come fonte di energia elettrica. In particolare si è studiato ed ottimizzato il meccanismo di ossidazione del NADH, accoppiato alla reazione di riduzione dell’ossigeno. L’enzima utilizzato per la realizzazione di tale dispositivo è la Diaforasi; questo, ossidando il NADH nel comparto anodico, immette elettroni nel circuito esterno attraverso un mediatore redox, capace di veicolarli fino alla superficie dell’elettrodo. Da qui gli elettroni giungono al compartimento catodico dove riducono l’ossidante disciolto in soluzione.

Ottimizzazione di un appareto per il controllo delle condizioni climatiche nella cella per la misura della rigidità dinamica

Lo scopo di tale progetto è creare, dal sistema hardware fino alla programmazione software, un sistema che permetta da una parte il controllo autonomo delle condizioni climatiche di un ambiente, il monitoraggio e dall’altra di essere versatile, portatile e di facile utilizzo. Come esempio applicativo per il controllo delle condizioni climatiche in una teca per la misura della rigidità dinamica si andranno ad evidenziare inizialmente in cosa consistono le prove della rigidità dinamica e a cosa servono, per poi passare alla spiegazione dei fenomeni che regolano il comportamento delle miscele di aria e vapor d’acqua che permetteranno di capire le connessioni tra i fattori principali che regolano i cambiamenti climatici quali temperatura e umidità. Successivamente si andranno poi a descrivere con quali meccanismi si regola la climatizzazione degli ambienti, fino ad arrivare alla creazione di un sistema autonomo che gestisca autonomamente temperatura e umidità all’interno di una cella.

Applicazione di procedure sperimentali innovative per l'esecuzione della prova triassiale su sabbia

La tesi ha lo scopo di illustrare l’efficacia di nuove tecniche per l’esecuzione della prova triassiale su sabbia. Sono state analizzate le tecniche di preparazione dei provini moist-tamping e mini proctor e l’efficacia del flushing di anidride carbonica e acua per realizzare la saturazione di provini di sabbia. Si è messo in evidenza modalità di esecuzione delle nuove procedure, effetti che producono, pregi e difetti per mezzo di una sperimentazione condotta con la cella triassiale del laboratorio di geotecnica del DISTART.

Significato prognostico dell'ecografia cerebrale nei neonati con infezione congenita da citomegalovirus

Background: Congenital cytomegalovirus (CMV) infection may lead to cerebral injury and neurodevelopmental delay. Cranial computed tomography (CT) is currently the standard imaging technique for predicting the outcome of CMV infected patients. Ultrasound (US) is a safe means to assess the extent of cerebral injury due to CMV infection in neonates, and unlike CT, is readily available at the bedside. Aim: To report the accuracy of US in predicting neurodevelopmental and sensorineural outcome in patients with congenital CMV infection. Study design: 57 newborns with congenital CMV infection underwent brain US and were followed prospectively for motor skills, developmental quotient and hearing function. Results: An abnormal US was found in 12/57 newborns. At least one sequela (Developmental Quotient < 85, motor delay, sensorineural hearing loss) was present in 10/11 surviving children with abnormal US (1 patient died in the neonatal period) vs 3/45 newborns with normal US (OR for death or poor outcome: 154, CI 17.3-1219.6, p<0.001, positive predictive value 91.7%, negative predictive value 93.3%). Conclusion: A good correlation is shown between ultrasound abnormalities and the prediction of outcome, suggesting that US may be used to study and follow CMV infected neonates. Our findings await confirmation in a larger population.

Studio dell'effetto di promotori sulle caratteristiche del catalizzatore a base di V/P/O, per l'ossidazione selettiva di n-Butano.

Il pirofosfato di vanadile VPP è il catalizzatore utilizzato per l’ossidazione di n-butano ad anidride maleica AM. Durante reazione, il VPP subisce delle modifiche strutturali, soprattutto nella parte superficiale, cataliticamente attiva. Queste modifiche sono funzione della composizione della fase gas e delle caratteristiche del catalizzatore, in particolare del rapporto P/V. Mediante prove di reattività in condizioni stazionarie e non-stazionarie, condotte in cella ambientale accoppiata ad uno spettrofotometro Raman, si è arrivati a capire quali fasi e in che condizioni queste si sviluppano sulla superficie del VPP. Si è inoltre capito che la fase selettiva nel prodotto desiderato, AM, è costituita da δ-VOPO4. Non è ancora noto con esattezza perché questo composto offra le prestazioni migliori; si ipotizza che ciò sia dovuto alla capacità di dare luogo a cicli redox tra V5+ e V4+ con cinetiche veloci, grazie al fatto che ha similarità strutturali con il VPP. La formazione di questa fase avviene più facilmente in presenza di un eccesso di P. Oltre al P, un altro fattore che influisce sulle prestazioni catalitiche è la presenza di elementi promotori. Tra questi, il Nb è uno dei più importanti, come dimostato dalle prove di reattività condotte in miscela butano-aria, utilizzando catalizzatori promossi con diversi quantitativi di Nb. In questo modo si è capito che alle basse temperature occorre un catalizzatore con una maggiore quantità di Nb (per esempio, rapporto V/Nb=46) per favorire la formazione della fase δ-VOPO4; mentre alle alte temperature, sono sufficienti piccole quantità di elemento promotore, in quanto indipendentemente dal rapporto P/V la fase predominante è δ-VOPO4. Una quantità elevata di Nb ha implicazioni negative sulla selettività, sia alle alte che alle basse temperature di reazione, perché favorisce la formazione di una superficie catalitica troppo ossidata. L’obiettivo del mio lavoro di tesi è stato quello di dimostrare una correlazione tra l’effetto del Nb e la formazione della fase δ-VOPO4. Per farlo, si è deciso di partire da VOPO4•2H2O (VPD) promosso con diversi quantitativi di Nb. Infatti, com’era già stato dimostrato in precedenza, il VPD che si forma in ambiente di reazione per ossidazione superficiale del VPP dà luogo a disidratazione a δ-VOPO4. Le trasformazioni del VPD promosso con Nb sono state monitorate utilizzando la spettroscopia Raman. Le prove condotte hanno confermato che l’addizione di Nb al VPP favorisce la formazione del composto desiderato; tuttavia, la medesima trasformazione non è stata osservata partendo dal composto VPD contenente Nb.

La metilazione del DNA come meccanismo di regolazione dell'espressione genica

La regolazione dell’espressione genica è un processo molto complesso e finemente controllato da fattori multipli, tra i quali quelli epigenetici hanno richiamato l’attenzione nell’ultima decade. I meccanismi di regolazione epigenetica comprendono la metilazione del DNA a livello delle isole CpG nella regione del promotore del gene e le modifiche istoniche post-traduzionali, quali acetilazioni e metilazioni. Questa serie di elementi di regolazione concorre a determinare uno stato di impacchettamento della cromatina più o meno rilassato, che influenzerà la trascrizione di geni critici, per esempio nello sviluppo o nelle neoplasie. Gli ambiti nei quali lo studio del profilo epigenetico ha assunto maggiore rilievo sono effettivamente quello oncologico e quello del differenziamento di cellule staminali, due contesti nei quali si è svolto il mio programma di Dottorato, nel quale ho seguito in parallelo più progetti presentati nella tesi in modo indipendente. La ricerca in campo tumorale è centrata sull’indagine di nuovi marcatori e sull’individuazione di profili epigenetici specifici per un determinato tumore che possano aiutare la diagnostica precoce, la classificazione e la sorveglianza dell’evoluzione clinica della neoplasia. In questo contesto si inserisce il progetto finalizzato alla costruzione di quadri associativi di metilazione in due tumori cerebrali, il glioblastoma (GBM) e l’oligodendroglioma (ODG). La casistica di GBM e di ODG in dotazione è stata valutata dal punto di vista della metilazione dei promotori di geni (MGMT, EMP3,..) con funzioni oncosoppressive e trovati ipermetilati anche in altri tumori o localizzati in regioni citologicamente instabili, per poter correlare questi dati con la risposta terapeutica nel caso del GBM o con i dati di perdita di eterozigosità (LOH) 1p19q nel caso dell’ODG. Parallelamente all’individuazione di marcatori epigenetici in ambito oncologico, la ricerca si sta muovendo anche nell’indagine di nuove potenziali terapie farmacologiche antitumorali su base epigenetica. In questo contesto, con lo scopo di approfondire le relazioni tra i meccanismi alla base della regolazione epigenetica, ci si è riproposti di valutare la correlazione tra il meccanismo di metilazione/demetilazione del DNA e quello di acetilazione/deacetilazione istonica e la loro vicendevole influenza nel determinare silenziamento genico piuttosto che riattivazione dell’espressione di geni ipermetilati. Sono stati usati farmaci epigenetici demetilanti, quali Azacitidina e Decitabina, inibitori della istone deacetilasi, quali la Tricostatina A, e inibitori della via di sintesi di molecole, le poliammine, coinvolte nella regolazione dell’espressione genica con modalità ancora da precisare in modo definitivo. Sebbene i meccanismi di regolazione epigenetica vengano studiati per lo più nel cancro, a causa delle gravi conseguenze che una loro disregolazione porta in termini di silenziamento di geni oncosoppressori, essi sono implicati fisiologicamente anche nel differenziamento di cellule staminali. Gli ultimi due progetti trattati nella tesi si contestualizzano in questo ambito. In particolare viene presentata la messa a punto di una metodologia di immunoprecipitazione sequenziale della cromatina finalizzata all’individuazione di due modificazioni istoniche associate alla stessa regione di DNA. Le modifiche hanno riguardato i marcatori rappresenatativi di cromatina trascrizionalmente repressa H3K27me3 (trimetilazione della Lys27 dell’istone H3) e di cromatina trascrizionalmente attiva H3K24me2 (dimetilazione della Lys4 dell’istone H3) che definiscono i domini detti bivalenti, associati a geni che codificano per fattori di trascrizione che regolano lo sviluppo in cellule embrionali staminali, mantenendoli pronti per un veloce indirizzamento verso l’ attivazione trascrizionale. Il ruolo che la regolazione epigenetica svolge durante il differenziamento di cellule staminali non è ancora noto con precisione. È chiaro però che la memoria della linea cellulare verso la quale si differenzia una cellula staminale adulta, implica l’utilizzo di modifiche epigenetiche, quali la metilazione del DNA e correlati pattern di metilazione e acetilazione istonica. L’ultimo progetto, trattato, è stato finalizzato a verificare il coinvolgimento dell’epigenetica e in particolare della metilazione dei promotori di fattori trascrizionali precocemente attivati durante il differenziamento verso il fenotipo muscolare cardiaco di cellule staminali umane derivate da tessuto adiposo (ADSCs).

Diagnosi non distruttiva del patrimonio architettonico: esempi applicativi di radar e termografia attiva

La necessità di conservazione e recupero di murature, di qualsiasi interesse storico/architettonico, ha evidenziato la necessità di conoscere il più dettagliatamente possibile le caratteristiche strutturali delle opere interessate: un intervento risulterà tanto più efficace e adatto agli scopi prefissi quanto maggiore sarà la conoscenza dell’opera, della sua evoluzione, dei materiali utilizzati per la realizzazione, della tecnica costruttiva e della struttura portante. Spesso è necessario eseguire interventi di adeguamento sismico di comuni edifici su cui poter intervenire più o meno indiscriminatamente, mentre, per opere di interesse storico è necessario ridurre al minimo l’invasività degli interventi: in tutti e due i casi, una buona riuscita dell’intervento dipende dalla conoscenza dell’organismo strutturale sul quale si deve operare. Come spesso accade, anche per opere di recente costruzione, risulta difficile poter recuperare i dati progettuali (disegni e calcoli) e spesso le tecniche e le tipologie utilizzate per le costruzioni si differenziavano da zona a zona, così come diversi erano i materiali da costruzione; risulta quindi evidente che per progettare una serie di interventi di recupero è necessario poter ottenere il maggior numero di informazioni al riguardo. Diverse sono le esperienze maturate in questo campo in tutta Europa e queste hanno mostrato come non è sufficiente intervenire con tecniche innovative per adeguare agli standard attuali di sicurezza opere del passato: infatti, in molti casi, l’applicazione sbagliata di queste tecniche o gli interventi progettati in modo non adeguato non hanno svolto il loro compito e in alcuni casi hanno peggiorato la situazione esistente. Dalle esperienze maturate è stato possibile osservare che anche le migliore tecniche di recupero non possono risultare efficaci senza un’adeguata conoscenza dello stato di degrado degli edifici, del loro assetto strutturale e delle possibili carenze. La diagnostica strutturale si vuole inserire proprio in questo livello potendo fornire ad un progettista tutte le informazioni necessarie per effettuare al meglio ed in maniera efficace gli interventi di recupero e restauro necessari. Oltre questi aspetti, le analisi diagnostiche possono essere utilizzate anche per verificare l’efficacia degli interventi effettuati. Diversi sono gli aspetti che si possono analizzare in un’indagine di diagnostica ed in base alle esigenze e alle necessità del rilievo da effettuare sono varie le tecniche a disposizione, ognuna con le sue peculiarità e potenzialità. Nella realizzazione di questa tesi sono state affrontate diverse problematiche che hanno previsto sia l’analisi di situazioni reali in cantiere, sia lo studio in laboratorio. La prima parte del presente elaborato prevede lo studio delle attività svolte a Palazzo Malvezzi, attuale sede della Provincia di Bologna. L’edificio, di interesse storico, ha subito diverse trasformazioni durate la sua vita ed in alcuni casi, queste, eseguite con tecnologie e materiali inadatti, hanno provocato variazioni nell’assetto statico della struttura; inoltre, il palazzo, è soggetto a movimenti a livello di fondazione in quanto è presente una faglia di subsidenza che attraversa l’edificio. Tutte queste problematiche hanno creato movimenti differenziali alla struttura in elevazione che si sono evidenziati con crepe distribuite in tutto l’edificio. Il primo aspetto analizzato (capitoli 4 e 5) è lo studio della profondità delle fessure presenti nel solaio della sala Rossa, sede dei comunicati stampa e delle conferenze della Provincia. Senza dubbio antiestetiche, le crepe presenti in una struttura, se sottovalutate, possono compromettere notevolmente le funzioni statiche dell’elemento in cui si sviluppano: la funzione di protezione fornita dal solaio o da qualsiasi altro elemento strutturale alle armature in questo immerse, viene meno, offrendo vie preferenziali a possibili situazioni di degrado, specialmente se in condizioni ambientali aggressive. E' facile intuire, quindi, che un aspetto all’apparenza banale come quello delle fessure non può essere sottovalutato. L’analisi è stata condotta utilizzando prove soniche ed impact-echo, tecniche che sfruttano lo stresso principio, la propagazione delle onde elastiche nel mezzo, ma che si differenziano per procedure di prova e frequenze generate nel test. Nel primo caso, la presenza del martello strumentato consente di valutare anche la velocità di propagazione delle onde elastiche, fenomeno utilizzato per ottenere indicazioni sulla compattezza del mezzo, mentre nel secondo non è possibile ricavare queste informazioni in quanto la tecnica si basa solamente sullo studio in frequenza del segnale. L’utilizzo dell’impact-echo è stato necessario in quanto la ristilatura effettuata sulle fessure scelte per l’analisi, non ha permesso di ottenere risultati utili tramite prove soniche ; infatti, le frequenze generate risultano troppo basse per poter apprezzare queste piccole discontinuità materiali. La fase di studio successiva ha previsto l’analisi della conformazione dei solai. Nel capitolo 6, tale studio, viene condotto sul solaio della sala Rossa con lo scopo di individuarne la conformazione e la presenza di eventuali elementi di rinforzo inseriti nelle ristrutturazioni avvenute nel corso della vita del palazzo: precedenti indagini eseguite con endoscopio, infatti, hanno mostrato una camera d’aria ed elementi metallici posizionati al di sotto della volta a padiglione costituente il solaio stesso. Le indagini svolte in questa tesi, hanno previsto l’utilizzo della strumentazione radar GPR: con questa tecnica, basata sulla propagazione delle onde elettromagnetiche all’interno di un mezzo, è possibile variare rapidamente la profondità d’ispezione ed il dettaglio ottenibile nelle analisi cambiando le antenne che trasmettono e ricevono il segnale, caratteristiche fondamentali in questo tipo di studio. I risultati ottenuti hanno confermato quanto emerso nelle precedenti indagini mostrando anche altri dettagli descritti nel capitolo. Altro solaio oggetto d’indagine è quello della sala dell’Ovale (capitoli 7 e 8): costruito per dividere l’antica sala da ballo in due volumi, tale elemento è provvisto al suo centro di un caratteristico foro ovale, da cui ne deriva il nome. La forma del solaio lascia supporre la presenza di una particolare struttura di sostegno che le precedenti analisi condotte tramite endoscopio, non sono riuscite a cogliere pienamente. Anche in questo caso le indagini sono state eseguite tramite tecnica radar GPR, ma a differenza dei dati raccolti nella sala Rossa, in questo caso è stato possibile creare un modello tridimensionale del mezzo investigato; inoltre, lo studio è stato ripetuto utilizzando un’antenna ad elevata risoluzione che ha consentito di individuare dettagli in precedenza non visibili. Un ulteriore studio condotto a palazzo Malvezzi riguarda l’analisi della risalita capillare all’interno degli elementi strutturali presenti nel piano interrato (capitolo 9): questo fenomeno, presente nella maggior parte delle opere civili, e causa di degrado delle stesse nelle zone colpite, viene indagato utilizzando il radar GPR. In questo caso, oltre che individuare i livelli di risalita osservabili nelle sezioni radar, viene eseguita anche un’analisi sulle velocità di propagazione del segnale e sulle caratteristiche dielettriche del mezzo, variabili in base al contenuto d’acqua. Lo scopo è quello di individuare i livelli massimi di risalita per poterli confrontare con successive analisi. Nella fase successiva di questo elaborato vengono presentate le analisi svolte in laboratorio. Nella prima parte, capitolo 10, viene ancora esaminato il fenomeno della risalita capillare: volendo studiare in dettaglio questo problema, sono stati realizzati dei muretti in laterizio (a 2 o 3 teste) e per ognuno di essi sono state simulate diverse condizioni di risalita capillare con varie tipologie di sale disciolto in acqua (cloruro di sodio e solfato di sodio). Lo scopo è di valutare i livelli di risalita osservabili per diverse tipologie di sale e per diverse concentrazioni dello stesso. Ancora una volta è stata utilizzata la tecnica radar GPR che permette non solo di valutare tali livelli, ma anche la distribuzione dell’umidità all’interno dei provini, riuscendo a distinguere tra zone completamente sature e zone parzialmente umide. Nello studio è stata valutata anche l’influenza delle concentrazioni saline sulla propagazione del segnale elettromagnetico. Un difetto delle tecniche di diagnostica è quello di essere strumenti qualitativi, ma non quantitativi: nel capitolo 11 viene affrontato questo problema cercando di valutare la precisione dei risultati ottenuti da indagini condotte con strumentazione radar GPR. Studiando gli stessi provini analizzati nel capitolo precedente, la tecnica radar è stata utilizzata per individuare e posizionare i difetti (muretti a 3 teste) e le pietre (muretti a 2 teste) inserite in questi elementi: i risultati ottenuti nella prova sono stati confrontati, infine, con la reale geometria. Nell’ultima parte (capitolo 12), viene esaminato il problema dell’individuazione dei vuoti all’interno di laterizi: per questo scopo sono state create artificialmente delle cavità di diversa forma e a diverse profondità all’interno di laterizi pieni che, dopo un trattamento in cella climatica per aumentarne la temperatura, sono stati sottoposti a riprese termografiche nella fase di raffreddamento. Lo scopo di queste prove è quello di valutare quale sia la massima differenza di temperatura superficiale causata dai diversi difetti e per quale intervallo di temperature questa si verifica.

Studio in vitro della suscettibilità genetica degli ovini alle EST: il PMCA come alternativa agli studi di trasmissione in vivo

Le encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST), o malattie da prioni, sono malattie neurodegenerative che colpiscono l'uomo e gli animali. Le più note tra le EST animali sono la scrapie della pecora e della capra, l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE), la Sindrome del dimagrimento cronico (CWD) dei cervidi. Negli uomini ricordiamo la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) nelle sue diverse forme (sporadica, genetica, iatrogenica e variante). La dimostrazione che la variante della CJD (vCJD) sia causata dallo stesso agente eziologico della BSE, ha evidenziato il potenziale zoonotico di queste malattie. Le EST sono caratterizzate da tempi di incubazione estremamente lunghi ed esito invariabilmente fatale. Il momento patogenetico centrale comune a tutte queste malattie è rappresentato dalla modificazione conformazionale di una proteina cellulare denominata PrPC (proteina prionica cellulare) in una isoforma patologica denominata PrPSc, insolubile e caratterizzata da una parziale resistenza alle proteasi, che tende a depositarsi sotto forma di fibrille amiloidee nel SNC dei soggetti colpiti. La suscettibilità degli ovini alla scrapie è largamente influenzata dal genotipo del gene dell’ospite che codifica per la PrP (PRNP), e più precisamente da tre polimorfismi presenti ai codoni 136, 154 e 171. Questi si combinano in cinque principali alleli, ARQ, VRQ, AHQ, ARH e ARR, correlati a differenti gradi di suscettibilità alla malattia. Risultati ottenuti da un precedente studio d’infezione sperimentale di ovini di razza Sarda con scrapie classica (Vaccari G et al 2007), hanno suggeriscono l’ordine di suscettibilità ARQ>AHQ>ARH. L’allele ARR, è risultato invece associato ai più alti livelli di protezione dalla malattia. Dallo stesso studio di trasmissione sperimentale e da uno studio epidemiologico di tipo caso-controllo, è inoltre emerso che nella razza Sarda, ovini con l’allele ARQ, con sostituzione amminoacidica al codone 137 Metionina (M)/Treonina (T) (AT137RQ) o al 176 Asparagina (N)/Lisina (K) (ARQK176) in eterozigosi sono protetti dalla scrapie. Inoltre studi di trasmissione sperimentale della BSE in ovini della stessa razza con tre differenti genotipi (ARQ/ARQ, ARQ/ARR e ARR/ARR), hanno dimostrato come la BSE abbia un targeting genetico molto simile a quello della scrapie, evidenziando il genotipo ARQ/ARQ come il più suscettibile. L’obbiettivo della seguente tesi è stato quello di verificare se fosse possibile riprodurre in vitro la differente suscettibilità genetica degli ovini alle EST evidenziata in vivo, utilizzando il PMCA (Protein Misfolding Cyclic Amplification), la metodica ad oggi più promettente e di cui è stata dimostrata la capacità di riprodurre in vitro diverse proprietà biologiche dei prioni. La tecnica, attraverso cicli ripetuti di sonicazione/incubazione, permette la conversione in vitro della PrPC presente in un omogenato cerebrale (substrato), da parte di una quantità minima di PrPSc (inoculo) che funge da “innesco” della reazione. Si è voluto inoltre utilizzare il PMCA per indagare il livello di protezione in omozigosi di alleli rari per i quali, in vivo, si avevano evidenze di protezione dalla scrapie solo in eterozigosi, e per studiare la suscettibilità degli ovini alla BSE adattata in questa specie. È stata quindi testata in PMCA la capacità diversi substrati ovini recanti differenti genotipi, di amplificare la PrPSc dello stesso isolato di scrapie classica impiegato nel precedente studio in vivo o di un inoculo di BSE bovina. Inoltre sono stati saggiati in vitro due inoculi di BSE costituiti da omogenato cerebrale di due ovini sperimentalmente infettati con BSE (BSE ovina) e recanti due differenti genotipi (ARQ/ARQ e ARR/ARR). Per poter descrivere quantitativamente il grado di correlazione osservato i risultati ottenuti in vitro e i quelli riscontrati dallo studio di sperimentazione con scrapie, espressi rispettivamente come fattori di amplificazione e tempi d’incubazione registrati in vivo, sono stati analizzati con un modello di regressione lineare. Per quanto riguarda la scrapie, i risultati ottenuti hanno evidenziato come i genotipi associati in vivo a suscettibilità (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ and AHQ/ARH) siano anche quelli in grado di sostenere in PMCA l’amplificazione della PrPSc, e come quelli associati a resistenza (ARQ/ARR and ARR/ARR) non mostrino invece nessuna capacità di conversione. Dall’analisi di regressione lineare è inoltre emerso come l’efficienza di amplificazione in vitro dei differenti genotipi testati sia inversamente proporzionale ai tempi d’incubazione registrati in vivo. Inoltre nessuna amplificazione è stata riscontrata utilizzando il substrato con genotipo raro ARQK176/ARQK176 suggerendo come anche questo possa essere associato a resistenza, almeno nei confronti dell’isolato di scrapie classica utilizzato. Utilizzando come inoculo in PMCA l’isolato di BSE bovina, è stato possibile riscontrare, nei tre genotipi analizzati (ARQ/ARQ, ARQ/ARR e ARR/ARR) un evidente amplificazione per il solo genotipo ARQ/ARQ, sottolineando anche in questo caso l’esistenza di una correlazione tra suscettibilità riscontrata in vivo e capacità di conversione in PMCA. I tre i substrati analizzati mostrano inoltre una buona efficienza di amplificazione, per altro simile, se si utilizza la PrPSc dell’inoculo di BSE sperimentalemente trasmessa agli ovini. Questi genotipi sembrerebbero dunque ugualmente suscettibili se esposti a BSE adattata alla specie ovina. I risultati di questa tesi indicano dunque una correlazione diretta tra la capacità di conversione della PrPC con il PMCA e la suscettibilità osservata in vivo per i differenti genotipi analizzati. Mostrano inoltre come il PMCA possa essere una valida alternativa agli studi di trasmissione in vivo e un rapido strumento utile non soltanto per testare, ma anche per predire la suscettibilità genetica degli ovini a diversi ceppi di EST, rappresentando un valido aiuto per l’individuazione di ulteriori genotipi resistenti, così da incrementare la variabilità genetica dei piani di selezione attuati per gli ovini per il controllo di queste malattie.