Expresión y exportación del fragmento formador de poros de colicina A: Formación de un complejo inactivo con su proteína de inmunidad

La colicinas son bacteriocinas producidas por cepas de Escherichia coli y letales para otras cepas relacionadas. Este trabajo está enfocado a la interacción proteína-proteína del complejo funcional caa-cai. Las interacciones proteína-proteína dentro de la membrana han sido tradicionalmente muy difíciles de cuantificar. Sin embargo, publicaciones anteriores han demostrado que el sistema caa-cai representa un complejo eficaz a la hora de inhibir la actividad tóxica de caa. Además, este complejo posee dos ventajas principales que facilitan su estudio: la interacción debe tener una alta afinidad y se debe poder medir in vivo de forma indirecta. El objetivo principal de esta memoria reside en la optimización de las condiciones de sobreexpresión del complejo funcional caa-cai. La formación del complejo en el sistema natural implica el acceso de ambas proteínas desde lados opuestos de la IM de la bacteria. Con el fin de mimetizar este escenario es necesario inducir la exportación del fragmento pf-caa al periplasma celular tras su sobreexpresión.

Papel regulatório da proteína anexina-1 e de seu derivado Ac2-26 no modelo experimental de asma alérgica em camundongos

A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias aéreas, acúmulo de eosinófilos, secreção de muco e remodelamento. No decorrer do estabelecimento do processo inflamatório, há liberação de mediadores endógenos que atuam limitando a evolução do quadro patológico e garantindo a manutenção da homeostasia (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Dentre estes recebem destaque os hormônios glicocorticóides, reconhecidos por sua atividade anti-inflamatória, dependente, em parte, da geração de fatores intermediários como a proteína anexina-1 (AnxA1) (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). Neste estudo investigou-se o papel regulatório da AnxA1 e do peptídeo derivado Ac2-26 (50 - 200 g/animal) no modelo experimental de asma alérgica murina. Camundongos BALB/c (AnxA1+/+) e depletados do gene codificante para AnxA1 (AnxA1-/-) foram sensibilizados com ovoalbumina (OVA 50 g) e hidróxido de alumínio (5 mg), por via subcutânea. Após 14 dias, foi feito reforço com OVA (25 g), por via intraperitoneal, e nos dias 19, 20 e 21 foram desafiados com OVA (25 g), por via intranasal. O tratamento consistiu na administração intranasal do peptídeo Ac2-26 (50 - 200 g), 1 h antes de cada desafio. As análises foram feitas 24 h após o último desafio e incluíram: i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina (3 27 mg/ml) através de pletismografia invasiva; ii) alterações morfológicas através de histologia clássica; iii) quantificação de colágeno e iv) quantificação de mediadores inflamatórios através de ELISA. Verificou-se que camundongos AnxA1-/-, quando ativamente sensibilizados e desafiados com OVA apresentaram exacerbação do quadro de hiper-reatividade das vias aéreas, assim como do número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e no infiltrado peribrônquico, deposição de colágeno e nos níveis de IL-13 em comparação aos controles AnxA1+/+. Em paralelo, observou-se que o peptídeo Ac2-26 levou a uma redução da hiper-reatividade das vias aéreas frente à estimulação com metacolina nos animais AnxA1+/+. O peptídeo Ac2-26 reduziu o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar e o número de eosinófilos peribronquiolares, além da produção de muco no tecido pulmonar e da geração IL-4, IL-13, eotaxina-1 e -2. Em conjunto, nossos achados mostram que os camundongos AnxA1-/- mostraram-se mais responsivos à estimulação antigênica, o que foi indicativo de que a AnxA1 parece exercer um papel regulatório importante sobre a resposta inflamatória alérgica murina. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta alérgica pulmonar foi indicativo de que este se coloca como um composto anti-inflamatório e anti-alérgico promissor para utilização na terapia da asma.

Efeito do tratamento com a proteína quimérica IL-13PE sobre a inflamação pulmonar induzida por partículas de sílica em camundongos

A interleucina 13 (IL-13) tem sido apontada como um dos principais mediadores em processos de ativação de fibroblastos e indução de fibrose pulmonar, sendo, portanto, considerada como um alvo terapêutico importante. A silicose é uma doença pulmonar inflamatória crônica, de caráter ocupacional, caracterizada por uma intensa resposta fibrótica e granulomatosa. Com base nestas observações, tivemos por objetivo investigar o potencial efeito da administração da imunotoxina IL-13-PE38QQR (IL-13PE) sobre o modelo de silicose em camundongos. Camundongos Swiss-Webster foram anestesiados e instilados intranasalmente com partículas de sílica (10 mg), sendo a administração da IL-13PE (200ng/dia) realizada por via intranasal, uma vez ao dia em dias alternados no período entre 21 a 27 dias após a provocação. Analisamos o componente inflamatório, a deposição de colágeno e a área de granuloma avaliados através de técnicas clássicas de histologia, incluindo coloração com H&E e Picrus-sirius, ou ainda a quantificação do conteúdo de colágeno por Sircol. Os componentes de matriz extracelular fibronectina e laminina foram avaliados através de imunohistoquímica. Citocinas e quimiocinas foram quantificadas por sistema de ELISA. As medidas de função pulmonar e resposta de hiperreatividade foram realizadas através do sistema de pletismografia de corpo inteiro invasiva. Verificamos que o tratamento curativo com a IL-13PE inibiu de forma acentuada o comprometimento da função pulmonar nos camundongos silicóticos, incluindo tanto aumento da resistência como da elastância, assim como a resposta de hiperratividade das vias aéreas ao agente broncoconstrictor metacolina. De forma coerente, os animais silicóticos quando submetidos ao tratamento com IL-13PE apresentaram marcada redução do componente inflamatório pulmonar e da resposta fibrótica, atestado pela diminuição na produção de colágeno, laminina e fibronectina e redução importante da área de granuloma. De forma semelhante, as citocinas (TNF-α e TGF-) e quimiocinas (MIP-1α, MIP-2, TARC, IP-10, MDC) detectadas em quantidade aumentada no pulmão de animais silicóticos foram reduzidas pelo tratamento com a IL-13PE. Em conclusão, nossos resultados mostram que a administração curativa da IL-13PE foi capaz de inibir os componentes inflamatórios e fibróticos da fase crônica do quadro silicótico em camundongos, o que se refletiu de forma clara na melhora da função pulmonar. Em conjunto, nossos achados indicam que a utilização da IL13PE parece constituir uma abordagem terapêutica extremamente promissora para aplicação em casos de doenças crônicas de natureza fibrótica como a silicose.

ExoU, uma proteína do sistema de secreção do tipo III de Pseudomonas aeruginosa, induz a secreção de eicosanóides por células epiteliais respiratórias. Papel dos corpúsculos lipídicos neste processo

Para pesquisar o papel de ExoU no desencadeamento de resposta inflamatória nas vias aéreas, células epiteliais respiratórias humanas (CERs) da linhagem BEAS-2B foram tratadas com AA radiomarcado e infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa, que secreta ExoU, e com os mutantes PA103exoU (com deleção do gene exoU), PA103ΔUT/exoU (com deleção de exoU e complementação com o gene funcional) e PA103UT/S142A (com deleção de exoU e complementação com gene com mutagênese sítio-específica no domínio catalítico da enzima). Após 1 hora, a liberação de AA pelas culturas infectadas com as cepas produtoras de ExoU foi significativamente superior à observada em culturas infectadas pelas cepas não-produtoras ou por células controle. O tratamento das bactérias com MAFP, um inibidor de PLA2, resultou em significativa redução na liberação de AA. Células infectadas pelas cepas PA103 e PA103ΔUT/exoU secretaram PGE2 e LTB4 em concentrações significativamente maiores que as secretadas por células infectadas pelas demais cepas ou não infectadas. O tratamento com o MAFP reduziu significativamente a secreção de PGE2. A análise, por citometria de fluxo, de células infectadas e não infectadas tratadas com anticorpo anti-COX-2 mostrou que o percentual de células infectadas por PA103 marcadas foi significativamente superior ao percentual encontrado em culturas controle. Nenhuma diferença foi observada quanto ao percentual de células marcadas em culturas infectadas por PA103ΔexoU. O tratamento das culturas com NS-398 (um inibidor seletivo de COX-2) resultou na diminuição significativa da concentração de PGE2, secretada por células infectadas com PA103, mas não por células infectadas com PA103ΔexoU ou por células controle. Corpúsculos lipídicos (CLs) são domínios citoplasmáticos ricos em COX-2 e outras enzimas responsáveis pelo metabolismo do AA, sede da produção de eicosanóides. Como células infectadas pelas cepas produtoras de ExoU liberam AA livre, formulamos a hipótese de que a maior produção de eicosanóides por estas células seria dependente da indução do aumento no número dos CLs. No entanto, a análise por citometria de fluxo de células tratadas com uma sonda lipofílica com afinidade com os CLs mostrou que o percentual de células marcadas em culturas infectadas pelas cepas produtoras de ExoU foi significativamente inferior ao percentual em culturas controle ou infectadas pelas outras 2 cepas bacterianas. O tratamento das células com MAFP inibiu significativamente a redução do percentual de células contendo CLs. A análise, por citometria de fluxo, de células controle ou infectadas tratadas simultaneamente com a sonda lipofílica e com o anticorpo anti-PGE2, mostrou, em células infectadas com PA103, a redução da mediana da intensidade de marcação com a sonda lipofílica e o aumento da mediana da intensidade de marcação com o anticorpo anti-PGE2. Nossa hipótese é que a presença de ExoU nas células infectadas com a cepa PA103 resulte no metabolismo de glicerofosfolipídios presente nos CLs levando à diminuição da afinidade dos CLs pela sonda lipofílica e à síntese local de PGE2.

Alterações da expressão da proteína PHEX na Hanseníase

A hanseníase é uma doença infecciosa causada pelo Mycobacteruim leprae, um bacilo intracelular obrigatório, que prolifera principalmente na pele e nos nervos periféricos no interior de células como macrófagos e células de Schwann. A transmissão ocorre por meio das mucosas das vias respiratórias, provavelmente por aerossóis expelidos por indivíduos infectados. O homem é o seu hospedeiro natural sendo a multiplicação do bacilo muito lenta, com um período de geração estimado de 14 dias. Apesar da mínima variação no genoma do M. leprae, a doença é caracterizada por um espectro de formas clínicas bem definido, decorrente da capacidade de resposta imune do hospedeiro. Em pacientes classificados como multibacilares (MB) a doença é disseminada, com inúmeras lesões de pele e proliferação bacilar considerável. Nesses indivíduos ocorre hiporresponsividade celular ao M. leprae. Nas formas paucibacilares (PB), os pacientes apresentam uma ou poucas lesões, a carga bacilar é pequena e, às vezes não observada por meio da baciloscopia tradicional e ocorre resposta imune patógeno-específica. As incapacidades físicas nos pacientes decorrem da neuropatia e osteopatia e podem ser irreversíveis. Essas deformidades podem avançar mesmo após a diminuição da carga bacilar com o final do tratamento poliquimioterápico. A presente tese teve por objetivo estudar as implicações da proteína PHEX nas alterações fisiopatológicas da hanseníase, em especial as alterações ósseas. A proteína PHEX (Phosphate-regulating gene with Homologies to Endopeptidase on the X chromosome) é expressa em várias células humanas e, no primeiro artigo que compõe essa tese, demonstramos que o M.leprae leva à diminuição da expressão de PHEX em linhagens de células de Schwann e osteoblastos humanos. Este efeito foi igualmente causado por outras espécies de micobactérias. No segundo manuscrito ora submetido, observamos que em leucócitos sanguíneos de pacientes hansenianos também ocorreu modulação negativa de PHEX. Este efeito não se relacionou com a capacidade de produção de citocinas inflamatórias frente ao M. leprae in vitro ou com alterações bioquímicas. O efeito inibidor da mineralização ocasionado pela modulação negativa de PHEX talvez contribua para a doença óssea da hanseníase, auxiliando a explicar a capacidade do M. leprae de penetrar e sobreviver no osso.

Predição de proteína, matéria seca e fósforo em grãos de milho pela espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo.

Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de curvas de calibração por espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo (NIRS) para os teores de matéria seca, proteína e fósforo em amostras de milho processado. Neste trabalho, foi utilizada a espectroscopia no infravermelho com Transformada de Fourier aplicando a técnica de reflectância difusa, cujos dados espectrais foram correlacionados aos valores nutricionais do milho através do método de regressão dos mínimos quadrados parciais (PLS) e diferentes pré-tratamentos matemáticos nos espectros. Para a construção de modelo de calibração, foram utilizados os dados de referência de análises químicas dos valores do teor de matéria seca, proteína bruta e fósforo (P) de 191 amostras de milho em grão de diferentes procedências e variedades. Destas amostras, 114 foram usadas para o modelo de calibração, 48 para validação. A espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo, associada ao método de calibração multivariada (PLS), é uma técnica alternativa viável para a determinação do teor de proteína total e matéria seca em amostras de milho moído. As curvas ajustadas para proteína bruta, matéria seca e fósforo apresentaram performance adequada para utilização em amostras provenientes de ensaios de screening ou onde se tem grande número de repetições de amostras por tratamentos. Para utilização em determinações analíticas, como método de rotina laboratorial, os modelos de calibração devem ser aprimorados.

Modelagem molecular da proteína small heat shock de Xylella fastidiosa.

Este documento descreve o modelo molecular da proteína XF2234 e a análise preliminar da sua estrutura. O modelo foi construído por modelagem por homologia (ou modelagem comparativa) com a estrutura cristalográfica de uma proteína small heat shock de Triticum aestivum (trigo). A análise da estrutura tridimensional da proteína XF2234 tem o objetivo de contribuir para aumentar o conhecimento sobre o papel biológico das smHSPs, necessário para o combate à CVC.

Utilização de alinhamento estrutural de proteínas no estudo de Interface Forming Residues de proteína-quinases com inibidores protéicos.

Alinhamento estrutural de proteínas e análise de interação proteína-inibidor. As proteínas-quinases (PK) como alvo biológico. Três grupos de estruturas diferentes no domínio catalítico de PK. Superposição dos dados obtidos no alinhamento sequencial e estrutural.

Aspectos computacionais da análise da co-evolução de aminoácidos que pertencem a uma proteína qualquer.

O software Sting é um software voltado para a Bioinformática e, d eforma geral, faz análise de estrutura de proteínas e mostra de forma especializada qualquer proteína cuja estrutura está em arquivos .pdf, que contém dados sobre proteínas, podendo ser acessados em Research Collaboratory for Structural Bionformatics.

Cálculo de possíveis contatos atômicos internos a uma proteína ou entre proteínas no software SMS.

Contatos interatômicos são definidos no contexto deste trabalho como as forças de atração ou de repulsão existentes entre átomos distintos.

Mancha Ojo de Rana (Cercospora sojina K. Hara) y su efecto sobre rendimiento y componentes industriales del grano de soja : proteína y aceite

La mancha ojo de rana (MOR), causada por Cercospora sojina K. Hara, se encuentra dentro del complejo de enfermedades fúngicas de fin de ciclo (EFC), que afectan al cultivo de soja (Glycine max (L.) Merr.) preferentemente en los estadíos reproductivos. Es una enfermedad común en la soja en la mayor parte de las regiones sojeras del mundo, incluyendo Argentina. Con los objetivos de (i) estudiar el efecto de MOR sobre rendimiento y calidad industrial del grano de soja y (ii) analizar la respuesta a distintos momentos de aplicación de estrobilurina+triazol durante el ciclo reproductivo del cultivo para disminuir el daño de esta enfermedad evitando pérdidas del rendimiento y de calidad del grano, se realizó un ensayo durante la campaña agrícola 2010-2011, en la localidad de Oncativo (Cordoba), que involucró 2 genotipos contrastantes en susceptibilidad a MOR. Se realizaron para cada cultivar cuatro tratamientos con una mezcla de triazol y estrobilurina: T1= aplicación en R3; T2= aplicación en R3+R5; T3= testigo enfermo (sin aplicación de fungicida) y T4= testigo sano (aplicacion cada 20 dias a partir de R1). Se determinó el nivel de incidencia y severidad de la enfermedad, rendimiento, número de grano por m2 (NGm2), peso de mil semillas (PMA), concentración de proteína (Pr) y aceite (Ac) del grano. Se observaron distintos niveles de severidad de MOR entre los tratamientos del cultivar DM3700. Todos los tratamientos que involucraron a DM3810 mostraron hojas sin manchas de MOR. Se encontró una correlación negativa entre la severidad de MOR y el rendimiento alcanzado por el cultivo. Los valores más elevados de severidad (37,3 por ciento de manchas foliares) se correspondieron con los rendimientos mas bajos (2117 kg ha-1) en el cultivar DM3700. Todos los tratamientos aplicados a DM3810 exhibieron los rendimientos mas elevados y no se diferenciaron estadisticamente entre si (3478 kg ha-1). DM3700 alcanzó rendimientos similares a DM3810 sólo cuando se aplicó la mezcla de fungicidas en T1 y T4, no diferenciándose entre si ambos tratamientos y mostrando un incremento en el rendimiento de aproximadamente 35,5 por ciento comparado con su testigo enfermo. Ambos componentes del rendimiento disminuyeron en el testigo enfermo DM3700; sin embargo, las reducciones en el NGm2 fueron más pronunciadas que las del PMAj y; por lo tanto, disminuciones en el NGm2 parecían ser el principal componente de la pérdida de rendimiento. No se observaron incrementos de rendimiento, NGm2 y/o PMAj atribuídos a la mezcla estrobilurinas + triazoles en los tratamientos que involucraron a DM3810 ante ausencia de MOR. La severidad máxima alcanzada por MOR en el genotipo mas susceptible (37,3 por ciento) de area foliar dañada en el tratamiento enfermo de DM3700) no fue suficiente como para causar disminución significativa en la acumulación del aceite. Según nuestro conocimiento este trabajo es el primero en demostrar que genotipos susceptibles a MOR disminuyen su rendimiento, pero no la calidad química del grano, si la severidad es . 37,3 por cientoy pueden ser controlados con una única aplicación de estrobilurina+triazol en R3. Concluyéndose que la elección de genotipos poco susceptibles a MOR (como DM3810) es efectiva para controlar C. sojina, sin beneficios adicionales en el rendimiento debidos a la aplicacion de fungicidas.

Efecto de variables ambientales sobre la productividad primaria neta aérea y la concentración de proteína bruta de gramíneas en sistemas silvopastoriles de ñire (Nothofagus antarctica) : creación de un modelo de simulación

Nothofagus antarctica (ñire) ocupa una importante superficie de los bosques de Patagonia Sur, siendo ampliamente usado como sistemas silvopastoriles con ganadería ovina y bovina. Sin embargo, en la mayoría de los casos el uso de estos bosques se realiza sin un manejo que permita optimizar la sustentabilidad del sistema. En esta tesis se estudió el efecto de distintas variables ambientales (temperatura, humedad del suelo, radiación) sobre la productividad y concentración de Proteína bruta (PB) de gramíneas en distintas situaciones de calidad forestal y coberturas de copas de bosques de ñire, así como también procesos asociados: descomposición y dinámica de nutrientes (mineralización-inmovilización) de residuos del estrato arbóreo y graminoso y mineralización de nitrógeno del suelo. La productividad de materia seca (MS) aérea de gramíneas (rango entre 135 a 1863 kg MS ha-1) estuvo positivamente asociada a la calidad forestal de los sitios, mientras que el efecto de las coberturas de copa dependió de la interacción con otras variables ambientales. Los valores de PB variaron principalmente según la cobertura de copa encontrándose los mayores valores en lugares más sombreados (transmisividades menor al 70 por ciento). La descomposición, tanto en hojas de ñire como en gramíneas, varió según el nivel de radiación, siendo mayores en los lugares con menor cobertura. Por otro lado, la dinámica de nutrientes no fue afectada por la CS o alguna variable estudiada. La mineralización de nitrógeno del suelo fue mayormente afectada por la humedad del suelo y el efecto de la cobertura de copa según la calidad del sitio forestal. Finalmente con los datos obtenidos e información de bibliografía se generó un modelo de simulación de productividad de MS y concentración de PB de gramíneas creciendo en bosques de ñire. El modelo generado después de ser sometido a diferentes pruebas se considera aceptable para ser usado como una herramienta de manejo sustentable en estos sistemas, aportando además nuevos conocimientos sobre las causales en la variación productiva y de calidad de los pastizales en bosques de ñire.

Análisis de la variabilidad genotípica de cebada cervecera en rendimiento, porcentaje de proteína y calibre en distintos ambientes

En Argentina el principal uso de la cebada cervecera es la industria maltera. En la actualidad el cultivo tuvo una expansión en superficie a nuevas zonas de siembra, lo cual sumado a la introducción de nuevos genotipos al mercado hace relevante el estudio de la interacción genotipo por ambiente (GxA). Al ser el principal destino la industria, son de suma importancia parámetros de calidad como porcentaje de proteína y calibre. El objetivo del trabajo fue evaluar el comportamiento en cuanto a rendimiento, porcentaje de proteína y calibre de los principales genotipos argentinos de cebada cervecera en respuesta a variaciones ambientales. Para el trabajo se utilizaron los datos de la Red de Evaluación de Cultivares de Cebada coordinada por el INTA, se seleccionaron 8 genotipos y 14 ambientes (diferentes localidades en las campañas 2007 y 2008). Se determinaron las interacciones genotipo x ambiente realizando análisis de varianza, se calcularon los índices ambientales y se realizó un análisis de componentes principales. El ambiente fue el principal factor condicionante de las variaciones en rendimiento, porcentaje de proteína en grano o calibre, seguido por la interacción GxA y finalmente por el efecto genotipo. Los genotipos que presentaron los mayores rendimientos medios fueron también los que presentaron la mayor adaptabilidad. Las variaciones entre genotipos en porcentaje de proteína y calibre fueron más acentuadas que las obtenidas para rendimiento. El porcentaje de proteína en grano no presentó asociación con el rendimiento pero tuvo una relación negativa con el calibre. Las variaciones en ambientes (tanto por efecto sitio como por efecto año) estuvieron dadas por modificaciones en el nivel de precipitaciones en el ciclo del cultivo y por las temperaturas en post-floración.

Digestibilidad proteica de dietas para Randiá (Rhamdia quelen) utilizando fuentes alternativas de proteína en reemplazo de la harina de pescado

A fin de evaluar la posibilidad de reducir costos de alimentación en cultivo de Ramdia quelen, se realizaron dos ensayos experimentales. Uno orientado al cálculo de la digestibilidad in vivo de diferentes dietas con el fin de analizar como afecta el remplazo de la harina de pescado en su digestibilidad proteica. Por otro lado, un ensayo de crecimiento en jaulas para calcular su desempeño productivo. Ambas experiencias fueron realizadas en el Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (provincia de Corrientes, 27°32´S,58°30´W) utilizando dos dietas experimentales (15 y 11 por ciento de harina de pescado) junto a un Control (20 por ciento). Para los estudios de digestibilidad se utilizó Cr2O3 como marcador inerte, recolectando las heces en tanques cilindro-cónicos de 150 L conectados a una columna de decantación. Sólo fueron observadas diferencias significativas utilizando p=0,1 (P = 0,0764) en los valores de CDA de la proteína obtenidos entre el Control y la D2, sin observarse diferencias entre estas y la D1. La experiencia en campo se desarrolló en jaulas de 1 m3, con peces de un Peso Inicial promedio aproximado de 28 g, a una densidad de 300 individuos/jaula,durante 197 días de cultivo. Los Pesos Finales promediaron 302,81; 287,07 y 273,39 g para las dietas Control, D1 y D2, respectivamente, observando diferencias significativas (P menor a 0.05) en el IPD, la TEP obtenida con la dieta Control superó a la de la D2 (P menor a 0.05) y no observándose diferencias significativas (P mayor a 0.05) en el FCR alcanzado con las diferentes dietas. Al analizarse los rendimientos obtenidos y los costos de las raciones suministradas, puede evidenciarse que si bien a medida que se reemplaza la proteína de origen animal, el precio por tonelada de dieta elaborada se reduce levemente,este se incrementa al analizar el costo del alimento por tonelada de pescado producido debido a un menor desempeño productivo de los peces.