Diagnosis of tuberculosis infection using interferon-γ-based assays

Interferon-γ-based assays, collectively known as IFN-γ release assays (IGRAs), have emerged as a reliable alternative to the old tuberculin skin test (TST) for the immunodiagnosis of tuberculosis (TB) infection. The 2 commercially available tests, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), QuantiFERON-TB Gold Intube (QFT-IT), and the enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT), T-SPOT.TB, are more accurate than TST for the diagnosis of TB, since they are highly specific and correlate better with the existence of risk factors for the infection. According to the available data, T-SPOT.TB obtains a higher number of positive results than QFT-IT, while its specificity seems to be lower. Although the sensitivity of the IFN-γ -based assays may be impaired to some extent by cellular immunosuppression and extreme ages of life, they perform better than TST in these situations. Data from longitudinal studies suggest that IFN-γ-based tests are better predictors of subsequent development of active TB than TST; however this prognostic value has not been consistently demonstrated. This review focuses on the clinical use of the IFN-γ -based tests in different risk TB groups, and notes the main limitations and areas for future development.

Justification du système économique et perception du travail en groupe

L'étude classique des attributions de responsabilité instiguée par Heider en psychologie sociale s'est principalement bornée à aborder ce processus psychosocial dans une perspective individualiste qui se cantonne aux niveaux intra-individuel et interpersonnel (selon la distinction opérée par Doise). Les réflexions et les travaux empiriques présentés dans cette thèse ont deux objectifs. Dans un premier temps, il s?agit d'élargir cette perspective aux autres niveaux sociologique et idéologique (en faisant notamment recours à l'approche des attributions sociales et aux propositions de Fauconnet sur les règles de responsabilité). Deuxièmement, il s?agit d'éprouver la pertinence d'une telle approche dans un contexte particulier : celui du travail en groupe dont la nature des rapports sociaux qui y étaient présentés ont été manipulés à l'aide de scénarii chez des étudiant-e-s de l?Université de Lausanne. L?objectif principal de cette thèse est donc de tester un modèle d?ancrage des attributions de responsabilité qui permette de souligner les dynamiques représentationnelles sous-jacentes en termes de légitimation ou de remise en cause de l?organisation des groupes. Dans l?ensemble les résultats indiquent que si la nature des rapports sociaux (re)présentés dans un groupe sont de puissants déterminants de la manière de légitimer ou de remettre en cause l?organisation des groupes, le niveau individuel d'adhésion à des croyances idéologiques dominantes, comme la justification du système économique, représente un modérateur des prises de position des répondant-e-s interrogé-e-s. De plus, il semble que ces processus évoluent dans le temps, faisant ainsi apparaître l'existence de phénomènes de socialisation relativement plus complexes que ne le laissent entendre les recherches actuellement effectuées dans ce domaine. En effet, si des connaissances idéologiques sur le monde sont acquises dans les filières universitaires et n?interviennent pas toujours dans les processus de formation des représentations du travail en groupe, des connaissances spécifiques aux disciplines et à la politique de sélection universitaire semblent intervenir dans le processus de légitimation des rapports sociaux dans les groupes au niveau des attributions. En tentant une articulation entre les concepts d?ancrage des représentations sociales, d?attribution et de socialisation, cette thèse permet ainsi de souligner la pertinence qu?il y a à insérer une problématique en termes de croyances idéologiques dans l?étude des groupes sociaux.<br/><br/>Heider?s approach of responsibility attributions almost exclusively emphasized on an individualistic point of view ; i.e. focusing at an intraindividual and interpersonnal level of analysis according to Doise?s distinction. The reflexions and empirical studies presented here firstly aim at broaden this perspective by taking socio-structural as well as societal levels of analysis into account. Secondly, it is to test this approach in the particular domain of organized groups. Manipulation of the structure of social relations in work groups on screenplays were undertaken (in a population of students from the Lausanne University). Hence, the main goal of these studies is to test the impact of the social ancoring of social representations in the responsibility processes in terms of legitimation or opposition to the group organization. All in all, the results show that social structures are powerfull predictors of the formation of social representations of a work situation and so forth of the attribution process. Nevertheless hegemonic ideological beliefs, such as Economical System Justification, do play a substantial moderating role in this process. It also proves to be evolving through time. The present findings show that a complexe process of socialization is occuring during the student?s university life. Indeed, the results let us believe that ideological beliefs may not interact anytime in the group?s perception and in the construction of the representation of the situation. In the same time, it seems that more discipline specific oriented knowledge and the impact of selection policy at the Lausanne University also predict the groupe legimation process and interfer with the ideological beliefs. Trying to articulate concepts of fields of research like social representations, attribution and socialization, the present thesis allows to underline the heuristic potential of reabilitating ideological beliefs at a dispositional level in the study of group process.

Fotossíntese de folhas de soja infectadas por Corynespora cassiicola e Erysiphe diffusa

A estimativa visual da severidade de doenças em plantas nem sempre se correlaciona com o efeito desta sobre a atividade fotossintética do hospedeiro. O objetivo do trabalho foi avaliar a interferência dos fungos Corynespora cassiicola e Erysiphe diffusa, causadores da mancha-alvo e do oídio na cultura da soja, respectivamente, na eficiência fotossintética de folhas infectadas. A fotossíntese foi relacionada com a área foliar doente por meio da equação Px/ Po=(1-x)β. Os parâmetros β (± erro padrão) estimados foram 2,78 (± 0,28) (p<0,05) para as folhas infectadas com C. cassiicola e 0,72 (±0,09) (p<0,05) e 0,77 (±0,15) (p=0,15) com E. diffusa, na primeira e segunda repetições. O valor obtido para C. cassiicola (β>1) indica que houve redução da eficiência fotossintética no tecido lesionado e em parte do tecido verde remanescente, enquanto que os valores obtidos para E. diffusa (β≤1) indicam que a estimativa visual da severidade da doença é um bom indicador do efeito do fungo na taxa fotossintética do hospedeiro.

Efeito de doses elevadas de vitamina D3 associada à suplementação de cálcio em modelo experimental de nefrolitíase

Introdução: Há poucos dados na literatura sobre a suplementação de vitamina D e cálcio e o desenvolvimento de cálculos renais. Objetivo: Avaliar o efeito de doses elevadas de vitamina D3 (V), com suplemento de cálcio (Ca) no desenvolvimento de litíase em modelo experimental. Métodos: Pastilhas foram inseridas na bexiga de ratos, que receberam V com ou sem Ca. Ratos foram divididos em seis grupos: 1. Sham; 2. Controle com pastilha, 3. Controle com V, 4. Pastilha + V, 5. Pastilha + Ca e 6. Pastilha + Ca + V. Resultados: Observou-se 50% e 17% de redução na formação de cálculos, respectivamente nos grupos 5 e 6 em comparação ao grupo 2 (p < 0,005). Não foram observadas hipercalcemia ou hipercalciúria em todos os grupos. Encontramos no grupo 6 (p = 0,03) uma redução significativa na calciúria. Conclusão: A administração de V associada com Ca diminuiu significantemente a formação de cálculos e reduziu significantemente a calciúria, sugerindo uma interferência benéfica na fisiopatologia litogênica.

Facteurs associés à l'alimentation traditionnelle au sein de trois communautés cries du Nord du Québec

Cette étude propose d’identifier les facteurs affectant la consommation d’aliments traditionnels à travers une perspective écologique, afin de réduire les taux de prévalence élevés de maladies chroniques et ralentir la forte diminution de consommation d’aliments traditionnels chez les Cris du nord québécois. Pour ce faire, une méthode mixte « sequential explanatory », fut utilisée, combinant quatre groupes focus (n=23) et une régression logistique (n=374) à partir de données secondaires issues de trois études transversales. Selon les résultats de la régression logistique: l’âge, chasser, marcher, le niveau d’éducation et la communauté de résidence étaient associées à une consommation d’aliments traditionnelle trois fois/semaine (p<0,05). Subséquemment, des groupes focus vinrent enrichir et contredire ces résultats. Par exemple : les participants étaient en désaccord avec le fait qu’il n’y avait aucune association entre les aliments traditionnels et l’emploi. Ils croyaient que les personnes sans emploi ont plus d’opportunités pour aller chasser mais peu d’argent pour couvrir les dépenses et inversement pour ceux avec emploi. Ce double effet aurait possiblement fait disparaître l’association dans la régression logistique. Suite aux groupes focus, plusieurs facteurs furent identifiés et distribués dans un modèle écologique suggérant que la consommation d’aliments traditionnels est principalement influencée par des facteurs sociaux, communautaires et environnementaux et ne se limite pas aux facteurs individuels. En conclusion, afin de promouvoir l’alimentation traditionnelle, quatre suggestions de priorités d’action sont proposées. L’alimentation traditionnelle doit faire partie des stratégies de santé publique pour réduire les taux de maladies chroniques et améliorer le bien-être des populations autochtones.

Estratégias para ajuste do ciclo vigília-sono de adolescentes aos horários escolares matutinos: a educação sobre o sono e a exposição a luz solar

In adolescents, who tend to sleep and wake-up later, the school schedule in the morning is associated with sleep advancement and shortening besides bedtime and wake-up time irregularity between week and weekend days. As a result, there is an increase in daytime sleepiness and a drop in cognitive performance that interfer in students performance in classroom. These consequences reinforce the need to evaluate alternatives that help the adolescent to adapt their sleep needs to the time of start of classes in the morning. Accordingly, the general aim of this study was to evaluate the effects of a sleep program education and sunlight exposure in early morning on sleep-wake cycle (SWC) and daytime sleepiness of adolescents. The students chronotype were evaluated by the Horne-Ostberg questionnaire and the health and usual sleep habits by "the health and the sleep questionnaire. The SWC patterns were assessed by sleep log, the daytime sleepiness by Karolinska Sleepiness Scale (KSS) and the alertness by the Psychomotor Vigilance Test (PVT). These parameters were compared before and after a sleep education program and before and during the sunlight exposure. The sleep program was effective in increasing sleep knowledge of adolescents, in promoting a reduction of bedtime and wake-up time irregularity and increasing the sleep duration in school days. The sunlight exposure effect was evaluated in the return to classes after vacation due to the difference in sleep patterns between school and vacation days. During the intervention week it was observed an advance of sleep schedules, an increase on sleep duration and alertness at the end of the morning. Assessed separately, sleep education and sunlight exposure should contribute to minimize adolescents partial sleep deprivation, but daytime sleepiness effect must be better investigated. These strategies should be used jointly by school members to improve health and performance of their students

Prevalência e aspectos epidemiológicos da leptospirose bovina em rebanho leiteiro na microrregião de Goiânia - GO

Foram colhidas 426 amostras de hemossoro bovino, provenientes de vacas em lactação na microrregião de Goiânia-GO, e testadas pelo método de soroaglutinação microscópica (SAM) para detecção de aglutininas antileptospiras, para efetuar um estudo de prevalência. Paralelamente, foi realizado um questionário epidemiológico, contendo informações que pudessem fornecer dados sobre a epidemiologia da leptospirose nessa região. Os resultados obtidos revelaram uma prevalência de 81,90% de animais reagentes. Os principais sorovares envolvidos foram: wolffi (36,10%), icterohaemorrhagiae (20,50%), hardjo (5,20%) e tarassovi (4,90%). A presença de ratos e suínos, a utilização de inseminação artificial e o tipo de fonte de água não interferiram no número de animais reagentes no teste de SAM. A leptospirose tem um comportamento enzoótico nessa região.

Autopercepção das condições de saúde bucal por idosos

OBJETIVO: Avaliar a autopercepção das condições de saúde bucal por idosos e analisar os fatores clínicos, subjetivos e sociodemográficos que interferem nessa percepção. MÉTODOS: Participaram do estudo 201 pessoas, dentadas, com 60 anos ou mais, funcionalmente independentes, que freqüentavam um centro de saúde localizado em Araraquara, SP, Brasil. Foi aplicado questionário com questões sobre as características sociodemográficas da amostra, a autopercepção da condição bucal e o índice Geriatric Oral Health Assessment Index (GOHAI). Realizou-se exame clínico para determinar a prevalência das principais doenças bucais. Foram usados testes estatísticos para determinar a associação das variáveis sociodemográficas e clínicas e do índice GOHAI com a autopercepção da condição bucal e a identificação dos preditores da auto-avaliação. RESULTADOS: O exame clínico revelou grande prevalência das principais doenças bucais, apesar de 42,7% das pessoas avaliarem sua condição bucal como regular. As variáveis associadas à auto-avaliação foram: classe social, índice de GOHAI, dentes cariados e indicados para extração. A análise multivariada mostrou que os preditores da auto-avaliação foram o GOHAI, os dentes com extração indicada e o índice Community Periodontal Index and Treatment Needs. Esses preditores explicaram 30% da variabilidade da auto-avaliação. CONCLUSÕES: Concluiu-se que a percepção da saúde bucal teve pouca influência nas condições clínicas, mostrando ser necessário desenvolver ações preventivas e educativas para a população.

Desenvolvimento de plantas de ervilha (Pisum sativum L.), submetidas à diferentes potenciais da água no solo: índices fisiológicos

A ervilha é cultivada no Brasil Central, durante o inverno seco, exigindo para o pleno êxito da cultura o uso da irrigação. Assim, o presente trabalho se propõe a avaliar os efeitos do potencial da água no solo nos índices fisiológicos da análise quantitativa de crescimento de plantas de ervilha (Pisum sativum L.). O experimento foi montado em casa de vegetação, em solos de textura argilosa, com delineamento experimental inteiramente casualizado, com quatro tratamentos decorrentes de potenciais mínimos da água no solo (-33, -100, -200 e -1500 kPa) em três repetições, cada qual contendo duas plantas de ervilha, cultivar Caprice. Os resultados obtidos evidenciaram que a redução do potencial água no solo, induziu o decréscimo na área foliar, sem interferir no comportamento da razão de massa foliar, razão de área foliar, taxa assimilatória líquida e taxa de crescimento relativo.

Efeito do celecoxib sobre o desenvolvimento de doença periodontal induzida em ratos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Manejo da irrigação por gotejamento, com diferentes níveis de salinidade da água, na cultura do melão

Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem) - FCA

A navegação regional como mecanismo de transformação da economia da borracha

Trata da transformação do mercado amazônico no século XIX, a partir da economia da borracha, tendo como teoria de base o sentido de transformação de mercado de Karl Polanyi – autor do clássico A grande transformação: as origens de nossa época, publicado em 1944. Trata-se, portanto, de um trabalho de história econômica com fundamentação teórica extraída da sociologia econômica. As transformações que estavam ocorrendo no mercado amazônico se delineavam em várias esferas – principalmente a partir da década de 1870, quando a economia regional passa a se inserir definitivamente no padrão de acumulação capitalista. Ocorreram transformações mercadológicas nos seringais do Pará (seringais dos rios Acará, Capim, Guamá e Moju, ilha do Marajó, rio Xingu e rio Tapajós – todos esses de fase pré-capitalista) até o Amazonas (seringais dos rios Solimões, Madeira, depois Purus e Juruá, no Acre – esses agora no estágio de economia capitalista), transformações no perfil da mão-de-obra dos seringais (dos tapuios aos imigrantes nordestinos), transformações na infra-estrutura das cidades, principalmente Belém e Manaus, e transformações no padrão das inversões de capital, principalmente de origem estrangeiro. A navegação regional (tanto tradicional dos barcos à vela, quanto das canoas e principalmente do barco a vapor) se insere neste contexto como um mecanismo eficaz, determinante, para essas transformações, ainda que ela mesma estivesse sendo transformada, também, pela economia da borracha – portanto, um movimento dialético. Sem a navegação a vapor não teria sido possível a realização da grande corrida rumo aos seringais da Região Amazônica como, também, sem a utilização das canoas, dificilmente se conseguiria avançar na imensa rede de igarapés, furos e lagos para abastecer o interior, as cidades e os próprios seringais. A navegação a vapor é o grande destaque do nosso trabalho, pois inserida na Amazônia, em 1853, pelo Visconde de Mauá, e fazendo parte da revolução tecnológica dos países desenvolvidos, passa ser o meio de transporte mais importante do comércio local – uma simples viagem de Manaus para Belém pela navegação a vela tradicional levava em média dois meses. Pelo barco a vapor o mesmo percurso se fazia em até 10 dias. A navegação a vapor introduziu a Amazônia no sentido concreto da revolução tecnológica, cultural e econômica dos países desenvolvidos. A empresa de navegação a vapor Amazon River, criada em 1912, foi o empreendimento mais inovador da economia da borracha e durante toda a primeira metade do século XX.

A exigibilidade judicial dos direitos sociais

A falta, de concretização de alguns direitos fundamentais, como os sociais de saúde e educação, que demandam certos custos para o Estado, ainda representa um desafio ao constitucionalismo brasileiro. Em decorrência, os tribunais vêm se deparando com demandas relacionadas a materialização dos referidos direitos, tais como pedidos de fornecimento de medicamentos não fornecidos pela rede pública de saúde ou a garantia de matrícula de estudante no sistema público de educação. Tratam-se assim de pedidos de ordens judiciais para que a administração pública cumpra seu dever constitucional, através de prestações positivas. Tal fenômeno, incluído por boa parte da doutrina dentro do que se convencionou chamar de "judicialização da política" não está isento à criticas. Em seu desfavor, argumenta-se que (1) o Judiciário está agredindo o princípio da separação de poderes, haja vista que a função administrativa, com sua discricionariedade, deve ser preservada com o Executivo não devendo na mesma se imiscuírem os magistrados, sendo-lhes defeso interferir em políticas publicas; (II) não há legitimidade democrática dos juízes, pois os mesmos não foram eleitos pelo povo; (III) o Judiciário não está preparado e tecnicamente capacitado para tal tipo de demanda; (IV) por envolver prestações positivas e assim necessidade de recursos públicos para a sua concretização, uma, determinação judicial nesse sentido contrariaria o princípio da legalidade e anterioridade orçamentária e encontraria sérios óbices em sua concretização pela reserva do possível. O presente estudo se propõe não só a analisar os referidos argumentos, como também examinar as fronteiras do sistema jurídico e do político, para concluir pela legitimidade ou não de tal conduta judicial, bem como a análise da natureza, do alegado caráter programático e da difícil delimitação dos direitos sociais e sua proteção judicial, ou seja, se procura, em síntese, examinar o papel do judiciário brasileiro no problema da efetivação dos direitos sociais, como garantidor do mínimo existencial.

Produção de vetores recombinantes para expressão de diferentes formas da proteína K1 do herpesvírus associado ao Sarcoma de Kaposi (KSHV)

Kaposi´s sarcoma associated herpesvirus (KSHV) or human herpesvirus 8 (HHV-8) is a gammaherpesvirus essential for the development of all forms of Kaposi´s sarcoma (KS). The KSHV’s life cycle is basically divided into latent and lytic phases, which have distinct viral gene expression profiles. Some important oncogenic products of KSHV are expressed during the lytic phase, including the viral K1 protein. As an effect of interfer-ence with intracellular signaling, K1 expression increases proliferation and survival of KSHV-infected cells. Due to its high level of genetic variability compared to other re-gions of the viral genome, the K1-encoding ORF (ORF-K1) is commonly evaluated for KSHV genotyping. It remains unclear whether different viral genotypes have particular biological effects that might modify the KSHV oncogenicity. The present study aimed to contribute to the establishment of an experimental in vitro model for evaluation of the K1 protein from common KSHV genotypes. Recombinant expression vectors with the ORF-K1 from KSHV genotypes A, B and C were prepared by genetic cloning. The recombi-nant vectors pKSHVOK1 obtained by cloning were sequenced for structural validation. After that, HEK293 cell line was transfected with the recombinant vectors, and proteins were extracted for expression analysis by Western blot technique, for K1 functional vali-dation. Results showed that ORF-K1 vectors containing KSHV ORF-K1 from the A, B and C genotypes were produced and structurally validated by DNA sequencing. The K1 expression at the protein level was also confirmed by immunoblots using an antibody for FLAG detection, an epitope from the vector that binds to K1. Based on presented re-sults, it´s possible to conclude that the recombinant vectors will be able to be used in future studies of K1 protein biological properties from distinct KSHV genotypes

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.