Taxonomia bacteriana - aspectos atuais e perspectivas.

Métodos genotípicos. Determinação da razão de bases do DNA (% em moles de G + C); Hibridação DNA-DNA (HDD); Estudos filogenéticos com base no gene ribossomal 16S; Métodos de caracterização baseados nos polimorfismos de DNA (tipagem molecular); Métodos fenotípicos; Delineamento de uma espécie; Técnicas atuais na taxonomia bacteriana: utilização da genômica na taxonomia bacteriana; Utilização da metodologia de "Multilocus Sequence Analysis" - MLSA; Utilização da espectrometria de massa na identificação e classificação bacteriana.

Caracterização do papel do gene bola: consequências na motilidade bacteriana e formação de biofilmes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

Peritonite bacteriana espontânea

A peritonite bacteriana espontânea ocorre em 30% dos cirróticos com ascite e, neste grupo, apresenta altas taxas de morbidade e mortalidade. Os fatores predisponentes incluem a diminuição da defesa imunológica encontrada no homem nas fases avançadas da cirrose, o supercrescimento da flora intestinal e a translocação bacteriana da luz dos intestinos aos linfonodos mesentéricos. As manifestações clínicas variam de graves a leves ou ausentes, sendo sempre necessária a análise do líquido ascítico. O diagnóstico de peritonite bacteriana espontânea se faz pela contagem de neutrófilos > 250/mm³ no líquido ascítico associado ou não ao crescimento de bactéria na cultura. As enterobactérias predominam como causa da infecção, sendo a Echerichia coli a bactéria mais freqüentemente isolada. O diagnóstico precoce e o tratamento adequado provocaram a queda das taxas de mortalidade nas duas últimas décadas. O uso endovenoso de cefalosporinas de terceira geração mostra-se eficaz em 70% a 95% dos casos. A recorrência de peritonite bacteriana espontânea é comum e pode ser prevenida com norfloxacina oral, de uso contínuo. O surgimento de resistência bacteriana tem estimulado a procura de novas opções para a profilaxia da peritonite bacteriana espontânea; os probióticos constituem nova abordagem promissora, mas que necessita melhor avaliação. Recomenda-se a profilaxia primária de curta duração aos cirróticos com ascite que apresentem episódio de hemorragia digestiva alta.

Importância do exame do liquor de controle em meningite bacteriana como critério de alta

Há controvérsias sobre indicação do exame do liquor de controle em pacientes recuperados clinicamente de meningite bacteriana como critério de cura. Alguns autores defendem alta hospitalar após normalização clínica e liqüórica, outros que a análise do liquor não se justifica em todos os pacientes. Esta série de casos com comparação de grupos investiga alterações no exame liqüórico de controle e avalia a importância do exame na decisão da alta. De 297 pacientes estudados, em 89,9%, o liquor de controle não mudou a intenção de alta (liquor resolutivo), já em 10,1% a alta foi suspensa (liquor não-resolutivo). Destes, o esquema antibiótico foi trocado em 30%. Entre as variáveis que pudessem ser preditivas de liquor não-resolutivo, à admissão, proteinorraquia maior que 100mg/dL (p=0,04) e glicorraquia menor ou igual a 20mg/dL (p=0,03) associaram-se a chance 2,5 vezes maior, podendo ser úteis como critérios para indicar exame do liquor como controle de cura para alta.

Contaminação bacteriana de estetoscópios das unidades de pediatria em um hospital universitário

A avaliação da contaminação, de estetoscópios utilizados em setores pediátricos de hospital e emergência, mostrou que 87% dos estetoscópios apresentaram diafragmas contaminados. O microrganismo mais freqüentemente isolado foi Staphylococcus coagulase negativo. A resistência aos antibióticos mostra que o estetoscópio deve ser considerado um importante veículo de bactérias resistentes aos antibióticos.

Infecção bacteriana na leishmaniose cutânea: padrão bacteriano e sensibilidade a antibióticos

Foi estudada a flora bacteriana em úlceras leishmanióticas, destacando-se o encontro das espécies aeróbicas Staphylococus aureus e Pseudomonas aeruginosa. O estudo da sensibilidade destas espécies a antibióticos mostrou sensibilidade à vancomicina, à amicacina e ao cloranfenicol em 100% dos isolados testados de Staphylococus aureus e à amicacina, à gentamicina e à tobramicina em 100% dos isolados testados de Pseudomonas aeruginosa. Estas espécies foram, em geral, resistentes às penicilinas e à tetraciclina.

Extração de DNA a partir de sangue humano coagulado para aplicação nas técnicas de genotipagem de antígenos leucocitários humanos e de receptores semelhantes à imunoglobulina

O objetivo deste estudo foi padronizar uma metodologia de extração de DNA de alta qualidade a partir de amostras de sangue coagulado. Quarenta e oito amostras de sangue humano coagulado foram utilizadas para a extração de DNA pelo kit comercial EZ-DNA® (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), pelo kit de coluna Neoscience® (One Lambda Inc., San Diego, CA) e pelo método modificado de salting out. Apenas o método de salting out foi capaz de extrair altas concentrações de DNA (média, 180ng/µL), as quais foram medidas pelo detector de fluorescência Qubit® (Invitrogen, USA). Este método permitiu a amplificação dos genes HLA (human leukocyte antigens) pela tecnologia PCR-SSO (polymerase chain reaction - specific sequence of oligonucleotides) Luminex, a qual exige DNA de boa qualidade, e de genes KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) pela técnica made in house PCR-SSP (polymerase chain reaction-sequence specific of primers), a qual demanda uma concentração específica de DNA (10ng/µL). Concluímos que a técnica de salting out modificada foi muito eficiente, simples e rápida para a extração de DNA de amostras de sangue humano coagulado, com o objetivo de realizar a genotipagem de genes HLA e KIR.

Hibridização reversa e sequenciamento na genotipagem do vírus da hepatite C

INTRODUÇÃO: Os métodos de genotipagem do vírus da hepatite C têm sido muito discutidos. O objetivo deste trabalho foi comparar as metodologias de hibridização reversa e sequenciamento direto para a genotipagem do vírus da hepatite C. MÉTODOS: Noventa e uma amostras de plasma de pacientes assistidos na Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade Estadual Paulista foram utilizadas. A genotipagem por hibridização reversa foi realizada utilizando o kit comercial INNO-LiPA® v.1.0. O sequenciamento direto foi efetuado em sequenciador automático utilizando protocolos in house. RESULTADOS: A genotipagem por sequenciamento direto mostrou-se eficiente na resolução dos resultados inconclusivos pelo kit comercial. O kit mostrou resultados errôneos em relação à subtipagem viral. Além disso, a genotipagem por sequenciamento direto revelou um erro do kit com relação à determinação genotípica questionando a eficiência do método também para a identificação do genótipo viral. CONCLUSÕES: A genotipagem realizada por meio de sequenciamento direto permite uma maior acurácia na classificação viral quando comparada à hibridização reversa.

Contaminação bacteriana em concentrados plaquetários: identificação, perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e sepse associada à transfusão

INTRODUÇÃO: Devido à sepse bacteriana associada à transfusão de concentrados plaquetários (CPs) ter sérias consequências clínicas para os pacientes, alguns procedimentos têm sido incorporados na preparação e no controle de qualidade dos componentes sanguíneos para reduzir o risco da contaminação bacteriana. Este artigo descreve a prevalência da contaminação bacteriana dos CPs que foram transfundidos, o espectro bacteriano detectado com seu perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e as reações transfusionais nos receptores. MÉTODOS: Um total de 292 CPs (278 randômicos e 14 por aférese), proveniente do Hemocentro do Estado do Rio Grande do Sul (HEMORGS) de Santa Maria foi testado. As quantidades de 100μL e 200μL foram coletadas da porção tubular da bolsa de plaquetas e semeadas utilizando dois tipos de metodologias. RESULTADOS: Em cinco unidades(1,7%; 5/292) foram isoladas bactérias pela metodologia qualitativa e apenas uma pela quantitativa. Staphylococcus epidermidis foi o microrganismo identificado em todas as amostras. Dois pacientes apresentaram sepse associada à transfusão com desfecho fatal. CONCLUSÕES: A contaminação bacteriana pelas transfusões de CPs constitui-se num importante problema de saúde pública devido a sua associação com altas taxas de morbidade e mortalidade. Neste estudo, somente microrganismos gram-positivos foram isolados sendo que nenhuma amostra obtida por aférese apresentou contaminação.

PROGRESSO NA SELEÇÃO DE PROGÊNIES DE TOMATE RESISTENTES À MURCHA BACTERIANA ATRAVÉS DA AVALIAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA DOENÇA

Dados obtidos em experimentos realizados durante a década 83/92 pelo Programa de Melhoramento Genético do Tomateiro foram utilizados para avaliar a eficiência da utilização do parâmetro epidemiológico Taxa de Infecçâo para seleção de progênies resistentes ao patógeno Pseudomonas solanacearum. Foram obtidas evidências que as progênies selecionadas de uma geração para a seguinte apresentaram níveis crescentes de resistência e maior capacidade produtiva sob condição de cultivo em solos infestados pelo patógeno, usando-se como padrões de susceptibilidade variedades do grupo Santa Cruz e de resistência a variedade Caraiba. A Taxa de Infecção consegue detectar elevado número de contrastes significativos quando comparada com outros parâmetros que não consideram a resistência como resultante de um processo na qual a expressão é modificada com o tempo.

Fontes de resistência à murcha bacteriana em germoplasma de Capsicum spp. do estado do Amazonas

A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, é uma das doenças mais importantes do gênero Capsicum no Brasil. No Amazonas, as condições de elevada temperatura e umidade favorecem o desenvolvimento da doença. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência à murcha bacteriana de germoplasma, selvagem e comercial, de Capsicum spp. Foram avaliados 22 acessos de Capsicum em casa de vegetação. A inoculação foi feita mediante ferimento das raízes, seguido de adição no solo, ao redor das plantas, de suspensão bacteriana na concentração de 10(8) ufc mL-1. A avaliação foi feita diariamente a partir do quarto dia após a inoculação, em função desenvolvimento dos sintomas. A partir das médias de progresso dos sintomas foi construída a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), e os dados submetidos ao teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade, utilizando o programa estatístico SAEG 9.1. Foram selecionados os acessos 30, 20 e 17, da espécie C. chinense, como resistentes à murcha bacteriana para ensaios futuros em programas de melhoramento genético.

Rol de la infección bacteriana en el desarrollo y progresión del cáncer prostático. Influence of bacterial infection in the development and progression of prostatitic cancer.

En la patogénesis del cáncer, factores microambientales como la inflamación están estrechamente vinculados al desarrollo y crecimiento tumoral, sustentando la clásica hipótesis de Virchow del origen del cáncer en sitios de inflamación crónica, la cual incitaría a carcinogénesis por múltiples factores. Estudios previos en este laboratorio evidenciaron en un modelo de prostatitis bacteriana agudo con E. coli, profundos cambios estromales semejantes al "estroma reactivo", con predominio de miofibroblasto, que se genera en el cáncer. En correlación, existe abundante evidencia obtenida en modelos experimentales animales confirmando que el microambiente estromal en el cual se desarrollan los tumores epiteliales influencia profundamente la progresión tumoral. El rol protagónico del estroma del huésped en el crecimiento neoplásico, también se ha demostrado inoculando la misma línea tumoral en diferentes tejidos y analizando su comportamiento en comparación con su implantación en el sitio anatómico original del tumor (implante ortotópico); otro factor clave en la repuesta del huésped al tumor está dado por el infiltrado de células inmunes que puede favorecer o limitar el crecimiento tumoral de acuerdo al perfil de citoquinas que secreten. Teniendo en cuenta estos antecedentes, este proyecto tiene como Objetivo General estudiar la influencia de la infección bacteriana crónica en la inducción y evolución del cáncer prostático. Para ello trabajaremos in vivo con dos formas de formas de Tumores Prostáticos, un Tumor Inducido por combinación del carcinógeno N-methyl-N-nitrosourea (MNU) y testosterona; el segundo mediante Transplante Ortotópico de células tumorales prostáticas MAT-LU. En ambos modelos se inducirá previamente una prostatitis bacteriana, a fin de estudiar los efectos de la prostatitis en la inducción del tumor en el primer modelo, y en la implantación de las células tumorales en el segundo. También se inducirá prostatitis después de establecido el tumor por ambos procedimientos, a fin de determinar si la prostatitis bacteriana modula la progresión neoplásica. Finalmente, proponemos un modelo in vitro que permita estudiar la interacción tumor/estroma separado de la influencia del sistema inmune. A tal fin se utilizarán co-cultivos combinando células tumorales con estromales modificadas de diferente modo. La Inducción de Tumores Prostáticos se realizará en ratas de la cepa Wistar adultas, en las cuales se inducirán lesiones displásicas y neoplásicas siguiendo protocolos de carcinogénesis prostática por MNU, para lo cual es necesario el tratamiento previo con acetato de ciprosterona y propionato de testosterona, seguido por administración crónica de testosterona. Los estudios con Transplante Ortotópico de células tumorales se realizarán en ratas Copenhagen. La influencia de la infección bacteriana en el desarrollo tumoral será investigada inyectando E. coli intraprostáticamente: Se realizará Análisis Macroscópico, de Parámetros Morfológicos de las lesiones tumorales, grado de malignidad, extensión e invasión de las lesiones de acuerdo a consensos internacionales, y Bioquímicos mediante análisis de la expresión, por IHQ y WB, de fosfatasa ácida, citoqueratina 8, Prostatic Binding Protein, PTEN (gen supresor tumoral) y el receptor de Andrógenos, todos parámetros de actividad y de transformación celular. También se evaluará apoptosis por TUNEL y proliferación celular. Los cambios del compartimiento estromal en respuesta al implante tumoral y la influencia de la inflamación bacteriana se evaluarán mediante análisis morfológico e inmunocitoquímico, caracterizando el fenotipo de las poblaciones celulares con a-actina, vimentina, calponina y tenascina. Se espera que los resultados aporten evidencias acerca de las interacciones bidireccionales entre células neoplásicas prostáticas y su entorno estromal, que en un futuro puedan servir como base para establecr estrategias para prevenir y/o modificar el crecimiento neoplásico.

Uso responsable de antimicrobianos: control de la resistencia bacteriana en los hatos caprinos de la provincia de Córdoba, a través de un sistema de vigilancia epidemiológico.

La provincia de Córdoba contempla dentro de sus prioridades productivas agropecuarias al sector caprino, para favorecer el desarrollo económico y social de la región. El control y tratamiento de las diferentes enfermedades es de vital importancia tanto para maximizar la producción del hato como para cumplir con las exigencias sanitarias. Este sector, no está exento al riesgo de resistencia bacteriana, fenómeno que se desarrolla cada vez con más frecuencia a nivel mundial, en animales y en el hombre. El seguimiento de este efecto a nivel regional, permitirá establecer medidas de control adecuadas y optimización del empleo de antimicrobianos. Proponemos establecer un sistema de vigilancia de resistencia bacteriana en cabras lecheras sanas y con mastitis, de la región norte cordobesa. En la población sana se procederá al aislamiento de E. coli intestinal porque es un microorganismo indicador de riesgo, y se considera un reservorio de genes de resistencia. Por otra parte, se considerarán con mastitis a las cabras con y sin presentación aparente de la enfermedad y aislamientos de estafilococos en la leche. Se utilizarán pruebas cuantitativas de susceptibilidad a diferentes antimicrobianos, obteniéndose valores de concentraciones inhibitorias mínimas (CIM). La vigilancia y el seguimiento de la resistencia a los antimicrobianos a través del valor de la CIM regional, son necesarios para observar la evolución de la resistencia, aportar datos para la realización de análisis de riesgos, proporcionar una base para formular recomendaciones sobre políticas de sanidad humana y animal, y aportar información para elaborar normas y recomendaciones de uso prudente.

USO RESPONSABLE DE ANTIMICROBIANOS: ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE VIGILANCIA DE RESISTENCIA BACTERIANA, EN LOS HATOS CAPRINOS DE LA PROVINCIA DE CÓRDOBA

La provincia de Córdoba contempla dentro de sus prioridades productivas agropecuarias al sector caprino, para favorecer el desarrollo económico y social de la región. El control y tratamiento de las diferentes enfermedades es de vital importancia tanto para maximizar la producción del hato como para cumplir con las exigencias sanitarias. Este sector, no está exento al riesgo de resistencia bacteriana, fenómeno que se desarrolla cada vez con más frecuencia a nivel mundial, en animales y en el hombre. El seguimiento de este efecto a nivel regional, permitirá establecer medidas de control adecuadas y optimización del empleo de agentes antimicrobianos. Proponemos establecer un sistema de vigilancia de resistencia bacteriana en cabras lecheras sanas y con mastitis, de la región norte cordobesa. En la población sana se procederá al aislamiento de E. coli intestinal porque es un microorganismo indicador de riesgo, y se considera un reservorio de genes de resistencia. Por otra parte, se considerarán con mastitis a las cabras con y sin presentación aparente de la enfermedad y aislamientos de estafilococos en la leche. Se utilizarán pruebas cuantitativas de susceptibilidad a diferentes antimicrobianos, obteniéndose valores de concentraciones inhibitorias mínimas (CIM). La vigilancia y el seguimiento de la resistencia a los antimicrobianos a través del valor de la CIM regional, son necesarios para observar la evolución de la resistencia, aportar datos para la realización de análisis de riesgos, proporcionar una base para formular recomendaciones sobre políticas de sanidad animal y humana, y aportar información para elaborar normas y recomendaciones de uso prudente.