Il cane come modello animale spontaneo di patologie neoplastiche dell'uomo: ene Ataxia-Telangiectasia Mutated (ATM) Nnella predisposizione al cancro ed importanza dei riarrangimanti genici dei geni Ig/TCR per la diagnosi e prognosi delle malattie linfoproliferative

“Naturally occurring cancers in pet dogs and humans share many features, including histological appearance, tumour genetics, molecular targets, biological behaviour and response to conventional therapies. Studying dogs with cancer is likely to provide a valuable perspective that is distinct from that generated by the study of human or rodent cancers alone. The value of this opportunity has been increasingly recognized in the field of cancer research for the identification of cancer-associated genes, the study of environmental risk factors, understanding tumour biology and progression, and, perhaps most importantly, the evaluation and development of novel cancer therapeutics”.(Paoloni and Khanna, 2008) In last years, the author has investigated some molecular features of cancer in dogs. The Thesis is articulated in two main sections. In section 1, the preliminary results of a research project aimed at investigating the role of somatic mutations of Ataxia-Telangiectasia mutated (ATM) gene in predisposing to cancer in boxer dogs, are presented. The canine boxer breed may be considered an unique opportunity to disclose the role of ATM somatic mutation since boxer dogs are known to be dramatically susceptible to cancer and since they may be considered a closed gene pool. Furthermore, dogs share with human the some environment. Overall, the abovementioned features could be considered extremely useful for our purposes. In the section 2, the results of our studies aimed at setting up accurate and sensitive molecular assays for diagnosing and assessing minimal residual disease in lymphoproliferative disorders of dogs, are presented. The results of those molecular assay may be directly translated in the field of Veterinary practice as well as the may be used to improve our objective evaluation of new investigational drugs effectiveness in canine cancer trials.

Profilo genomico e di espressione dell'Osteosarcoma. Identificazione dei geni con alto grado di correlazione tra numero di copie ed espressione

To identify the regions of recurrent copy number abnormality in osteosarcoma and their effect on gene expression, we performed an integrated genome-wide high-resolution array CGH (aCGH) and gene expression profiling analysis on 40 human OS tissues and 12 OS cell lines. This analysis identified several recurrent chromosome regions that contain genes that show a gene dosage effect on gene expression. A further search, performed on those genes that were over-expressed and localized in the frequently amplified chromosomal regions, greatly reduced the number of candidate genes while their characterization using gene ontology (GO) analysis suggests the importance of the deregulation of the G1-to-S phase in the development of the disease. We also identified frequent deletions on 3q in the vicinity of LSAMP and performed a fine mapping analysis of the breakpoints. We precisely mapped the breakpoints in several instances and demonstrated that the majority do not involve the LSAMP gene itself, and that they appear to form by a process of non-homologous end joining. In addition, aCGH analysis revealed frequent gains of IGF1R that were highly correlated with its protein level. Blockade of IGF1R in OS cell lines with high copy number gain led to growth inhibition suggesting that IGF1R may be a viable drug target in OS, particularly in patients with copy number driven overexpression of this receptor.

Evidenza del coinvolgimento di geni nell'insorgenza delle schisi labio-palatine

The CL/P are the most common and easily recognizable craniofacial malformations with a complex etiology that requires the involvement of genetic and environmental components. The analysis of the genetic component shows more than 14 loci and genes involved in the onset of the disease. I’ve selected and investigated some of the possible candidate genes for CL/P. MYH14 gene, that maps on chromosome 19, on the OFC3 locus, and shows a strong homology with MYH9 gene. I’ve also investigated TP63 and MID1 genes, that are responsible respectively for EEC syndrome and Opitz syndrome, both of them presenting cleft. I’ve also decided to investigate JAG2 because TP63 product regulates the this gene, and both of them are component of the Notch signalling pathway. I’ve, also, studied the MKX and LMO4 genes. MKX is an important development regulator that is highly expressed in palatal mesenchyme, and map in the region responsible for Twirler mutation that cause cleft in mouse. LMO4 is necessary for neural tube development and cooperating with Grhl3, promotes cellular migration during morphogenetic events like “in utero” cleft healing. Low folate levels and high levels of homocysteine increase the risk of cleft, genes involved in their metabolism may be of interest in cleft occurrence. I’ve decided to investigate BHMT and CBS genes coding for enzymes involved in homocysteine metabolism. I’ve also investigated BHMT2 gene that maps close to BHMT and presents with him a 73% of homology. I’ve performed a linkage analysis using SNPs mapping in the genes and their boundaries, for each gene, for MKX and LMO4 I’ve also performed a sequencing analysis. My results for MID1 and CBS genes support the hypothesis of a possible role of these genes in cleft. I’ve found borderline association values for JAG2, MKX and LMO4 genes.

Ruolo di interleuchina-33 sull'espressione di geni profibrotici e sull'ipertrofia dei miofibroblasti nella fibrosi intestinale

Background: Intestinal fibrosis is a serious complication of IBD, with more than a third of Crohn’s disease (CD) patients developing a fibrostenosing phenotype with formation of strictures that will require surgical intervention. Remarkably, SAMP1/YitFc (SAMP) mice, a spontaneous model of CD, develop gut fibrosis; similar to IBD patients, the pathophysiology of SAMP fibrosis is unknown. IL-33 is a member of the IL-1 cytokine family and increased expression is associated with IBD. Emerging evidence suggests its potential role in liver and cutaneous fibrosis, as well as myofibroblast-associated colonic ulcerations . Aim: The aim of this study was to evaluate the role of IL-33 as a potential mediator of profibrotic events leading to intestinal fibrosis and possible stricture formation. Methods: A detailed histologic time course study, with collagen-specific Masson trichrome staining and IHC for ST2 (IL-33 receptor), was performed on SAMP and control AKR (parental strain) mice. qRT-PCR was done on full-thickness ilea for the profibrogenic genes, collagen (coll)-1, coll-3, connective tissue growth factor (CTGF) and insulin-like growth factor 1 (IGF-1). Exogenous IL-33 (33 μg/kg, i.p.) or vehicle was administered daily for 7d to SAMP and AKR mice (N=6/exp group), and ileal tissues evaluated as above. Finally, microarray analysis was performed on full-thickness ilea from SAMP and AKR mice, and IL-33 stimulated subepithelial myofibroblasts (SEMFs). Results: SAMP mice displayed ileal skip lesions with randomly distributed strictures, preceded by typical pre-stricture dilations of the ileum. Ileal wall was visibly thickened with hypertrophy of the serosa, muscularis mucosa, muscularis propria, within which intense collagen deposition was observed, and inflammatory infiltrates in segments showing strictures. Interestingly, intense ST2 staining was present within the inflamed lamina propria of SAMP, notably localized to SEMFs. Fibrosis was first observed at 20 wks, and reached its peak by 50 wks of age. mRNA expression of coll-1 (4.74±0.69-fold; P=0.001), coll-3 (4.92±1.05-fold; P=0.01), IGF1 (12.9±3.45; P=0.006), and CTGF (3.29±0.69; P=0.004) was dramatically elevated in SAMP vs. AKR ilea. IL-33 treatment of AKR mice induced a marked increase in muscle fiber/myofibroblast cellularity and hypertrophy of the muscularis propria (4.13±0.74-fold; P<0.0001), and mRNA expression of coll-1 (5.16±0.89-fold; P=0.0009), coll-3 (1.97±0.14-fold; P=0.01), IGF-1 (9.32±2.27-fold; P=0.004), and CTGF (1.43±0.31-fold; P=0.006) vs. vehicle controls. Microarray data from SAMP ilea and IL-33-treated SEMFs confirmed these trends, displaying a global increase in profibrogenic gene expression. Conclusion: These data suggest an important role for IL-33 in intestinal fibrosis, and may represent a potential target for the treatment of IBD-associated fibrosis and stricture formation.

Analisi di “Copy Number Variants” ed identificazione di nuovi geni candidati per l’Autismo e Ritardo Mentale

I disturbi dello spettro autistico (DSA) ed il ritardo mentale (RM) sono caratterizzati da un’eziologia genetica complessa ed eterogenea. Grazie ai recenti sviluppi nella ricerca genomica, è stato possibile dimostrare il ruolo di numerose copy number variants (CNVs) nella patogenesi di questi disturbi, anche se nella maggior parte dei casi l’eziologia rimane ancora sconosciuta. Questo lavoro riguarda l’identificazione e la caratterizzazione dei CNVs in famiglie con DSA e RM. E’ stata studiata una microdelezione in 7q31 che coinvolge i geni IMMP2L e DOCK4, trasmessa dalla madre con dislessia a due figli con autismo ed una figlia con dislessia. Nella stessa famiglia segrega una seconda microdelezione in 2q14 che inattiva il gene CNTNAP5 ed è trasmessa dal padre (con tratti autistici) ai due figli con autismo. Abbiamo quindi ipotizzato che i geni DOCK4 e CNTNAP5 potessero essere implicati, rispettivamente, nella suscettibilità a dislessia e DSA. Lo screening di numerosi individui affetti ha supportato la nostra ipotesi, con l’identificazione di una nuova microdelezione di DOCK4 che segrega con la dislessia, e 3 nuove varianti missenso in CNTNAP5 in individui con autismo. Dall’analisi genomica comparativa su array (aCGH) di individui con RM, è stata identificata una delezione nella regione 7q31.32, che coinvolge il gene CADPS2, in due fratelli con RM e tratti autistici, probabilmente ereditata dalla madre. Lo screening di mutazione di questo gene in individui con autismo o RM, ha portato all’identificazione di 3 varianti non sinonime, assenti nei controlli, ed ereditate per via materna. Poiché CADPS2 risiede in una regione genomica che contiene loci soggetti ad imprinting, abbiamo ipotizzato che il gene CADPS2 possa essere anch’esso caratterizzato da imprinting, con espressione monoallelica materna. Lo studio di espressione di CADPS2 in cellule del sangue ha avvalorato questa ipotesi, implicando perciò CADPS2 come un nuovo gene di suscettibilità per il RM e DSA.

Espressione di geni correlati allo stress ossidativo nell'ascidia coloniale Botryllus schlosseri esposta a diverse condizioni ambientali nella Laguna di Venezia

I pattern di espressione genica permettono di valutare se gli organismi siano soggetti a stress ambientali, spesso associati a stress ossidativo e produzione di specie reattive dell’ossigeno, che possono essere analizzate per studiare gli effetti sub-letali indotti dall’ambiente negli organismi. Scopo di questa ricerca è stato valutare la possibilità di utilizzo dell’ascidia coloniale B. schlosseri come biomarker in ambiente lagunare. Le colonie, esposte a diverse condizioni ambientali nella Laguna di Venezia, sono state confrontate con esemplari allevati in condizioni di controllo. La ricerca si è concentrata in 2 siti con diverso grado di idrodinamicità e impatto antropico. Mentre nel sito 1, più vicino alla bocca di porto, si è rilevata la presenza di Tunicati, il sito 2 ne è privo. Il sito 2 ha registrato valori di pH e temperatura più alti. Inoltre, nel sito 2 è stata rilevata una mortalità maggiore delle colonie e alterazioni della morfologia nelle colonie sopravvissute. Ciò suggerisce che il sito 2 presenti condizioni avverse per B. schlosseri. Sui campioni di B. schlosseri sono state eseguite PCR semiquantitative per analizzare l’espressione di un gruppo di geni coinvolto nella risposta allo stress ossidativo: la glutammato cistein ligasi la glutatione sintetasi, 2 isoforme di glutatione perossidasi e la superossido dismutasi (SOD). Tutti i geni presentano livelli di trascrizione doppi nelle colonie del sito 1 rispetto al controllo. Viceversa, il sito 2 mostra livelli di espressione di poco superiori al controllo. Analisi spettrofotometriche evidenziano che le attività enzimatiche di SOD e catalasi sono più alte nel sito 2 rispetto al sito 1. Si può pertanto ipotizzare che le colonie esposte al sito 2 siano soggette a un maggiore stress. B. schlosseri appare dunque un buon indicatore dello stato ecologico dell’ambiente lagunare, entro parametri di pH e temperatura in cui abitualmente vive.

Studio di profili di espressione di geni coinvolti nello sviluppo larvale del Mitilo Mytilus galloprovincialis.

La presente ricerca si focalizza su alcuni processi chiave dello sviluppo larvale del mitili M. galloprovincialis: la biomineralizzazione, in quanto elemento fondamentale per la formazione della conchiglia; lo sviluppo ed il mantenimento della struttura cellulare, in quanto il progredire dello sviluppo comporta molteplici cambiamenti a tutti i livelli; la detossificazione, in quanto capace di fornire l’adeguata protezione. Lo studio ha visto l’impiego di tecniche molecolari (RT-qPCR) al fine di valutare l’espressione di geni codificanti per l’enzima anidrasi carbonica, la proteina extrapalliale, il recettore 5-HT1, la proteina actina, i trasportatori di membrana P-gp e Mrp, e gli enzimi catalasi e glutatione S-transferasi. È stata poi esaminata l’attività dell’enzima protein-chinasi A e si è caratterizzato il sistema MXR. Inoltre si è cercato di valutare il coinvolgimento di meccanismi cAMP/PKA-dipendenti nella regolazione dell’espressione di geni sopra menzionati. A tale scopo, sono stati utilizzati i composti farmaceutici propranololo e carbamazepina, che, da studi precedenti, sono noti interferire nella regolazione della via di trasduzione cAMP/PKA dipendente nel mitilo. I risultati di questa ricerca permettono di affermare che lo sviluppo larvale è un processo continuo in cui vi sono costanti cambiamenti fisiologici. L’espressione basale dei trascritti studiati ha mostrato evidenti variazioni nel tempo tra uova fertilizzate, trocofore e veliger, con un trend generale di sovraregolazione. E’ emerso anche che durante il suo sviluppo, il mitilo mediterraneo non presenta lo stesso tipo di regolazione della trascrizione riscontrabile nell’esemplare adulto. La modulazione dell’espressione da parte dei farmaci utilizzati ha comportato sovra- o sotto-espressione dei geni esaminati, indicando il possibile coinvolgimento di vie di regolazione della trascrizione affidate alla trasduzione del segnale neuroendocrino e del pathway cAMP/PKA dipendente