62 resultados para GDI
Resumo:
G-protein-signaling pathways convey extracellular signals inside the cells and regulate distinct physiological responses. This type of signaling pathways consists of three major components: G-protein-coupled receptors (GPCRs), heterotrimeric G proteins (G-proteins) and downstream effectors. Upon ligand binding, GPCRs activate heterotrimeric G proteins to initiate the signaling cascade. Dysfunction of GPCR signaling correlates with numerous diseases such as diabetes, nervous and immune system deficiency, and cancer. As the signaling switcher, G-proteins (Gs, Gq/11, G12/13, and Gi/o) have been an appealing topic of research for decades. A heterotrimeric G-protein is composed of three subunits, the guanine nucleotide associated a-subunit, and y subunits. In general, the duration of signaling is determined by the lifetime of activated (GTP bound) Ga subunits. Identification of novel communication partners of Ga subunits appears to be an attractive way to understand the machinery of GPCR signaling. In our lab, we mainly focus on Gao, which is abundantly expressed in the nervous system. Here we present two novel interacting partners of Drosophila Gao: Dhit and Kermit, identified through yeast two-hybrid screening and genetic screening respectively. Dhit is characterized by a small size with a conserved RGS domain and an N-terminal cysteine rich motif. The RGS domain possesses the GAP (GTPase activating protein) activity towards G proteins. However, we found that Dhit exerts not only the GAP activity but also the GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitor) activity towards Gao. The unexpected GDI activity is preserved in GAIP/RGS19 - a mammalian homologue of Dhit. Further experiments confirmed the GDI activity of Dhit and GAIP/RGS19 in Drosophila and mammalian cell models. Therefore, we propose that Dhit and its mammalian homologues modulate GPCR signaling by a double suppression of Ga subunits - suppression of their nucleotide exchange with GTP and acceleration of their hydrolysis of GTP. Kermit/GEPC was first identified as a binding partner of GAIP/RGS19 in a yeast two- hybrid screen. Instead of interacting with the Drosophila homologue of GAIP/RGS19 (Dhit), Kermit binds to Gao in vivo and in vitro. The functional consequence of Kermit/Gao interaction is the regulation of localization of Vang (one of the planar cell polarity core components) at the apical membrane. Overall, my work elaborated the action of Gao with its two interaction partners in Gao- mediated signaling pathway. Conceivably, the understanding of GPCR signaling including Gao and its regulators or effectors will ultimately shed light on future pharmaceutical research. - Les voies de signalisation mdies par les protines G transmettent des signaux extracellulaires l'intrieur des cellules pour rguler des rponses physiologiques distinctes. Cette voie de signalisation consiste en trois composants majeurs : les rcepteurs coupls aux protines G (GPCRs), les protines G htrotrimriques (G-proteins) et les effecteurs en aval. Suite la liaison du ligand, les GPCRs activent les protines G htrotrimriques qui initient la cascade de signalisation. Des dysfonctions dans la signalisation mdie par les GPCRs sont corrles avec de nombreuses maladies comme le diabte, des dficiences immunes et nerveuses, ainsi que le cancer. Puisque la voie de signalisation s'active et se dsactive, les protines G (Gs, Gq/11, G12/13 et Gi/o) ont t un sujet de recherche attrayant pendant des dcennies. Une protine G htrotrimrique est compose de trois sous-units, la sous-unit a associe au nuclotide guanine, ainsi que les sous-units et y. En gnral, la dure du signal est dtermine par le temps de demi-vie des sous-units Ga actives (Ga lies au GTP). Identifier de nouveaux partenaires de communication des sous-units Ga se rvle tre un moyen attractif de comprendre la machinerie de la signalisation par les GPCRs. Dans notre laboratoire nous nous sommes concentrs principalement sur Gao qui est exprime de manire abondante dans le systme nerveux. Nous prsentons ici deux nouveaux partenaires qui interagissent avec Gao chez la drosophile: Dhit et Kermit, qui ont t identifis respectivement par la mthode du yeast two-hybrid et par criblage gntique. Dhit est caractris par une petite taille, avec un domaine RGS conserv et un motif N- terminal riche en cystines. Le domaine RGS contient une activit GAP (GTPase activating protein) pour les protines G. Toutefois, nous avons dcouvert que Dhit exerce non seulement une activit GAP mais aussi une activit GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitor) l'gard de Gao. Cette activit GDI inattendue est prserve dans RGS19 - un homologue de Dhit chez les mammifres. Des expriences supplmentaires ont confirm l'activit GDI de Dhit et de RGS19 chez Drosophila melanogaster et les modles cellulaires mammifres. Par consquent, nous proposons que Dhit et ses homologues mammifres modulent la signalisation GPCR par une double suppression des sous-units Ga - suppression de leur nuclotide d'change avec le GTP et une acclration dans leur hydrolyse du GTP. Kermit/GIPC a t premirement identifi comme un partenaire de liaison de RGS19 dans le criblage par yeast two-hybrid. Au lieu d'interagir avec l'homologue chez la drosophile de RGS19 (Dhit), Kermit se lie Gao in vivo et in vitro. La consquence fonctionnelle de l'interaction Kermit/Gao est la rgulation de la localisation de Vang, un des composants essentiel de la polarit planaire cellulaire, la membrane apicale. Globalement, mon travail a dmontr l'action de Gao avec ses deux partenaires d'interaction dans la voie de signalisation mdie par Gao. La comprhension de la signalisation par les GPCRs incluant Gao et ses rgulateurs ou effecteurs aboutira mettre en lumire de futurs axes dans la recherche pharmacologique.
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Abstract: Asymmetric cell division is important to generate tissue diversity. The Caenorhabditis elegans embryo is well suited to study the mechanisms of asymmetric cell division. In wild type one-cell stage embryos, the spindle sets up along the anterior-posterior axis (AP). During anaphase, the spindle elongates. While the anterior spindle pole is relatively immobile, the posterior spindle pole moves towards the posterior cortex during anaphase leading to an asymmetric spindle position. As a result, the first cleavage gives rise to a large anterior blastomere and a smaller posterior one, which differs also in cell fate determinants. This posterior spindle displacement occurs in response to polarity cues set up along the AP axis by the PAR proteins and is due to imbalanced pulling forces acting on the two spindle poles, with net forces acting on the posterior spindle pole being more extensive than those at the anterior one. The project of my thesis was to characterize the involvement of two new components, gpr-1 and gpr-2, in spindle positioning. These genes encode essentially identical proteins containing a GoLoco motif characteristic of proteins interacting with α subunits of heterotrimeric G protein (Gα). In gpr-1/2(RNAi) embryos and in embryos lacking simultaneously two α subunits, goa-1 and gpa-16, (Ga(RNAi) embryos), there is a minimal posterior displacement of the spindle during anaphase, and the first division is equal. I found that the pulling forces acting on the two spindle poles is weak and equal in gpr-1/2(RNAi) and Gα (RNAi) embryos. I found that GPR-1/2 acts downstream of polarity cues for generation of pulling forces. Furthermore, I showed that GPR-1/2 distribution was enriched at the posterior cortex during metaphase whereas GOA-1 and GPA-16 were uniformly distributed at the cell cortex throughout the cell cycle. Gα subunits oscillate between GDP- and GTP-bound forms. Gα signaling is turned on by GDP/GTP exchange catalyzed by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and turned off by hydrolysis of GTP catalyzed by GTPase activating proteins (GAPs). A third class of proteins, the guanine dissociation inhibitors (GDIs), binds the GDP-bound form of Gα subunits and inhibits nucleotide exchange. I found that GPR-1/2 acts as a GDI for GOA-1. Taken together, my findings suggest a model in which differential activation of Gα subunits along the AP axis may translate into generation of differential pulling forces on the anterior and posterior spindle poles, and, thus, asymmetric cell division. Rsum L'embryon du nmatode Caenorhabditis elegans est un modle appropri pour tudier les mcanismes de la division asymtrique. Chez l'embryon prcoce, le fuseau mitotique se forme le long de l'axe antro-postrieur (A/P) et au centre de l'embryon, le ple antrieur restant relativement immobile alors que le ple postrieur du fuseau se dplace vers le cortex postrieur au cours de l'anaphase conduisant une position excentre du fuseau. 11 en rsulte une premire division qui gnre un blastomre antrieur et postrieur de grande et petite taille respectivement et qui diffrent en facteurs dveloppementaux. Ce dplacement postrieur se produit en rponse de la polarit tablie par la distribution polarise des protines PAR et est le rsultat de la gnration de forces ingales tirant sur les deux ples du fuseau, les forces agissant sur le ple postrieur du fuseau tant plus grandes. Le projet de ma thse tait d'identifier la fonction de deux nouveaux constituants, gpr-1 et gpr-2 dans le positionnement asymtrique du fuseau. Ces gnes codent essentiellement pour la mme protine qui contient un motif GoLoco, caractristique des protines interagissant avec la sous-unit alpha des protines G htrotrimriques. Chez l'embryon gpr-1/2(RNAi) et chez les embryons dpourvus d'activit de deux sous-units alpha, goa-1 et gpa-16, (Gα(RNAi)), j'ai montr qu'il y avait un dplacement minimal du fuseau vers le ple postrieur au cours de l'anaphase et la premire division est symtrique en raison de forces faibles et gales agissant sur les deux ples du fuseau. J'ai galement montr que gpr-1/2 tait requis en aval des signaux tablissant la polarit pour gnrer les forces responsables du positionnement asymtrique du fuseau. De plus, j'ai montr que GPR-1/2 tait enrichi au ple postrieur lors de la mtaphase alors que GOA-1 et GPA-16 taient localiss de faon uniforme au cortex de l'embryon prcoce. Gas oscillent entre une forme lie au GDP et une forme lie au GTP. La signalisation des Gas est active par l'change GDP/GTP qui est catalys par des protines GEFs. La signalisation des Gas est dsactive par l'hydrolyse du GTP qui est catalyse par des protines GAPs. Une troisime classe de protines, GDIs lie la forme GDP et inhibe l'change de nuclotides. J'ai montr que GPR-1/2 agissait comme un GDI pour GOA-1. Mes rsultats suggrent un modle dans lequel une activation diffrentielle des Gα le long de l'axe A/P pourrait gnrer des forces diffrentielles sur le ple antrieur et postrieur du fuseau.
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En sinscrivant dans la perspective du fminisme intersectionnelle et en mobilisant des mthodes mixtes, cette recherche tente de mieux comprendre la violence domestique envers les femmes au Mexique, la fois travers une analyse du discours des fministes mexicaines et dune analyse statistique multidimensionnelle de donnes denqute identifiant les facteurs institutionnels, conomiques et socioculturels associs au risque de vivre de la violence domestique. Cette thse se dmarque des rflexions fministes traditionnelles faites au Mexique puisquelle approche les rapports de genre en lien avec dautres systmes doppression et de subordination, fonds notamment sur les rapports de classe et lethnicit. Ainsi, elle apprhende la violence faite aux femmes en lien avec le patriarcat, sans rduire ce dernier quelques indicateurs sociodmographiques et comportementaux mesurs au niveau individuel, mais en tenant compte du contexte dingalit de genre au niveau rgional. Ce faisant, la recherche tente de rconcilier les deux grandes perspectives thoriques qui expliquent la violence conjugale, soit les approches de la violence familiale (qui sattardent des facteurs au niveau microsocial) et les approches fministes (qui mettent laccent sur la structure patriarcale, cest--dire le contexte plus large des ingalits de genre). Les rsultats des entretiens raliss avec des fministes reprsentant les trois branches du fminisme mexicain (fminisme hgmonique, populaire et autochtone) ont rvl les fractures existantes lintrieur du mouvement fministe au Mexique (antagonisme entre linstitutionnalisation et lautonomie du mouvement fministe). De faon gnrale, lanalyse des entretiens a montr que lengagement des fministes envers la cause des femmes est en accord avec les idaux types des trois branches du fminisme mexicain. Les fministes hgmoniques mettent surtout laccent sur la structure patriarcale de la socit mexicaine et sur les ingalits de genre lorsquil sagit de trouver des causes la violence faite aux femmes. Pour les fministes du secteur populaire, la violence faite aux femmes sexplique autant par les ingalits de genre, que par les effets du systme conomique capitaliste. Le discours des femmes autochtones semble, quant lui, tenir davantage compte de larticulation des rapports de genre, des rapports ethniques, ainsi que des rapports socio-conomiques. Nanmoins, nous constatons que les fministes de la branche hgmonique et populaire semblent de plus en plus sensibles lentrecroisement de systmes de domination et doppression. Par ailleurs, lanalyse multiniveau effectue partir des donnes de lEnqute nationale portant sur la dynamique des relations dans les mnages (2006), a rvl plusieurs rsultats importants qui mritent dtre souligns. Dabord on constate que les diffrences de prvalence des violences entre les municipalits mexicaines sont en grande partie expliques par leur composition sociale, cest--dire par des caractristiques des femmes et de leur couple (niveau micro), plutt que par des diffrences entre le niveau des ingalits de genre dans les municipalits mexicaines mesures par lISDH (Indice Sexospcifique du Dveloppement Humain). Les rsultats des analyses montrent que les femmes autochtones ont en gnral des taux de violences moins levs que les femmes mtisses (groupe majoritaire). Enfin, en ce qui a trait la relation entre le contexte dingalit de genre et la violence conjugale, les rsultats suggrent que plus lISDH dune municipalit est leve, plus il y a de femmes qui subissent les formes de violences. Cela va lencontre des postulats habituels des thories fministes et suggrent que les progrs rcents de la situation de la femme en matire de sant, dducation et de revenu nont pas boulevers les rapports de genre encore trs patriarcales qui continuent privilgier la suprmatie des hommes (Casique, 2004).
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Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)
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Ps-graduao em Biologia Geral e Aplicada - IBB
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Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP)
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Ps-graduao em Cirurgia Veterinria - FCAV
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Der Transferrin-Zyklus ist ein wichtiges Modell fr denintrazellulren Transport, daher sollten in der vorliegendenArbeit einzelne, immer noch unverstandene Prozesse desvesikulren, intrazellulren Transportes durch dieCharakterisierung einen in vitro-Transportassay untersuchtwerden. Der Ansatz eines in vitro-Systems wurde deshalbgewhlt, um mit Experimenten in denen einzelne Faktoren undbestimmte Konditionen untersucht werden sollten, diese unterdefinierten, reproduzierbaren Konditionen durchzufhren, diein einem in vivo-System kaum zu gewhrleisten sind. Ohne denEinfluss von strenden, weil unkontrollierten Faktoren,wie es bei in vivo-Systemen der Fall ist, konnte imvorliegende Ansatz der Transport zu immunisoliertenRecycling-Endosomen (die Isolierung erfolgte hierbei mitanti-Rab11-Antikrpern, einem Marker frRecycling-Endosomen) unter bestimmten Bedingungen untersuchtwerden. Dabei wurde als Marker Acridinium-markiertesTransferrin gewhlt, welches in Zellen internalisiert wurde.Die Spezifitt des Transportes in dem zellfreien System warhierbei sehr hoch, wie Kontrollexperimente inImmunisolierungsanstzen ohne Rab11-Antikrper zeigten. ImRahmen einer ersten Charakterisierung des Transportassayswurden essentielle, fr den in vivo-Transport essentielleParameter auch in den in vitro-Experimenten untersucht.Hierbei wurde zum einen der Faktor Temperatur gewhlt, daTransport in Zellen bei 4C in der Regel zum Erliegen kommt.Dies konnte auch in dem vorgestellten System gezeigt werden.Ein weiterer, essentieller Faktor ist Energie in Form vonATP. ATP-Depletion wurde in den Experimenten durch Hinzugabeeines ATP-erschpfenden Systems erzielt. Auch hier zeigteder Transport von Ac-Tfn zu Recycling-Endosomen eine starkeInhibierung. Mit Hilfe des so charakterisierten Assayskonnten anschlieend weitere Experimente durchgefhrtwerden, die den Einfluss von bestimmten Reagenzien undKonditionen auf den Transport untersuchten. So zeigte derTransport in Zeitverlaufsexperimenten einen Anstieg desTransportes bis 30 Minuten, bei 30 Minuten wurde ein Maximumerreicht. Nach Erreichen dieses Maximums war nachfolgendeine leichte Abnahme des Transfers von Ac-Tfn zu denRecycling-Endosomen zu beobachten. Da Rab-Proteine alsSchlsselregulatoren fr den intrazellulren, vesikulrenTransport gelten, und die Immunisolierungen mitanti-Rab11-Antikrpern durchgefhrt wurden, wurde somit auchder Einfluss dieser GTPasen auf das Transportsystemuntersucht. Zugegebenes GDI, welches in der Lage istRab-Proteine in GDP-gebundener Form von spezifischenMembranen zu extrahieren, und daher ein gut untersuchterInhibitor von Rab-Funktionen ist, konnte auch in diesemTransportassay den Transport von Transferrin inhibieren. Einweiterer Aspekt war die Rolle des Cytoskelettes imintrazellulren Transport. Da in frheren Untersuchungen(Trischler et al., 1999) Aktin auf Recycling-Endosomengefunden wurde, erfolgte in diesen Arbeiten eineKonzentration auf die Rolle des Aktin in diesenTransportprozessen. Durch die Zugabe von Cytochalasin D, daseinen Aufbau von Aktingersten verhindert, wurde derTransport ebenfalls inhibiert. Durchaffinittschromatographische Aufreinigungen konnte einestarke Interaktion von Aktin an immobilisiertes Rab11gezeigt werden. Die eluierten Fraktionen, die neben Aktinnoch weitere, jedoch unbekannte Proteine enthielten, konntenin dem in vitro-Fusionsassay eingesetzt werden und fhrtendort zu einer Stimulation des Transportes. Neben demgefundenen Aktin, knnten somit noch weitere, unbekannteProteine in dem Proteingemisch wichtige Funktionen imintrazellulren, vesikulren Transport bernehmen. EineIdentifizierung dieser Proteine ist dabei fr weiterfhrendeArbeiten essentiell.Caveolin-1, Markerprotein fr die Caveolae-Membrandomnewird berraschenderweise von verschiedenen Zellensekretiert. Da Caveolin-1 normalerweise ein integralesMembranprotein ist, wird von einer Sekretion alsLipoproteinpartikel ausgegangen. Die Rolle diesessekretierten Partikels ist unbekannt, wobei einige Autoreneine Funktion als autokrinen/ parakrinen Faktor vorschlagen(Tahir et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit solltendiese Partikel daher aufgereinigt und erstmalscharakterisiert werden. Die Partikel wurden aus transienttransfizierten LNCaP-Zellen gewonnen, die Cav-1 in dasserumfreie Medium abgaben. In einer erstenGrenuntersuchung durch FPLC konnte ein Molekulargewichtzwischen 2.000.000 Da und 660.000 Da bestimmt werden. DieseResultate konnten durch den Ansatz der nativenBlau-Gelelektrophorese besttigt werden. In einem weiterenAnsatz, der die Dichte der Partikel charakterisieren sollte,wurde in zwei unterschiedlichen Anstzen (CsCl-, sowieOptiprep Dichtezentrifuagtion) eine hnliche Dichte desPartikels wie HDL ermittelt. Um eine strkere Aufreinigungder Partikel zu erzielen, wurde eine Aufreinigung mit Hilfevon Ni-NTA-Agarose durchgefhrt. Dies war mglich, denn diebei der Transfektion verwendete C-DNA trug einen His6-tag.Die so aufgereingten Partikel verloren auch nach derNi-NTA-Chromatographie nicht ihre biochemischenEigenschaften, wie in berprfenden CsCl-Gradienten zu sehenwar. Die Partikel konnten anschlieend zum ersten Mal inelektronenmikroskopischen Aufnahmen (Negativkontrastierung)visualisiert werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es,zu untersuchen ob auf Cav-1 Lipoproteinpartikeln nochweitere Proteine zu finden waren. Durch eine kombinierteAufreinigung ber Ni-NTA Chromatographie undCsCl-Dichtezentrifugation und im Vergleich mit demAusgangsmaterial konnten in der Silberfrbung Proteinbandenerkannt werden, die wie Cav-1 in den Fraktionen angereichertvorlagen. Eine massenspektroskopische Identifikation einerder Banden ergab, dass es sich hierbei um nm 23(Nukleosid-diphosphat-kinase) handelte, einem Protein dasebenfalls von verschiedenen Tumoren sekretiert wird.
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In gasoline Port Fuel Injection (PFI) and Direct Injection (GDI) internal combustion engines, the liquid fuel might be injected into a gaseous ambient in a superheated state, resulting in flash boiling of the fuel. The importance to investigate and predict such a process is due to the influence it has on the liquid fuel atomization and vaporization and thus on combustion, with direct implications on engine performances and exhaust gas emissions. The topic of the present PhD research involves the numerical analysis of the behaviour of the superheated fuel during the injection process, in high pressure injection systems like the ones equipping GDI engines. Particular emphasis is on the investigation of the effects of the fuel superheating degree on atomization dynamics and spray characteristics. The present work is a look at the flash evaporation and flash boiling modeling, from an engineering point of view, addressed to keep the complex physics involved as simple as possible, however capturing the main characteristics of a superheated fuel injection.
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Il lavoro svolto durante questa tesi di dottorato pone le basi per lo sviluppo di nuove biotecnologie della micorrizazione di piante forestali con tartufi pregiati ed in particolare con Tuber magnatum. Durante questa tesi stato possibile isolare e mantenere in coltura pura il micelio di T. magnatum, ad ottenere e descrivere le sue micorrize e quelle di altri tartufi bianchi (T. oligospermum, T. borchii) e a seguire levoluzione del micelio nel suolo utilizzando la tecnica della real time PCR. Sono stati disegnati primer specie specifici in grado di identificare T. oligospermum ed stata verificata la possibilt di utilizzare questi primers in PCR multiplex con quelli specifici di T. magnatum e di T. borchii gi presenti in bibliografia, al fine di scovare sia frodi nella commercializzaione degli ascomi sia eventuali contaminazioni nelle piante micorrizate. Per migliorare lo sviluppo miceliare di tartufo abbiamo si cercato di migliorare il mezzo nutritivo per la crescita del micelio utilizzando: fonti di carbonio diverse, estratti radicali di nocciolo e singole frazioni separate dagli stessi. Infine sono stati sviluppati protocolli di crioconservazione per miceli di tartufo. Gli estratti radicali sono in grado di stimolare le crescita miceliare del tartufo modello T. borchii e dimodificarne la morfologia ifale. Questo risultati sono stati confermati anche dallaumento dellespressione di geni CDC42 e Rho-GDI, due geni legati alla crescita apicale polarizzata delle ife dei funghi filamentosi. Inoltre stato dimostrato che il mantenimento in coltura per numerosi anni dei miceli di tartufo provoca una perdita della capacit dinfettare le radici delle piante e quindi il loro potenziale utilizzo sia a scopo sperimentale sia a scopo colturale. Questo pone in risalto limportanza della conservazione a lungo termine del materiale biologico a disposizione ed stato dimostrato che la crioconservazione applicabile con successo anche alle specie del genere Tuber.
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Spray characterization under flash boiling conditions was investigated utilizing a symmetric multi-hole injector applicable to the gasoline direct injection (GDI) engine. Tests were performed in a constant volume combustion vessel using a high-speed schlieren and Mie scattering imaging systems. Four fuels including n-heptane, 100% ethanol, pure ethanol blended with 15% iso-octane by volume, and test grade E85 were considered in the study. Experimental conditions included various ambient pressure, fuel temperature, and fuel injection pressure. Visualization of the vaporizing spray development was acquired by utilizing schlieren and laser-based Mie scattering techniques. Time evolved spray tip penetration, spray angle, and the ratio of the vapor to liquid region were analyzed by utilizing digital image processing techniques in MATLAB. This research outlines spray characteristics at flash boiling and non-flash boiling conditions. At flash boiling conditions it was observed that individual plumes merge together, leading to significant contraction in spray angle as compared to non-flash boiling conditions. The results indicate that at flash boiling conditions, spray formation and expansion of vapor region is dependent on momentum exchange offered by the ambient gas. A relation between momentum exchange and liquid spray angle formed was also observed.
