Seleção de isolados de Verticillium lecanii para o controle de Cinara atlantica

O objetivo deste trabalho foi avaliar a patogenicidade de isolados de Verticillium lecanii, sobre Cinara atlantica, e estimar a CL50 do melhor isolado. No teste de seleção, utilizaram-se mudas de pinus com ninfas do pulgão, 20 isolados do fungo e um controle, num total de 21 tratamentos e dez repetições. Na CL50 do isolado CG 904, utilizaram-se seis concentrações, com dez repetições. VL 6, CG 902 e VL 2 apresentaram os mais altos índices de mortalidade, 72,22%, 67,34% e 67,31%, respectivamente. A testemunha apresentou mortalidade de 15,6%. Nos bioensaios de CL50, a concentração de 10(8) conídios mL-1 , do isolado CG 904, causou mortalidade de 100%, CL50 de 2x10(5) conídios mL-1 e TL50 de 4,4 dias.

Associação do óleo de mamona com Beauveria bassiana no controle da traça-das-crucíferas

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência, a estabilidade, a forma de aplicação e a compatibilidade do óleo de mamona com o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana no controle da traça-das-crucíferas, Plutella xylostella. No primeiro experimento, foram avaliadas a eficiência, a estabilidade após 70 dias de armazenamento e a forma de aplicação do óleo de mamona. No segundo experimento, foi avaliada a compatibilidade do óleo de mamona com B. bassiana. A atividade inseticida do óleo de mamona é instável ao longo do tempo. O óleo de mamona é compatível com B. bassiana no controle de P. xylostella.

Patogenicidade de Verticillium lecanii ao pulgão-do-pinus

Avaliou-se a patogenicidade do isolado IBCB 473 de Verticillium lecanii no pulgão-do-pinus Cinara atlantica (Hemiptera, Aphididae), inseto-praga em plantios de Pinus spp. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com cinco repetições por tratamento e cada repetição constituída de uma placa de Petri (9 cm de diâmetro) contendo 10 ninfas. Foram testadas suspensões de inóculo nas concentrações de 1,0 ' 10(6); 0,5 ' 10(7); 1,0 ' 10(7); 0,5 ' 10(8); e 1,0 ' 10(8) conídios/mL, pulverizando-se 1 mL sobre as ninfas. Como tratamento-testemunha, utilizou-se água esterilizada. As placas de Petri foram mantidas em câmara climatizada a 25 ± 1 °C, 70 ± 10% de UR e fotofase de 12 horas. As avaliações foram realizadas diariamente, anotando-se a mortalidade dos indivíduos de cada tratamento. A dose mais eficiente foi de 1,0 x 10(8) conídios/mL, causando mortalidade de 86,0% após cinco dias da pulverização. Os valores de TL50 das concentrações utilizadas foram de 5,82; 5,24; 4,60; 4,34; e 3,83 dias, respectivamente.

Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

Desempenho de Lecanicillium lecanii em meios de cultura contendo vitaminas e concentrações de extrato de levedura

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Sensibilidade de Metarhizium anisopliae à temperatura e umidade em três tipos de solos

Este trabalho teve como objetivo investigar o efeito da temperatura e do teor de umidade do solo na sobrevivência de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. em três tipos de solos. Foram utilizados o Latossolo Vermelho textura argilosa, Latossolo Vermelho textura média e Argissolo Vermelho Amarelo textura arenosa média. As temperaturas empregadas foram 21,5; 26,8 e 31,5°C, e os teores de umidade foram 35, 65 e 100% de saturação. A sobrevivência do fungo foi avaliada após zero, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 dias de incubação em cada temperatura estudada. Na análise do efeito do teor de umidade, a sobrevivência foi avaliada após zero, 14, 28, 42, 56, 70, 84, 98 e 112 dias de incubação à temperatura de 27,0±1,0°C. em ambos os ensaios, foi determinado o número de unidades formadores de colônias (UFC) em placa de Petri. Houve influência significativa da temperatura e do teor de umidade na sobrevivência do fungo. O maior crescimento e a maior sobrevivência ocorreram nas temperaturas de 21,5 e 26,8°C, enquanto que, no solo incubado a 31,5°C, o fungo cresceu pouco, e a população declinou rapidamente. No teor de 65% de umidade, houve rápido crescimento do fungo, mas no 112° dia foi observado um declínio da população nos três tipos de solos. Nos teores de 35 e 100% de umidade, o crescimento foi menor, mas obteve-se maior sobrevivência do fungo no solo.

Pathogenicity of Metarhizium anisopliae for Ceratitis capitata (Wied.) (Diptera: Tephritidae) in soil with different pesticides

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Crescimento e esporulação de isolados de Verticillium lecanii sob diferentes fatores ambientais

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Associação do óleo de mamona com Beauveria bassiana no controle da traça-das-crucíferas

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência, a estabilidade, a forma de aplicação e a compatibilidade do óleo de mamona com o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana no controle da traça-das-crucíferas, Plutella xylostella. No primeiro experimento, foram avaliadas a eficiência, a estabilidade após 70 dias de armazenamento e a forma de aplicação do óleo de mamona. No segundo experimento, foi avaliada a compatibilidade do óleo de mamona com B. bassiana. A atividade inseticida do óleo de mamona é instável ao longo do tempo. O óleo de mamona é compatível com B. bassiana no controle de P. xylostella.

Seleção de isolados de Beauveria bassiana potenciais para o controle da traça-das-crucíferas

A traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae), é considerada a principal praga das brássicas no mundo, sendo o uso de inseticidas o método mais usado para o seu controle. Assim, o objetivo desta pesquisa foi selecionar isolados de Beauveria bassiana com viabilidade para utilização no controle da traça-das-crucíferas. Dezessete isolados e um produto comercial de B. bassiana foram testados. Lagartas de segundo ínstar da traça-das-crucíferas foram pulverizadas com suspensão de conídios na concentração de 10(7) conídios mL-1. Para o bioensaio de concentração letal (CL) sete concentrações espaçadas em escala logarítmica foram testadas. Os isolados CCA/UFES-4, 18, 31 e 35 foram selecionados para o bioensaio de CL por causarem mortalidade confirmada superior a 90%. O isolado padrão ESALQ-447 e o produto comercial tiveram resultados semelhantes e também foram selecionados para o bioensaio de CL. Com base nas estimativas da CL50, os isolados CCA/UFES-4, 18, 31, ESALQ-447 e o produto comercial podem ser selecionados para utilização no controle da traça-das-crucíferas.

Mechanism of infection and colonization of Rhipicephalus sanguineus eggs by Mertarhizium anisopliae as revealed by scanning eletron microscopy and histopathology

O presente trabalho teve como objetivo verificar a forma de penetração do fungo Metarhizium anisopliae em ovos do carrapato Rhipicephalus sanguineus, assim como as lesões infringidas no interior do ovo. A aderência e penetração do fungo foram estudadas por meio da microscopia eletrônica de varredura e a ação do fungo nos tecidos internos avaliada em secções histológicas convencionais. Para observação destes eventos, realizaram-se infecções experimentais em 11 grupos de ovos do R. sanguineus contendo 25 mg cada. Os ovos foram banhados durante 3 minutos, sob agitação manual, em suspensão com concentração de 10(8) conídios/mL. Nos grupos controle o banho foi realizado apenas no veículo da suspensão. Os ovos foram processados para análise histopatológica e microscopia eletrônica de varredura nos seguintes tempos após a infecção: 1 e 18h, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, nove e onze dias. Observou-se grande germinação de conídios em 67% dos ovos 18h após a inoculação e o fungo penetrou em 92,6% dos ovos 5 dias após a infecção. A extrusão do patógeno ocorreu em 87% dos ovos 7 dias após a infecção, chegando a 100% no 9º dia. Nas análises histopatológicas não foram observadas lesões dignas de nota, porem deve-se ressaltar que houve significativa redução (53,9%) na eclosão a partir dos ovos infectados.

Patogenicidade de isolados de Beauveria bassiana para ovos, larvas e ninfas ingurgitadas de Rhipicephalus sanguineus

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Controle de larvas de Boophilus microplus por Metarhizium anisopliae em pastagens infestadas artificialmente

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Eventos externos e internos da infecção de larvas e ninfas de Rhipicephalus sanguineus por Metarhizium anisopliae

Examinaram-se a adesão, a germinação, a penetração e a colonização de larvas e ninfas de Rhipicephalus sanguineus por Metarhizium anisopliae, assim como as lesões infringidas pelo fungo nas respectivas fases do ciclo de vida do ácaro. Realizaram-se infecções experimentais em 11 grupos contendo 250 larvas e 11 grupos contendo 75 ninfas de R. sanguineus, por meio de banho, durante três minutos sob agitação manual, em suspensão contendo 10(8) conídios/ml do fungo. Nos grupos-controles, o banho foi realizado usando o veículo da suspensão. Larvas e ninfas foram processadas para um estudo histopatológico e de microscopia eletrônica de varredura nos seguintes tempos após a infecção: uma e 18 horas, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, nove e 11 dias. A germinação dos conídios ocorreu em até 18 horas pós-inoculação, e o fungo penetrou nas larvas e ninfas através do tegumento, dois e três dias após a infecção, respectivamente. Após penetração, o fungo invadiu o corpo das larvas e ninfas, promovendo uma colonização difusa, sem preferência aparente por tecidos específicos. Lesões significativas não foram observadas. A morte das larvas e ninfas ocorreu no terceiro e quarto dias pós-infecção, e a esporulação do patógeno sobre o cadáver foi iniciada no sexto dia pós-infecção.