Rôle de GPR40 dans la survie et la prolifération cellulaires induites par l’oléate dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de cancer de la prostate DU145

La relation entre l’obésité et le cancer, bien qu’établie par des études épidémiologiques, est peu connue. Pourtant, environ 25 % des cancers pourraient y être attribuables. Parmi les cancers reliés à l’obésité, les cancers du côlon, du sein chez les femmes ménopausées et de la prostate sont les plus fréquents. Des études sur modèles animaux ont suggéré une association positive entre une diète riche en gras et le développement du cancer mammaire et de la prostate. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras influencent le devenir de lignées de cellules cancéreuses du sein et de la prostate. Ces travaux ont montré que les acides gras insaturés, dont l’oléate, induisent la prolifération cellulaire tandis que les acides gras saturés, dont le palmitate, diminuent la prolifération. Un traitement à l’oléate stimule la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145 alors qu’un traitement au palmitate entraîne l’apoptose. Le mécanisme d’action de l’oléate sur la prolifération a été étudié de façon plus approfondie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de déterminer que l’effet prolifératif de l’oléate implique la voie PI3K/Akt, la voie ERK1/2 et l’activation d’un ou de plusieurs récepteur(s) couplé(s) aux protéines G (GPCR). L’oléate induit la phosphorylation rapide des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145. Au cours des dernières années, deux GPCRs ont été identifiés comme étant activables par des acides gras à moyennes et à longues chaînes, GPR40 et GPR120. GPR40 étant exprimé dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein et de la prostate contrairement à l’expression de GPR120 qui était inexistante dans la plupart des lignées, nous avons étudié l’implication de GPR40 dans l’effet prolifératif de l’oléate. Ces deux récepteurs n’étant pas exprimés dans les cellules épithéliales mammaires humaines en culture primaire, ces cellules ne répondent pas aux effets de l’oléate sur la prolifération et l’activation des voies de signalisation. L’activation des voies Akt et ERK1/2 par l’oléate dans les cellules MDA-MB-231 et DU145 est potentialisée par la surexpression du récepteur GPR40 et inhibée par l’utilisation d’un siRNA dirigé contre ce récepteur. Cependant, la prolifération induite par l’oléate ne semble pas affectée par la présence d’un siRNA dirigé contre GPR40. L’oléate étant un acide gras, il est capable d’entrer librement dans les cellules et une partie de ses effets sur la prolifération pourrait être attribuée à sa métabolisation. Un agoniste de GPR40, le GW9508, est en mesure d’activer GPR40 sans toutefois entrer dans les cellules ni activer le métabolisme de l’oléate. Le GW9508 stimule la phosphorylation des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145, mais il n’est pas en mesure d’induire la prolifération cellulaire comme le fait l’oléate. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le mécanisme d’action de l’oléate sur les cellules de cancer du sein et de la prostate. L’oléate induit la signalisation de GPR40 qui est impliquée dans l’activation rapide des voies de signalisation Akt et ERK1/2. De son côté, l’effet prolifératif induit par l’oléate s’effectue par un mécanisme GPR40-indépendant, possiblement lié au métabolisme de l’oléate.

Efficacité d’un traitement intra-­mammaire prolongé à base de ceftiofur (Spectramast®) pour les mammites cliniques chez les vaches laitières

Peu d’études ont exploré l’utilisation du traitement prolongé pour les mammites cliniques et aucune ne portait sur l’utilisation du traitement prolongé à base de ceftiofur pour le traitement des mammites cliniques légères à modérées. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’efficacité du traitement intra-mammaire prolongé à base de ceftiofur pour les mammites cliniques légères à modérées, en considérant toutes les bactéries responsables ou seulement Staphylococcus aureus (S. aureus) et les streptocoques. Des vaches laitières (n = 241) de 22 élevages du Québec et de l’Ontario ont été inclues. L’étude a été conçue comme un essai clinique à allocation aléatoire. Pour chaque cas de mammite clinique légère à modérée, 125 mg d’hydrochloride de ceftiofur (Spectramast® LC) a été administré par voie intra-mammaire une fois par jour pour 2 ou 8 jours. Le pourcentage de guérison clinique 21 jours après la fin du traitement était de 89% (n = 98/110 pour chaque groupe, p = 0,95). Les pourcentages de guérison bactériologique 21 jours après la fin du traitement pour les groupes 2 jours et 8 jours étaient 32% (n = 15/47) et 61% (n = 25/41) respectivement pour toutes les bactéries (p < 0,01); 64% (n = 9/14) et 82% (n = 9/11) respectivement pour les streptocoques (p = 0,50); et 0% (n = 0/20) et 47% (n = 9/19) pour S. aureus (p < 0,01). Il n'y avait pas de différence entre les 2 groupes pour les nouvelles infections intra-mammaires (p = 0,30). Le traitement prolongé à base de ceftiofur est un choix raisonnable pour le traitement des mammites cliniques légères à modérées, en particulier causées par S. aureus.

Antiproliferative effects of retinoic acid in breast cancer

Les rétinoïdes sont utilisés dans le traitement d’une variété de tumeurs malignes et lésions précancéreuses. Leurs effets dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs solides tel que le cancer du sein ont été étudiés extensivement. Cependant, les bénéfices dans le cancer du sein restent à date peu clairs. Ceci est probablement du à l’hétérogénéité des tumeurs mammaires et la réponse très variable aux effets antiprolifératifs de l’acide rétinoïque. Dans les lignées cellulaires cancéreuses mammaires, la réponse l’AR est fortement corrélée au niveau d’expression du récepteur aux estrogènes alpha (ERα), qui régule l’expression du gène qui encode le récepteur à l’acide rétinoïque alpha, RARA. Malgré cela, certaines lignées cellulaires ER-négatives, comme la lignée HER2-positive SK-BR-3, ont été décrites comme étant sensibles à l’AR. Dans le Chapter 2: de cette thèse, nous avons étudié les mécanismes de la signalisation ER-dépendante et ER-indépendante dans les cellules cancéreuses mammaires. Nous avons utilisé des lignées ER-négatives et ER-positives pour démontrer qu’une partie de la réponse à l’AR est indépendante de la signalisation par ER. Nous avons identifié plusieurs gènes cibles primaires de l’AR qui ont des effets similaires à l’AR quand ils sont surexprimés dans des cellules mammaires cancéreuses. Cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes complexes qui mènent à l’arrêt de croissance induit par l’AR dans les cellules cancéreuses mammaires. Dans le Chapitre 3, nous avons regardé plus en détails la signalisation ER-indépendante par l’AR dans des cellules ayant une amplification des gènes HER2 et RARA et nous avons identifié une synergie entre l’AR et le Herceptin dans ces cellules. Nous proposons que les gènes FOXO jouent une rôle dans cette synergie. Les cellules SK BR 3, ayant une coamplification HER2/RARA, pourraient représenter une classe de tumeurs qui pourraient bénéficier d’un traitement avec des rétinoïdes, en augmentent la réponse au Herceptin et potentiellement en réduisant la résistance au Herceptin. En conclusion, les données présentées dans cette thèse aident à mieux comprendre les mécanismes menant à l’arrêt de croissance induit par l’AR dans les cellules cancéreuses mammaires et fournissent une application potentielle pour l’utilisation de l’AR dans le traitement du cancer du sein.

Prédiction de boucles de régulation associant microARN et gènes régulés par le récepteur de l'acide rétinoïque dans le cancer du sein

Le récepteur de l'acide rétinoïque RAR est une protéine de la superfamille des récepteurs nucléaires liant le ligand acide rétinoïque (AR). En présence de son ligand, RAR induit la transcription de ses gènes cibles alors qu'en son absence la transcription est inhibée. Le mécanisme de régulation de RAR est altéré dans les lignées cellulaires humaines de carcinome mammaire dû à une baisse de capacité de synthèse de l'AR. Aussi, l'expression des microARN (miR) est perturbée dans le cancer du sein et un grand nombre de gènes ont été identifiés, après une analyse in-silico, comme des cibles prédites des miRs. Ces derniers peuvent être régulés pas des facteurs de transcription et ils sont capables d'inhiber la prolifération cellulaire et d'induire l'apoptose via la régulation de leurs cibles. Ainsi, les miRs peuvent jouer un rôle dans le mécanisme de régulation de RAR et être impliqués dans des boucles de régulation avec ce récepteur. Dans le cadre de ce travail, nous décrivons une approche développée pour prédire et caractériser des circuits de régulation au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel dans le cancer du sein. Nous nous sommes intéressés aux boucles de régulation de type feed-forward où RAR régule un miR et en commun ils régulent un ensemble de gènes codants pour des protéines dans les cellules tumorales mammaires MCF7 et SKBR3. Ces circuits ont été construits en combinant des données de ChIP-chip de RAR et des données de micro-puces d'ADN tout en utilisant des outils in-silico de prédiction des gènes cibles de miRs. Afin de proposer le modèle approprié de régulation, une analyse in-silico des éléments de réponse de l'AR (RARE) dans les promoteurs des miRs est réalisée. Cette étape permet de prédire si la régulation par RAR est directe ou indirecte. Les boucles ainsi prédites sont filtrées en se basant sur des données d'expression de miR existantes dans des bases de données et dans différentes lignées cellulaires, en vue d'éliminer les faux positifs. De plus, seuls les circuits pertinents sur le plan biologique et trouvés enrichis dans Gene Ontology sont retenus. Nous proposons également d'inférer l'activité des miRs afin d'orienter leur régulation par RAR. L'approche a réussi à identifier des boucles validées expérimentalement. Plusieurs circuits de régulation prédits semblent être impliqués dans divers aspects du développement de l'organisme, de la prolifération et de la différenciation cellulaire. De plus, nous avons pu valider que let-7a peut être induit par l'AR dans les MCF7.

Signalisation par les récepteurs des œstrogènes : mécanismes de reconnaissance de l’ADN et nouvelles approches pharmacologiques d’inhibition

Malgré les progrès des traitements des cancers du sein, ceux-ci demeurent la seconde cause de mortalité par cancer au Canada. Parmi les gènes associés aux cancers du sein, le récepteur des œstrogènes ERα est exprimé dans plus de 70% des tumeurs mammaires, qui prolifèrent en réponse aux œstrogènes, faisant de lui une cible de choix. ERα est un facteur de transcription ligand-dépendant, liant des éléments de réponse PuGGTCAnnnTGACCPy. Afin d’examiner la capacité des récepteurs nucléaires à reconnaitre de nouveaux motifs ADN, des mutants aux capacités de liaison modifiées ont été générés. Parmi les quatre résidus interagissant avec l’ADN, R211 ne peut pas être modifiée sans perdre complètement la liaison du récepteur à l’ADN. Néanmoins, les mutations combinées de plusieurs acides aminés contactant les bases de l’ERE ont généré des récepteurs capables de reconnaitre de nouveaux motifs, tout en conservant des niveaux de transactivation efficaces. L’utilisation potentielle des récepteurs nucléaires comme outils de thérapie génique hormono-dépendant, repose sur la prédiction des motifs de liaison efficaces. Étant donné son importance dans la carcinogenèse mammaire, ERα est une cible cruciale des thérapies anti-néoplastiques. L’anti-œstrogène total, ICI, induit la dégradation de ERα et l’arrêt de la croissance des cellules tumorales mammaires ERα-positives. De plus, la nouvelle drogue anti-tumorale HDACi, SAHA, module la voie de signalisation des œstrogènes et possède des propriétés prometteuses en association avec d’autres traitements anti-tumoraux. En effet, le co-traitement ICI et SAHA a un impact synergique sur l’inhibition de la prolifération des cellules mammaires tumorales ERα-positives. Cette synergie repose sur la coopération des effets de ICI et SAHA pour réduire les niveaux protéiques de ERα et bloquer la progression du cycle cellulaire via la modulation de la transcription des gènes cibles des œstrogènes. En fait, les fortes doses de HDACis masquent rapidement et complètement la signalisation transcriptionnelle des œstrogènes. De plus, les gènes cibles primaires des œstrogènes, contenant des EREs, présentent la même régulation transcriptionnelle en réponse aux fortes doses de SAHA ou du co-traitement, avec des doses utilisables en clinique de ICI et SAHA. En fait, ICI mime l’impact des fortes doses de SAHA, en dégradant ERα, potentialisant ainsi la répression de la transcription ERE-dépendante par SAHA. Finalement, la synergie des effets de ICI et SAHA pourrait augmenter l’efficacité des traitements des tumeurs mammaires.

Mécanismes d'action des antioestrogènes totaux

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant.

Étude fonctionnelle du couplage chimiokine-estrogène dans les tissus reproducteurs

Les estrogènes sont impliqués dans plusieurs aspects de la physiologie humaine en particulier, le développement, la croissance, la différenciation des tissus reproducteurs, la reproduction, et la grossesse. Les effets cellulaires des estrogènes sont transmis via l'interaction avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. L’activation de ERα et ERβ contrôle directement la transcription des gènes cibles nécessaires pour médier les effets physiologiques des estrogènes. L’effet des estrogènes peut aussi être mitogénique et devient la cause de plusieurs pathologies surtout dans les tissus qui présentent une sensibilité accrue à l’hormone tel que les tissus mammaires, les ovaires et l’utérus. De ce fait, une surexposition de ces tissus à l’estrogène augmente le risque de développer le cancer. Dans une lignée cellulaire qui coexprime les deux récepteurs, nous avons identifié la chimiokine SDF-1 qui interagit avec le récepteur CXCR4 et qui décrit une boucle de régulation autocrine/paracrine entre la voie des chimiokines et celle des estrogènes. Cette régulation induit une augmentation de l’expression des gènes cibles prolifératifs du cancer du sein. Cependant, les mécanismes exacts de cette régulation restent inconnus. Afin d'identifier les cibles exactes de cette régulation au niveau génomique, nous avons développé un modèle cellulaire pour discriminer le rôle respectif de ERα et ERβ au niveau du contrôle transcriptionnel de cette boucle de régulation des chimiokines. En partant d’une lignée cellulaire ER-, nous avons généré un système cellulaire qui exprime l’un ou l’autre des isoformes en plus du mutant ERβ-S87A. Nous avons construit le promoteur CXCR4bLuc qu’on a testé dans les lignées cellulaires générées. En utilisant la construction du promoteur CXCR4bLuc, nous avons démontré une voie de régulation des récepteurs des chimiokines par les récepteurs des estrogènes. L’activation membranaire de CXCR4 par SDF-1 implique l’activation directe du récepteur de l’estrogène ERβ par phosphorylation de la sérine 87. Cette phosphorylation active ERβ et favorise l’expression du gène de CXCR4. La transcription de CXCR4 passe par la liaison de ERβ au niveau d’un élément de liaison ERE que nous avons identifié dans ce travail par la technique de ChIP. Ainsi, nous avons identifié une cible exacte de la régulation des récepteurs des chimiokines CXCR4 par le récepteur des estrogènes ERβ qui peut constituer une approche prometteuse pour contrer les pathologies associées au cancer du sein et ses métastases.

Angiopoietine-like 2 : un facteur circulant pro-oxydant et pro-inflammatoire qui contribue au développement de l’athérosclérose

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs.

Étude sur les fonctions in vivo des GEFs DOCK chez les mammifères

Dock1 (aussi nommé Dock180) est le membre prototypique de la famille Dock d’activateurs des petites GTPases de la famille Rho. Dock1 agit au sein d’une voie de signalisation conservée au cours de l’évolution et des études génétiques ont démontré que les orthologues de Dock1, myoblast city (mbc) chez la drosophile et Ced-5 chez le nématode, activent Rac dans divers processus biologiques. Notamment, mbc est un important régulateur de la fusion des myoblastes lors de la formation des fibres musculaires de drosophile. Mbc est aussi essentiel à la migration collective d’un groupe de cellules, appelées cellules de bordures, lors de leur migration dans la chambre de l’oeuf suite à l’activation de récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). La migration collective des cellules de bordures récapitule certains des événements observés lorsque des cellules tumorales envahissent le tissu environnant lors de la formation de métastases. Chez les mammifères, des études réalisées en lignées cellulaires suggèrent que Dock1 est aussi un régulateur du cytosquelette lors de la migration cellulaire. De plus, certaines études ont démontré que la voie Dock1/Rac agit en aval de RTKs lors de l’invasion de cellules de glioblastome. Néanmoins, les fonctions in vivo de Dock1 chez les mammifères demeurent méconnues et le but de cette thèse est d’identifier et de caractériser certaines de ses fonctions. Guidés par la fonction de mbc, nous démontrons dans l’objectif no 1 un rôle essentiel pour ce gène au cours du développement embryonnaire grâce à la caractérisation d’une souris Dock1 knock-out. Des défauts sévères de fusion des myoblastes sont observés en absence de l’expression de Dock1 et ils contribuent à la réduction de la masse musculaire des souris mutantes. De plus, nous avons constaté une contribution du gène Dock5, un membre de la famille Dock proche de Dock1, au développement des fibres musculaires. Dans l’objectif no 2, nous avons observé que des hauts niveaux d’expression de DOCK1 corrèlent avec un mauvais pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein possédant une forte expression du gène codant pour le RTK HER2. Une surexpression ou une amplification du locus codant pour le récepteur HER2 est associée à près de 20% des cas de cancer du sein. Les cancers de ces patientes développent fréquemment des métastases et sont associés à un mauvais pronostic. Des études biochimiques ont révélé que DOCK1 interagit avec le récepteur HER2 dans des cellules de cancer du sein. De plus, DOCK1 est essentiel à l’activation de RAC et à la migration cellulaire induite par HER2 dans ces cellules. L’utilisation d’un modèle de cancer du sein médié par HER2 chez la souris combiné avec l’inactivation du gène Dock1 dans les glandes mammaires, nous a permis d’identifier Dock1 et Rac comme de nouveaux effecteurs de la croissance tumorale et de la formation de métastases régulées par l’oncogène HER2. Nous concluons que l’utilisation de différents modèles de souris knock-out pour le gène Dock1 nous a permis d’identifier des fonctions clés de ce gène. Tout comme son orthologue mbc, Dock1 joue un rôle important lors du développement embryonnaire en régulant notamment la fusion des myoblastes. Nos études ont également contribué à démontrer un important degré de conservation des mécanismes moléculaires de fusion entre les espèces. De plus, DOCK1 agit en aval du RTK HER2 et son expression dans les cellules épithéliales de glandes mammaires contribue au développement tumoral et à la formation de métastases induits par cet oncogène.

Development of a multi-gene PCR assay for the prediction of the response to hormone therapy in breast cancer

Deux tiers des cancers du sein expriment des récepteurs hormonaux ostrogéniques (tumeur ER-positive) et la croissance de ces tumeurs est stimulée par l’estrogène. Des traitements adjuvant avec des anti-estrogènes, tel que le Tamoxifen et les Inhibiteurs de l’Aromatase peuvent améliorer la survie des patientes atteinte de cancer du sein. Toutefois la thérapie hormonale n’est pas efficace dans toutes les tumeurs mammaires ER-positives. Les tumeurs peuvent présenter avec une résistance intrinsèque ou acquise au Tamoxifen. Présentement, c’est impossible de prédire quelle patiente va bénéficier ou non du Tamoxifen. Des études préliminaires du laboratoire de Dr. Mader, ont identifié le niveau d’expression de 20 gènes, qui peuvent prédire la réponse thérapeutique au Tamoxifen (survie sans récidive). Ces marqueurs, identifié en utilisant une analyse bioinformatique de bases de données publiques de profils d’expression des gènes, sont capables de discriminer quelles patientes vont mieux répondre au Tamoxifen. Le but principal de cette étude est de développer un outil de PCR qui peut évaluer le niveau d’expression de ces 20 gènes prédictif et de tester cette signature de 20 gènes dans une étude rétrospective, en utilisant des tumeurs de cancer du sein en bloc de paraffine, de patients avec une histoire médicale connue. Cet outil aurait donc un impact direct dans la pratique clinique. Des traitements futiles pourraient être éviter et l’indentification de tumeurs ER+ avec peu de chance de répondre à un traitement anti-estrogène amélioré. En conséquence, de la recherche plus appropriée pour les tumeurs résistantes au Tamoxifen, pourront se faire.

Régulation de l’activité transcriptionnelle des récepteurs des estrogènes (ER) par le récepteur à chimiokine CXCR4 et les récepteurs à activité tyrosine kinase ErbB2 et ErbB3

La régulation de la transcription des gènes par les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ joue un rôle important dans la croissance cellulaire et dans le développement du cancer du sein. Une augmentation de l’expression de CXCR4 et de son ligand SDF-1/CXCL12 corrèle avec un phénotype plus agressif du cancer du sein. Ici, nous démontrons un mécanisme de boucle de régulation positive entre la signalisation de CXCR4/SDF-1 et l’activité transcriptionnelle des ERs dans des cellules cancéreuses mammaires. L’activité transcriptionnelle de ER et l’expression de gènes cibles de ER, dont SDF-1 lui-même, sont augmentées dans la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 en réponse à SDF-1. Ces effets sont bloqués par l’anti-estrogène fulvestrant et par la délétion de CXCR4. Par ailleurs, l’expression des gènes et la prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 en réponse à l’estrogène sont altérées par l’inhibition de CXCR4. La signalisation par les facteurs de croissance joue un rôle important dans le cancer du sein. La surexpression et la dérégulation de la signalisation par le récepteur à activité tyrosine kinase ErbB2 corrèlent avec un phénotype tumoral mammaire plus agressif et un moins bon pronostic. Cependant, comment la signalisation de ErbB2 et de CXCR4 sont fonctionnellement reliées dans la régulation de la réponse de ER dans les cellules cancéreuses mammaires n’est pas connue. Nous démontrons ici que CXCR4 régule négativement l’expression protéique de ErbB2 et de son partenaire d’interaction ErbB3 ainsi que la phosphorylation de ErbB2. CXCR4 altère l’activation de la voie PI3-K/Akt par le dimère ErbB2/ErbB3 en réponse à héréguline alors qu’en présence de SDF-1, les niveaux d’activation sont récupérés. Nous avons trouvé que héréguline-β promouvoit la phosphorylation de la sérine 339 de CXCR4, un site important pour l’internalisation et la signalisation du récepteur. De plus, le recrutement de ErbB2 à CXCR4 est favorisé par ErbB3 et héréguline-β. L’activité transcriptionnelle ainsi que l’expression des gènes cibles de ER en réponse à l’héréguline sont relevées avec l’expression de CXCR4 et partiellement récupérées avec l’addition de SDF-1. Ces résultats démontrent que le recrutement de CXCR4 à ErbB2 altère la signalisation médiée par ErbB2/ErbB3 ainsi que l’activité hormonale de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. Nous travaux ont permis d’identifier et de caractériser l’impact de la signalisation médiée par des récepteurs membranaires sur la réponse transcriptionnelle de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. La signalisation membranaire est un facteur pouvant contribuer à la résistance aux thérapies endocriniennes et donc cibler les récepteurs impliqués s’avèrerait utile pour améliorer les traitements existants et mettre au point de nouvelles approches.

Quantitative ultrasound imaging during shear wave propagation for application related to breast cancer diagnosis

Dans le contexte de la caractérisation des tissus mammaires, on peut se demander ce que l’examen d’un attribut en échographie quantitative (« quantitative ultrasound » - QUS) d’un milieu diffusant (tel un tissu biologique mou) pendant la propagation d’une onde de cisaillement ajoute à son pouvoir discriminant. Ce travail présente une étude du comportement variable temporel de trois paramètres statistiques (l’intensité moyenne, le paramètre de structure et le paramètre de regroupement des diffuseurs) d’un modèle général pour l’enveloppe écho de l’onde ultrasonore rétrodiffusée (c.-à-d., la K-distribution homodyne) sous la propagation des ondes de cisaillement. Des ondes de cisaillement transitoires ont été générés en utilisant la mèthode d’ imagerie de cisaillement supersonique ( «supersonic shear imaging » - SSI) dans trois fantômes in-vitro macroscopiquement homogènes imitant le sein avec des propriétés mécaniques différentes, et deux fantômes ex-vivo hétérogénes avec tumeurs de souris incluses dans un milieu environnant d’agargélatine. Une comparaison de l’étendue des trois paramètres de la K-distribution homodyne avec et sans propagation d’ondes de cisaillement a montré que les paramètres étaient significativement (p < 0,001) affectès par la propagation d’ondes de cisaillement dans les expériences in-vitro et ex-vivo. Les résultats ont également démontré que la plage dynamique des paramétres statistiques au cours de la propagation des ondes de cisaillement peut aider à discriminer (avec p < 0,001) les trois fantômes homogènes in-vitro les uns des autres, ainsi que les tumeurs de souris de leur milieu environnant dans les fantômes hétérogénes ex-vivo. De plus, un modéle de régression linéaire a été appliqué pour corréler la plage de l’intensité moyenne sous la propagation des ondes de cisaillement avec l’amplitude maximale de déplacement du « speckle » ultrasonore. La régression linéaire obtenue a été significative : fantômes in vitro : R2 = 0.98, p < 0,001 ; tumeurs ex-vivo : R2 = 0,56, p = 0,013 ; milieu environnant ex-vivo : R2 = 0,59, p = 0,009. En revanche, la régression linéaire n’a pas été aussi significative entre l’intensité moyenne sans propagation d’ondes de cisaillement et les propriétés mécaniques du milieu : fantômes in vitro : R2 = 0,07, p = 0,328, tumeurs ex-vivo : R2 = 0,55, p = 0,022 ; milieu environnant ex-vivo : R2 = 0,45, p = 0,047. Cette nouvelle approche peut fournir des informations supplémentaires à l’échographie quantitative statistique traditionnellement réalisée dans un cadre statique (c.-à-d., sans propagation d’ondes de cisaillement), par exemple, dans le contexte de l’imagerie ultrasonore en vue de la classification du cancer du sein.

L’asymétrie mammaire chez les adolescentes présentant une scoliose idiopathique

La scoliose idiopathique de l’adolescence (SIA) est une déformation tridimensionnelle complexe du rachis affectant majoritairement les filles. L’atteinte progressive est surtout esthétique avec, notamment, une déformation de la cage thoracique résultante. L’asymétrie mammaire est une préoccupation fréquente chez ces jeunes filles. Se définissant comme une différence de forme, de position ou de volume des seins ou des complexes aréolo-mamelonnaires, l’asymétrie mammaire est courante chez les femmes, mais habituellement mineure et non visible. Il demeure incertain dans la littérature si l’asymétrie mammaire est plus fréquente chez les scoliotiques. De plus, très peu d’études ont évalué la relation entre la scoliose et l’asymétrie mammaire. De façon instinctive, on serait porté à croire que ce ne sont pas les seins qui sont asymétriques, mais plutôt la déformation du thorax en rotation qui donne cette impression. Les seins représentent un des organes les plus difficiles à mesurer étant donné leur grande variabilité. Plusieurs méthodes de mesure ont été décrites. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est considérée l’outil le plus précis pour définir la glande mammaire et plus particulièrement, sa délimitation sur la cage thoracique. Ce projet consiste à quantifier l’asymétrie mammaire, représentée par une différence de volume entre les deux seins, chez une cohorte de jeunes filles présentant une SIA significative, en utilisant l’IRM comme outil de mesure. Ensuite, une méthode de mesure automatisée, à partir de la topographie surfacique 3D, est proposée. Les résultats obtenus avec cette méthode sont confrontés à ceux de l’IRM. L’influence de la posture sur le volume mammaire est également étudiée à partir de ces deux modalités différentes. Pour réaliser ces objectifs, une cohorte de 30 patientes scoliotiques a été recrutée sur la base de leur courbure thoracique et de leur maturité osseuse et mammaire. Deux imageries de tronc ont été effectuées : la topographie surfacique 3D et la résonance magnétique. Dans un premier temps, la sommation des images segmentées acquises par IRM nous a permis de mesurer de façon très précise le volume mammaire. Notre cohorte présente une asymétrie mammaire moyenne statistiquement significative de 8.32%. 66.6% des patientes présentent une asymétrie ≥ 5%. Par ailleurs, le sein gauche est plus volumineux chez 65.5% des patientes. Une faible corrélation non-significative existe entre les volumes mammaires et l’angle de Cobb ainsi que la gibbosité thoracique. Par la suite, une méthode de mesure automatisée, développée à partir de l’environnement mathématique Matlab, est appliquée directement sur les reconstructions 3D. En bref, elle consiste à identifier les contours des seins pour les exciser afin d’exposer la cage thoracique puis, à soustraire le thorax complet du thorax sans seins pour déterminer les volumes mammaires. Les volumes mammaires acquis par la méthode automatisée sont, de manière attendue, de plus petites tailles que ceux obtenus à l’IRM. Une forte corrélation est établie entre les volumes mammaires obtenus par les deux différentes techniques de mesure. Bien que statistiquement significatives, les asymétries mammaires (r= 0.614, p< .001) ne sont pas aussi fortement corrélées entre elles que les volumes. Le sein droit (r=0.805) présente une corrélation plus élevée que le sein gauche (r=0.747). Finalement, l’influence de la posture est étudiée à partir des maillages 3D de l’IRM (décubitus ventral) et de la topographie surfacique 3D (position debout). D’excellentes corrélations sont confirmées entre les volumes mammaires ; r= 0.896 et r= 0.939, respectivement pour les volumes mammaires gauches et droits. Ce projet a permis de démontrer, pour la première fois, qu’il est possible de calculer le volume mammaire de façon objective et précise avec l’IRM, chez une cohorte scoliotique. Grâce à la précision des repères anatomiques, l’IRM nous a permis de revisiter une croyance populaire dans la communauté de la scoliose. Celle soutenant que l’asymétrie mammaire ressentie par les patientes n’est qu’une perception. Ces nouvelles données nous permettrons de conseiller les jeunes filles avec la SIA, concernant leurs préoccupations sur l’asymétrie de leurs seins. Nous avons confirmé que la méthode de mesure automatisée est réalisable cliniquement et pourrait être utilisée pour prédire les volumes obtenus à l’IRM. Par ailleurs, c’est le premier outil de mesure de volumétrie mammaire complètement automatisé à notre connaissance. Les volumes mammaires obtenus debout et en décubitus ventral sont comparables.

Study of nuclear receptor dynamics by BRET

Les récepteurs nucléaires (RN) sont des facteurs de transcription ligand dépendants qui contrôlent une grande variété de processus biologiques de la physiologie humaine, ce qui a fait d'eux des cibles pharmacologiques privilégiées pour de nombreuses maladies. L'un de ces récepteurs, le récepteur de l’œstrogène alpha (ERα), peut activer la prolifération cellulaire dans certaines sections de l'épithélium mammaire tandis qu’un autre, le récepteur de l'acide rétinoïque alpha (RARα), peut provoquer un arrêt de la croissance et la différenciation cellulaire. La signalisation de ces deux récepteurs peut être altérée dans le cancer du sein, contribuant à la tumorigénèse mammaire. L’activité d’ERα peut être bloquée par les anti-oestrogènes (AE) pour inhiber la prolifération des cellules tumorales mammaires. Par contre, l’activation des voies de RARα avec des rétinoïdes dans un contexte clinique a rencontré peu de succès. Ceci pourrait résulter du manque de spécificité des ligands testés pour RARα et/ou de leur activité seulement dans certains sous-types de tumeurs mammaires. Puisque les récepteurs nucléaires forment des homo- et hétéro-dimères, nous avons cherché à développer de nouveaux essais pharmacologiques pour étudier l'activité de complexes dimériques spécifiques, leur dynamique d’association et la structure quaternaire des récepteurs des œstrogènes. Nous décrivons ici une nouvelle technique FRET, surnommée BRET avec renforcement de fluorescence par transferts combinés (BRETFect), qui permet de détecter la formation de complexes de récepteurs nucléaires ternaires. Le BRETFect peut suivre l'activation des hétérodimères ERα-ERβ et met en évidence un mécanisme allostérique d'activation que chaque récepteur exerce sur son partenaire de dimérisation. L'utilisation de BRETFect en combinaison avec le PCA nous a permis d'observer la formation de multimères d’ERα fonctionnels dans des cellules vivantes pour la première fois. La formation de multimères est favorisée par les AE induisant la dégradation du récepteur des oestrogènes, ce qui pourrait contribuer à leurs propriétés spécifiques. Ces essais de BRET apportent une nette amélioration par rapport aux tests de vecteurs rapporteur luciférase classique, en fournissant des informations spécifiques aux récepteurs en temps réel sans aucune interférence par d'autres processus tels que la transcription et de la traduction. L'utilisation de ces tests nous a permis de caractériser les propriétés de modulation de l’activité des récepteurs nucléaires d’une nouvelle classe de molécules hybrides qui peuvent à la fois lier ERa ou RAR et inhiber les HDACs, conduisant au développement de nouvelles molécules prometteuses bifonctionnelles telles que la molécule hybride RAR-agoniste/HDACi TTNN-HA.

Identification and characterization of new biomarkers in aggressive subtypes of breast cancer

En 2015, la récidive tumorale et les métastases du cancer du sein demeurent une cause importante de décès à travers le monde. Toutefois, ces cancers sont souvent hétérogènes car en dépit d’un phénotype similaire, l’évolution clinique et la réponse au traitement peuvent varier considérablement. Il y a donc un intérêt évident à identifier et à caractériser de nouveaux biomarqueurs pour permettre classer les tumeurs mammaires dans des sous-groupes plus homogènes. Notre hypothèse est que chaque cancer mammaire possède des caractéristiques distinctes au plan des altérations du génome et des profils d’expression géniques et que ces changements se traduisent cliniquement par une prédisposition à former des métastases ou à répondre ou non à la chimiothérapie et aux thérapies ciblées. Dans le cadre de nos travaux, nous nous sommes intéressés aux sous-types agressifs de tumeurs mammaires et notamment les cancers de type triple négatif. Nous avons aussi tenté d’identifier des marqueurs capables de distinguer l’une de l’autre les tumeurs de type luminal A et luminal B. Pour ce faire, nous avons d’abord utilisé une stratégie in silico à partir de données publiques (micro-puces d’ADN et séquençage de l’ARN). Nous avons ensuite construit sept micro-matrices tissulaires (TMA) provenant de tissus mammaires normaux et tumoraux fixés à la formaline et enrobés en paraffine. Ces outils nous ont permis d’évaluer par immunohistochimie les niveaux d’expression différentielle des marqueurs suivants : ANXA1, MMP-9, DP103 et MCM2. Ceux-ci ont été comparés aux marqueurs usuels du cancer du sein (ER, PR, HER2, CK5/6 et FOXA1) et corrélés aux données cliniques (survie globale et métastase). Nos résultats indiquent que ces nouveaux marqueurs jouent un rôle important dans l’évolution clinique défavorable des tumeurs de haut grade. Dans un premier article nous avons montré que l’expression d’ANXA1 est dérégulée dans les cancers de type triple-négatif et aussi, dans une certaine mesure, dans les tumeurs HER2+. Nous croyons qu’ANXA1 permet de mieux comprendre le processus d’hétérogénéité tumorale et facilite l’identification des tumeurs de haut grade. Nous proposons également qu’ d’ANXA1 stimule la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la formation des métastases. Dans un second temps, nous avons montré que les niveaux d’expression de MMP-9 reflètent la différenciation cellulaire et corrèlent avec les sous-types de cancers mammaires ayant un mauvais pronostic. Nous estimons que MMP-9 permet de mieux comprendre et d’identifier les tumeurs mammaires à haut risque. De fait, la surexpression de MMP-9 est associée à une augmentation des métastases, une récidive précoce et une diminution de la survie globale. Dans le cadre d’un troisième article, nous avons montré que la surexpression du marqueur de prolifération MCM2 s’observe dans les cancers triple-négatifs, HER2+ et Luminal B par comparaison aux cancers luminal A (p< 0.0001). Nos résultats suggèrent qu’en utilisant un seuil de 40% de noyaux marqués, nous pourrions distinguer l’une de l’autre les tumeurs de type luminal A et luminal B. Cela dit, avant de pouvoir envisager l’utilisation de ce marqueur en clinique, une étude de validation sur une nouvelle cohorte de patientes s’impose. En somme, les résultats de nos travaux suggèrent qu’ANXA1, MMP-9 et MCM2 sont des marqueurs intéressants pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la progression tumorale et le développement des métastases. À terme, ces nouveaux marqueurs pourraient être utilisés seuls ou en combinaison avec d’autres gènes candidats pour permettre le développement de trousses « multigènes » ou d’essais protéomiques multiplex pour prédire l’évolution clinique des cancers mammaires.