A survey of congenital Chagas’ disease, carried out at three Health Institutions in São Paulo City, Brazil

The congenital transmission of Chagas’ disease was evaluated in 57 pregnant women with Chagas’ disease and their 58 offspring. The patients were selected from three Health Institutions in São Paulo City. The maternal clinical forms of Chagas’ disease were: indeterminate (47.4%), cardiac (43.8%) and digestive (8.8%); 55 were born in endemic areas and two in São Paulo City. The transmission of Chagas’ disease at fetal level was confirmed in three (5.17%) of the 58 cases studied and one probably case of congenital Chagas’ disease. Two infected infants were born to chagasic women with HIV infection and were diagnosed by parasitolological assays (microhematocrit, quantitative buffy coat-QBC or artificial xenodiagnosis). In both cases the placenta revealed T. cruzi and HIV p24 antigens detected by immunohistochemistry. In one case, a 14-week old abortus, the diagnosis of congenital T. cruzi infection was confirmed by immunohistochemistry. The other probable infection, a 30-week old stillborn, the parasites were found in the placenta and umbilical cord. The Western blot method using trypomastigote excreted/secreted antigens of T. cruzi (TESA) was positive for IgG antibodies in 54/55 newborns and for IgM in 1/55 newborns. One of the two newborns with circulating parasites had no detectable IgG or IgM antibodies. The assessment of IgG antibodies in the sera of pregnant women and their newborns was performed by ELISA using two different T. cruzi antigens: an alkaline extract of epimastigotes (EAE) and trypomastigote excreted/secreted antigens (TESA). The analysis showed a linear correlation between maternal and newborn IgG antibody titers at birth.

Life cycle of Trypanosoma cruzi (y strain) in mice

Since 1958, we have studied experimental Chagas' disease (CD) by subcutaneous inoculation of 1,000 blood forms of Trypanosoma cruzi (Y strain) in Balb/C. mice. Evolution of parasitemia remained constant, beginning on the 5th and 6th day of the disease, increasing progressively, achieving a maximum on about the 30th day. After another month, only a few forms were present, and they disappeared from the circulation after the third month, as determined from direct examination of slides and the use of a Neubauer Counting Chamber. These events coincided with the appearance of amastigote nests in the tissues (especially the cardiac ones), starting the first week, and following the Gauss parasitemia curve, but they were not in parallel until the chronic stage. In 1997, we began to note the following changes: Parasites appeared in the circulation during the first week and disappeared starting on the 7th day, and there was a coincident absence of the amastigote nests in the tissues. A careful study verified that young forms in the evolutionary cycle of T. cruzi (epi + amastigotes) began to appear alongside the trypomastigotes in the circulation on the 5th and 7th post-inoculation day. At the same time, rounded, oval, and spindle shapes were seen circulating through the capillaries and sinusoids of the tissues, principally of the hematopoietic organs. Stasis occurs because the diameter of the circulating parasites is greater than the vessels, and this makes them more visible. Examination of the sternal bone marrow revealed young cells with elongated forms and others truncated in the shape of a "C" occupying the internal surface of the blood cells that had empty central portions (erythrocytes?). We hypothesize that there could be a loss of virulence or mutation of the Y strain of Trypanosoma cruzi.

Efecto de las Fenotiazinas sobre la vitalidad del Trypanosoma cruzi

La Enfermedad de Chagas, causada por el Tripanosoma cruzi es una parasitosis ampliamente difundida en los países latinoamericanos, constituyendo una patología con un intrincado problema bioecológico y político social. Dado que existen sólo dos drogas tripanocidas aprobadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) efectivas durante la fase aguda de la enfermedad (Nifrutimox, Benznidasol) y con un alto nivel de toxicidad, es que resulta de imperiosa necesidad la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos que presenten menores riesgos y mayores beneficios para el paciente, así como para la quimioprofilaxis de la sangre a transfundir en zonas alejadas de centros de salud de complejidad. Hemos demostrado que algunas fenotiazinas, derivados tricíclicos y usados en la clínica psiquiátrica resultan letales sobre tripomastigotes y epimastigotes de T. cruzi, cepa Tulahuen, produciendo disrupción de membrana celular con liberación del contenido citoplasmático o disrupción de la mitocondria del parásito con la consiguiente alteración en la producción de ATP y la posterior muerte del mismo. Los ensayos "in vivo" han revelado ausencia o disminución de la parasitemia con importante sobrevida de los ratones infectados. El presente plan de trabajo tiene como objetivos: Continuar con los estudios de los efectos de derivados fenotiazínicos (Tioridazina) e iniciar el de otros compuestos (Propanolol), sobre la vitalidad del T. cruzi en diseños "in vitro" e "in vivo". El conocimiento de los mecanismos de acción de los compuestos señalados sobre la biología y composición química del parásito, así como sobre el huésped facilitará el hallazgo de potenciales agentes terapéuticos para la Enfermedad de Chagas experimental.

Antígenos y epitopes del Trypanosoma cruzi asociados con la evolución de la infección con este protozoario

Este proyecto se propone realizar un estudio de antígenos y epitopes del Trypanosoma cruzi comprometidos en la evolución de la infección con este protozoario. Se aprovechará la información obtenida anteriormente sobre protección y/o patogénesis inducida en ratón con antígenos acídicos liberados por las formas infectivas del parásito (tripomastigotes) designados exoantígenos (Eas) u obtenidos del citosol de epimastigotes, designados FIII y FIV. A los fines de avanzar en la identificación de epitopes comprometidos en los fenómenos estudiados, se realizarán en paralelo estudios con los antígenos mencionados y antígenos químicamente definidos que demostraron reactividad cruzada con ellos, como cruzipaína y péptidos sintéticos. El esquema experimental comprende, Tema 1: El estudio de la presencia de células mononucleares capaces de ser estimuladas por los distintos antígenos mencionados en pacientes con enfermedad de Chagas pertenecientes a diferentes grupos clínicos. Tema 2: El análisis, en ratones inmunizados, de la capacidad de los antígenos seleccionados para inducir respuestas inmunes humorales y celulares con efectos protectores o patogénicos. Se estudiará la especificidad de los anticuerpos y células inducidas por la inmunización. Se caracterizarán las poblaciones celulares según sus marcadores de membranas y las citoquinas liberadas en cultivo. Estudios histológicos e inmunocitoquímicos permitirán evaluar el daño tisular y las células comprometidas. Tema 3: Investigar la presencia de Cruzipaína entre los exoantígenos liberados por el parásito. La información obtenida, además de brindar conocimientos básicos en el tema y contribuir a la formación de recursos humanos, informará sobre el rol de los antígenos ensayados en la inmunomodulación hacia una respuesta protectora o patogénica.

Metabolismo de lípidos y fosforilación proteica en Trypanosoma cruzi: su relación con la respuesta celular

Se propone un estudio en Trypanosoma cruzi , de aquellos procesos celulares que conducen a determinadas respuestas fisiológicas después de estímulos acoplados a receptores, tal como ocurre en eucariotas superiores. Debido a que dicha respuesta puede implicar cambios transitorios en la composición lipídica y en la fosforilación de proteínas se pretende continuar con el proyecto iniciado anteriormente, para dilucidar algunos aspectos de la regulación del ciclo del inositol fosfato. Para ello se caracterizará funcionalmente el ciclo en formas epimastigotes del parásito y se determinará el compromiso de los fosfogliceridos (específicamente los fosfonositidos) y lípidos neutros (diacilglicerol) con la respuesta celular frente a carbacol y al péptido sintético (1-40) que posee residuos del extremo amino terminal de la alfa D-globina de pollo. Con el propósito de determinar el papel que juega el IP3 como segundo mensajero en T. cruzi y sus consecuencias en la señal de calcio intracelular se estudiará el origen del incremento del ion después de los estímulos extracelulares mencionados anteriormente.

Vacunación en la Enfermedad de Chagas experimental: estudio de mediadores involucrados en la protección en ratones y aplicación de la vacuna en perros. Vaccination in experimental Chagas'disease: study of intermediates involved in the protection of mice and application of the vaccine in dogs.

La Enfermedad de Chagas es una de las principales endemias de América Latina donde existen cerca de 18 millones de infectados y 90 millones en riesgo. Entre el 25 y el 30 por ciento desarrolla patología cardíaca o digestiva en el período crónico. Se ha postulado que mecanismos autoinmunes, sumados a la acción directa del parásito, podrían estar involucrados en la patogenia de la enfermedad. El desarrollo de vacunas tradicionales en Enfermedad de Chagas es una meta difícil de alcanzar, por lo cual parece más factible abordar estrategias basadas en la inmunomodulación, para disminuir la carga parasitaria, minimizar las acciones deletéreas en el periodo agudo y prevenir el desarrollo de patología en la etapa crónica. Para ello es necesario avanzar en el conocimiento de los mecanismos involucrados en la protección y en la patogenia. Si se acepta la hipótesis autoinmune, una estrategia de vacunación con un tripanosoma antigénicamente similar al T. cruzi pero no patógeno podría evitar posibles mecanismos autoagresivos. En nuestro Laboratorio se ha empleado un modelo de vacunación en ratones utilizando como inmunógeno el Trypanosoma rangeli, no patógeno en humanos. Los ratones vacunados, infectados con T. cruzi, mostraron buena respuesta inmune celular y humoral, bajas parasitemias, ausencia de lesiones histológicas, y sobrevida cercana al 100 por ciento. Los controles no vacunados tuvieron una elevada mortalidad. Debido al ciclo biológico del parásito, la defensa efectiva contra el T. cruzi requiere una potente respuesta de anticuerpos contra las formas extracelulares y una eficaz respuesta celular contra los amastigotes intracelulares. En el modelo desarrollado en nuestro laboratorio la protección se asocia con un adecuado equilibrio entre respuesta TH1 y TH2, con leve predominio TH1, disminución de citoquinas (Ck) proinflamatorias e incremento de receptores solubles de Ck. El esquema de inmunización demostró asimismo su eficacia en cobayos y en perros mantenidos en el Laboratorio. Hipótesis de trabajo: - La vacunación con T. rangeli desencadena mecanismos inmunomodulatorios que protegen de la infección con T. cruzi, entre los cuales se encuentran eventos que actúan tempranamente en el sitio de inoculación y en los que están involucradas células y moléculas del sistema inmune innato. - La vacunación a perros constituye una nueva herramienta en la lucha contra la Enfermedad de Chagas. Objetivos: i) profundizar el estudio tendiente a dilucidar los mecanismos involucrados en la resistencia inducida por la inmunización con T. rangeli en ratones; ii) estudiar el efecto que tiene el estrés físico de los ratones sobre la eficacia de la vacunación y iii) analizar la inmunogenicidad de la vacuna en perros de zonas endémicas para Enfermedad de Chagas. Material y metodos: Los ratones y perros serán vacunados con tres dosis de epimastigotes de T. rangeli, fijados con glutaraldehido y los controles solo recibirán PBS. Los ratones seran desafiados con T. cruzi. Se estudiará en liquido peritoneal: a) poblaciones celulares por Citometria de flujo; b) cuantificación de los distintos tipos de inmunoglobulinas, de citoquinas y sus receptores solubles, por ELISA, c) ON y arginasa, por técnicas colorimetricas; d) est.udio de la interacción macrófago-parásito y de receptores celulares por Inmunofluorescencia. e) En perros, se realizarán estudios parasitológicos (xenodiagnostico) y serológicos en vacunados y controles, 12 y 24 meses post vacunación. Resultados esperados e importancia del proyecto: se espera conocer los principales eventos tempranos que participan en la eliminación de los parásitos en los animales vacunados, el efecto del stress sobre la vacunación y asimismo, la inmunogenicidad de la vacuna en perros de campo. Todo ello permitirá obtener información sobre la eficacia de la vacunación experimental y podría aportar una herramienta adicional contra la Enfermedad de Chagas, interfiriendo en la cadena epidemiológica en áreas endémicas.

Metabolismo de fosfolípidos, señal de calcio y sus implicancias en la diferenciación de Trypanosoma cruzi. Phospholipids metabolism, calcium signal and its implications in the differentiation of Trypanosoma cruzi.

Trypanosoma cruzi es un protozoo primitivo agente causal de la enfermedad de Chagas. La transmisión de esta enfermedad depende tanto del desarrollo y de la diferenciación del microorganismo en el intestino del vector. Las diferentes formas del parásito se han adaptado a una serie de condiciones impuestas por los distintos ambientes en donde debió habitar. Esta capacidad de sobrevivir a medios externos tan variados está dada por la diversidad en las vías de transducción de señales en el parásito. T. cruzi se multiplica y diferencia (metaciclogénesis) en el recto de los triatominos. A este nivel, los parásitos se enfrentan a un incremento en la osmolaridad causado por un elevado contenido de NaCl en la orina. En nuestro laboratorio se observó que diferentes estímulos son capaces de producir incrementos en los niveles de IP3 y de Ca2+ intracelular, consecuencia de la activación del ciclo del inositol fosfato, y activación de fosfolipasa D (PLD) y fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K). En un medio carente de Na+ los epimastigotes estimulados con carbacol, mostraron una señal de calcio disminuida mientras que la acumulación de IP3 no se modificó. Además, esta señal se incrementó en presencia de PMA, activador de proteína quinasa C, mientras que la acumulación de IP3 se anuló completamente. Estos resultados indujeron a pensar en un mecanismo alternativo y/o paralelo a IP3 en la liberación de Ca2+, en el cual la presencia de un intercambiador Na+/H+ favorecería la liberación del ion desde organelas acídicas. Es conocido que la señal de calcio es requerida para la metaciclogénesis, y que esta señal es independiente del Ca2+ extracelular (Lammel y col. 1996, Marchesini y col., 2002). De este modo se propone que "los epimastigotes de T. cruzi utilizan como elementos conservados a lo largo de la evolución a los elementos del ciclo del inositol fosfato, uno de los sistemas de transducción de señales más antiguo, para responder a estímulos que inducen la diferenciación del parásito". Por lo tanto, para el desarrollo de este proyecto se propone determinar la presencia de un RcIP3 en epimastigotes y conocer su compromiso en la liberación de Ca2+ desde reservorios intracelulares. Además, establecer si un intercambiador Na+/H+ en membrana de acidocalcisomas estaría relacionado con la señal de calcio intracelular y su posible regulación por proteina quinasa C y A (PKC y PKA, respectivamente). Por otro lado, para dilucidar la implicancia de estos mecanismos en el proceso de metaciclogénesis, se propone estudiar la activación del intercambiador Na+/H+ y la señal de calcio en condiciones de hiperosmolaridad, tal como ocurre en el recto del triatomino. Ademas, ya que el proceso de diferenciación involucra una reorganización de los microtubulos del citoesqueleto se pretende estudiar el compromiso del metabolismo de fosfolípidos y tubulina en procesos que contribuyen a la inducción de la metaciclogenesis. El alcance de los objetivos mencionados ayudará a dilucidar la presencia de componentes tales como RcIP3 y el intercambiador Na+/H+ involucrados en la señalización del ion bivalente. Por otro lado, se espera demostrar que los isotipos de tubulina encontrados en T. cruzi cambien en cantidad relativa y nivel de expresión cuando los epimastigotes sean estimulados con posibles inductores de la diferenciación. Además, se espera observar simultáneamente un aumento en la actividad de dos enzimas relacionadas con la reorganización de microtúbulos: PI-3K y PLD. En tal caso, y para comprobar su implicancia en el proceso, se espera que la inhibición de tales enzimas sea capaz de revertir el efecto producido por los estímulos. Como la PLC se expresa principalmente en las forma epimastigotes mas que en los tripomastigotes (forma infectiva), la señal de Ca2+ inducida por IP3 se relacionaría con la capacidad del parásito para responder a ciertos cambios de pH y osmolaridad que enfrenta el microorganismo en el tracto digestivo del insecto vector.

Trypanosoma cruzi: vertebrate and invertebrate cycles in the same mammal host, the opossum Didelphis marsupialis

Epimastigotes multiplying extracellularly and metacyclic trypomastigotes, stages that correspond to the cycle of Trypanosoma cruzi in the intestinal lumen of its insect vector, were consistently found in the lumen of the anal glands of opossums Didelphis marsupialis inoculated subcutaneously with infective feces of triatomid bugs.

Anothor Trypanosoma, distinct from T. cruzi, multiplies in the lumen of the anal glands the opossum Didelphis marsupialis

Epimastigotes were found multiplying in the anal glands and in hemocultures of an opossum; rare metacyclics were seen in the cultures. The flagellate is possibly T. (Megatrypanum) freitasi Rego, Magalhães & Siqueira, 1957, but its final identification is still pending.

Morphological evidence by scanning electron microscopy of excretion of metacyclic forms of Trypanosoma cruzi in vector's urine

Comparision by scanning electron microscopy (SEM) of Trypanosoma cruzi flagellates attached to the cuticle of the rectal gland of infected Dipetalogaster maxima nymphs, showed marked differences before amd after feeding. Before feeding numerous metacyclic trypomastigotes were observed among the abundant epimastigotes that formed the carpet of flagellates. On the other hand, in insects that were allowed to urinate for 24 hours after a meal, the metacyclics were scarce,indicating that they had been detached by the urine flow. An asymetric type of cell division, probably originating both an epi-and a trypomastigote, was occasionally observed. The occurrence of swellings at different levels of the flagella of epimastigotes suggests that secondary sites of attachment may be common.

Trypanosoma cruzi: identification of specific epimastigote antigens by human immune sera

Soluble antigens from epimastigotes of Trypanosoma cruzi were analyzed by western blot in terms of their reactivity with sera from patients with Chagas' disease. In addition, sera from patients with visceral (AVL) and tegumentar leishmaniasis (ATL) were also tested in order to identify cross-reactivities with Trypanosoma cruzy antigens. Twenty eight polypeptides with molecular weights ranging from 14 kDa to 113 kDa were identified with sera from Chagas' disease patients. An extensive cross-reactivity was observed when sera from human visceral leishmaniasis were used, while only a slight cross-reaction was observed with sera from tegumentar leishmaniasis. On the other hand, 10 polypeptidesspecifically reacting with sera from Chagas' disease patients were identified. Among them, the antigens with molecular weights of 46 kDa and 25 kDa reacted with all sera teste and may be good candidates for specific immunodiagnosis of Chagas' disease.

Trypanosoma cruzi: serum antibody reactivity to the parasite antigens in susceptible and resistant mice

The specific antibody responses were compared among susceptible (A/Sn), moderately susceptible (Balb/c) and resistant (C57 BL/lOJ) mice infected with Trypanosoma cruzi (Y strain). Sera obtained during the second week of infection recognized a surface trypomastigote antigen of apparent Mr 80 kDa while displaying complex reactivity to surface epimastigote antigens. Complex trypomastigote antigens recognition was detected around the middle of the third week of infection. No major differences were observed along the infection, among the three strains of mice, neither in the patterns of surface antigen recognition by sera, nor in the titres of antibodies against blood trypomastigotes (lytic antibodies), tissue culture trypomastigotes or epimastigotes. On immunoblot analysis, however, IgG of the resistant strain displayed the most complex array of specificities against both trypo and epimastigote antigens, followed by the susceptible strain. IgM antibodies exhibited a more restricted antigen reactivity, in the three mouse strains studied. Balb/c sera (IgG and IgM) showed the least complex patterns of reactivity to antigens in the range of 30 kDa to 80 kDa. The onset of reactivity in the serum to trypomastigote surface antigens was also dependent on the parasite load to which the experimental animal was subjected.

Cell mediated immunity in Chagas' disease: Trypanosoma cruzi antigens induce suppression of the in vitro proliferative response of mononuclear cells

The partial suppression of the cell-mediated immune response by Trypanosoma cruzi antigens in patients with Chagas' disease is demonstrated in a costimulation assay with T. cruzi antigens and Mycobacterium tuberculosis purified protein derivative (PPD) or Tetanus toxoid (TT). ononuclear cells from 13 patients with chagasic infection without evidence of heart disease, 10 patients with chagasic cardiomyopathy and 7 healthy blood donors were stimulated with antigen A (autoclaved epimastigotes), PPD, TT, PPD + A, PPD + TT and TT + A. The average percentage of suppression induced by costimulation of mononuclear cells with PPD and antigen A was 47.1% in patients with chagasic infection without heart disease (INF), 38.8% in patients with chagasic cardiomyopathy (CDM) and 23.3% in healthy controls. Similar values were observed when living trypomastigotes were used. A costimulatory study with PPD and TT, PPD and A and TT and A was carried out in 8 patients with chagasic infection, in order to evaluate the possibility that this difference could be due to a nonspecific inhibitory effect. The mean suppression induced by TT + PPD was -8.9, with TT + A was 52.7 and with PPD + A was 50.1. The data reported show that T. cruzi antigens induce a specific suppression of the proliferative responseof mononuclear cells, that might be relevant to the persistence of the parasite in the host.

Crithidia ricardoi sp. n. a new species of trypanosomatidae isolated from Culex saltanensis Dyar, 1928 (Diptera: Culicidae)

A flagellte trypanosomatid was isolated in culture from the digestive tract of the mosquito Culex saltanensis Dyar, 1928. It grows exuberantly in liver infusion in the form of epimastigotes and choanomastigotes typical of the genus Crithidia. The trypanosomatid was compared to C. deanei, C. fasciculata, C. luciliae, C. oncopelti and C. guilhermei. The techniques used for comparison were electron transmission microscopy, isoenzymes and kDNA restriction profiles. No endosymbionts were found at electron microscopy. Results for the biochemical methods employd indicate that the trypanosomatid isolated from C. saltanensis is a new species of Crithidia. The name C. ricardoi sp. n. is proposed for thes new species.

Complete immunization against Trypanosoma cruzi verified in individual mice by complement-mediated lysis

Experimental systems to assay immunity against Trypanosoma cruzi usually demonstrate partial resistance without excluding the establishment of sub-patent infections in protected animals. To test whether Swiss mice immunized with attenuated parasites might develop complete resistance against virulent T. cruzi, experiments were performed involving challenge with low numbers of parasites, enhancement of local inflammation and the combination of natural and acquired resistance. Absence of infection was established after repeated negative parasitological tests (including xenodiagnosis and hemoculture), and lack of lytic antibody was tested by complement mediated lysis. Immunization with 10(7) attenuated epimastigotes conferred protection against the development of high levels of parasitemia after challenge with Tulahuen strain, but was unable to reduce the number of infected animals. However, when a strong, delayed-type hypersensitivity reaction was triggered at the site of infection by injecting a mixture of virulent and attenuated T. cruzi, a significant proportion of immunized animals remained totally free of virulent infection. The same result was obtained when the immunization experiment was performed in four month old Swiss mice, displaying a relatively high natural resistance and challenged with wild, vector-borne parasites. These experiments demonstrate that complete resistance against T. cruzi can be obtained in a significant proportion of animals, under conditions which replicate natural, vector delivered infection by the parasite.