Evaluation of serum- and animal protein-free media for the production of infectious bronchitis virus (M41) strain in a continuous cell line

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Messa a punto di sistemi per il controllo e la terapia delle malattie virali

A livello globale una delle problematiche più urgenti della sanità pubblica umana e veterinaria è rappresentata dal controllo delle infezioni virali. L’emergenza di nuove malattie, la veloce diffusione di patologie finora confinate ad alcune aree geografiche, lo sviluppo di resistenza dei patogeni alle terapie utilizzate e la mancanza di nuove molecole attive, sono gli aspetti che influiscono più negativamente livello socio-economico in tutto il mondo. Misure per limitare la diffusione delle infezioni virali prevedono strategie per prevenire e controllare le infezioni in soggetti a rischio . Lo scopo di questa tesi è stato quello di indagare il possibile utilizzo di prototipi virali utilizzati come modello di virus umani per valutare l’efficacia di due diversi metodi di controllo delle malattie virali: la rimozione mediante filtrazione di substrati liquidi e gli antivirali di sintesi e di origine naturale. Per quanto riguarda la rimozione di agenti virali da substrati liquidi, questa è considerata come requisito essenziale per garantire la sicurezza microbiologica non solo di acqua ad uso alimentare , ma anche dei prodotti utilizzati a scopo farmaceutico e medico. Le Autorità competenti quali WHO ed EMEA hanno redatto delle linee guida molto restrittive su qualità e sicurezza microbiologica dei prodotti biologici per garantire la rimozione di agenti virali che possono essere trasmessi con prodotti utilizzati a scopo terapeutico. Nell'industria biomedicale e farmaceutica c'è l'esigenza di una tecnologia che permetta la rimozione dei virus velocemente, in grande quantità, a costi contenuti, senza alterare le caratteristiche del prodotto finale . La collaborazione con l’azienda GVS (Zola Predosa, Italia) ha avuto come obiettivo lo studio di una tecnologia di filtrazione che permette la rimozione dei virus tramite membrane innovative e/o tessuti-non-tessuti funzionalizzati che sfruttano l’attrazione elettrostatica per ritenere ed asportare i virus contenuti in matrici liquide. Anche gli antivirali possono essere considerati validi mezzi per il controllo delle malattie infettive degli animali e nell’uomo quando la vaccinazione non è realizzabile come ad esempio in caso di scoppio improvviso di un focolaio o di un attacco bioterroristico. La scoperta degli antivirali è relativamente recente ed il loro utilizzo è attualmente limitato alla patologia umana, ma è in costante aumento l’interesse per questo gruppo di farmaci. Negli ultimi decenni si è evidenziata una crescente necessità di mettere a punto farmaci ad azione antivirale in grado di curare malattie ad alta letalità con elevato impatto socio-economico, per le quali non esiste ancora un’efficace profilassi vaccinale. Un interesse sempre maggiore viene rivolto agli animali e alle loro patologie spontanee, come modello di studio di analoghe malattie dell’uomo. L’utilizzo di farmaci ad azione antivirale in medicina veterinaria potrebbe contribuire a ridurre l’impatto economico delle malattie limitando, nel contempo, la disseminazione dei patogeni nell’ambiente e, di conseguenza, il rischio sanitario per altri animali e per l’uomo in caso di zoonosi. Le piante sono sempre state utilizzate dall’industria farmaceutica per l’isolamento dei composti attivi e circa il 40% dei farmaci moderni contengono principi d’origine naturale. Alla luce delle recenti emergenze sanitarie, i fitofarmaci sono stati considerati come una valida per migliorare la salute degli animali e la qualità dei prodotti da essi derivati. L’obiettivo del nostro studio è stato indagare l’attività antivirale in vitro di estratti naturali e di molecole di sintesi nei confronti di virus a RNA usando come prototipo il Canine Distemper Virus, modello di studio per virus a RNA a polarità negativa, filogeneticamente correlato al virus del morbillo umano. La scelta di questo virus è dipesa dal fatto che rispetto ai virus a DNA e ai retrovirus attualmente l’offerta di farmaci capaci di contrastare le infezioni da virus a RNA è molto limitata e legata a molecole datate con alti livelli di tossicità. Tra le infezioni emergenti causate da virus a RNA sono sicuramente da menzionare quelle provocate da arbovirus. Le encefaliti virali da arbovirus rappresentano una emergenza a livello globale ed attualmente non esiste una terapia specifica. Una delle molecole più promettenti in vitro per la terapia delle infezioni da arbovirus è la ribavirina (RBV) che, con il suo meccanismo d’azione pleiotropico, si presta ad essere ulteriormente studiata in vivo per la sua attività antivirale nei confronti delle infezioni da arbovirus. Uno dei fattori limitanti l’utilizzo in vivo di questa molecola è l’incapacità della molecola di oltrepassare la barriera emato-encefalica. Nel nostro studio abbiamo messo a punto una formulazione per la somministrazione endonasale di RBV e ne abbiamo indagato la diffusione dalla cavità nasale all’encefalo attraverso l’identificazione e quantificazione della molecola antivirale nei diversi comparti cerebrali . Infine è stato condotto un esperimento in vivo per valutare l’efficacia di un composto a base di semi di Neem, di cui sono già note le proprietà antimicrobiche, nei confronti dell’infezione da orf virus, una zoonosi a diffusione mondiale, che ha un elevato impatto economico in aree ad alta densità ovi-caprina e può provocare lesioni invalidanti anche nell’uomo.

Dati preliminari dello studio multicentrico caso-controllo "Grave danno epatico acuto indotto da farmaci"

Il danno epatico indotto dall'assunzione di farmaci viene comunemente indicato con il termine inglese DILI (Drug-Induced Liver Injury). Il paracetamolo rappresenta la causa più comune di DILI, seguito da antibiotici, FANS e farmaci antitubercolari. In particolare, i FANS sono una delle classi di farmaci maggiormente impiegate in terapia. Numerosi case report descrivono pazienti che hanno sviluppato danno epatico fatale durante il trattamento con FANS; molti di questi farmaci sono stati ritirati dal commercio in seguito a gravi reazioni avverse a carico del fegato. L'ultimo segnale di epatotossicità indotto da FANS è associato alla nimesulide; in alcuni paesi europei come la Finlandia, la Spagna e l'Irlanda, la nimesulide è stata sospesa dalla commercializzazione perché associata ad un'alta frequenza di epatotossicità. Sulla base dei dati disponibili fino a questo momento, l'Agenzia Europea dei Medicinali (EMA) ha recentemente concluso che i benefici del farmaco superano i rischi; un possibile aumento del rischio di epatotossicità associato a nimesulide rimane tuttavia una discussione aperta di cui ancora molto si dibatte. Tra le altre classi di farmaci che possono causare danno epatico acuto la cui incidenza tuttavia non è sempre ben definita sono gli antibiotici, quali amoxicillina e macrolidi, le statine e gli antidepressivi.Obiettivo dello studio è stato quello di determinare il rischio relativo di danno epatico indotto da farmaci con una prevalenza d'uso nella popolazione italiana maggiore o uguale al 6%. E’ stato disegnato uno studio caso controllo sviluppato intervistando pazienti ricoverati in reparti di diversi ospedali d’Italia. Il nostro studio ha messo in evidenza che il danno epatico da farmaci riguarda numerose classi farmacologiche e che la segnalazione di tali reazioni risulta essere statisticamente significativa per numerosi principi attivi. I dati preliminari hanno mostrato un valore di odds ratio significativo statisticamente per la nimesulide, i FANS, alcuni antibiotici come i macrolidi e il paracetamolo.

Effetto dei farmaci presenti in ambiente sulle larve di orata (Sparus aurata)

La presenza di residui dei farmaci ad uso umano e veterinario nelle acque superficiali è in costante aumento a causa del loro elevato consumo. L’impatto ambientale dei prodotti farmaceutici è riconosciuto in tutto il mondo ma attualmente ancora non sono presenti degli Standard di qualità ambientale per queste sostanze in ambiente acquatico. L’agenzia europea per i farmaci (EMEA) ha introdotto delle linee guida per la valutazione del rischio ambientale per tutti i nuovi farmaci prima di provvedere alla registrazione, ma in nessun caso la loro autorizzazione in commercio è vietata. Una volta assunti, i farmaci sono escreti dagli organismi in forma nativa o come metaboliti, e attraverso gli scarichi urbani raggiungono i depuratori che li rimuovono solo in parte. Di conseguenza, i residui dei farmaci vengono ritrovati nei fiumi, nei laghi, fino alle acque marine costiere. Anche se presenti a basse concentrazioni (ng-μg/L) nelle acque superficiali, i farmaci possono provocare effetti avversi negli organismi acquatici. Queste specie rappresentano involontari bersagli. Tuttavia molti di essi possiedono molecole target simili a quelle dell’uomo, con i quali i farmaci interagiscono per indurre gli effetti terapeutici; in questo caso i farmaci ambientali possono causare effetti specifici ma indesiderati sulla fisiologia degli animali acquatici. Le interazioni possono essere anche non specifiche perché dovute agli effetti collaterali dei farmaci, ad esempio effetti ossidativi, con potenziali conseguenze negative su vertebrati ed invertebrati. In questo lavoro sono stati valutati i potenziali effetti indotti nelle larve di orata da quattro classi di farmaci ovvero: carbamazepina (antiepilettico), ibuprofene (antinfiammatorio non steroideo), caffeina (stimolante) e novobiocina (antibiotico). In particolare, in questo lavoro si è valutato inizialmente il tasso di sopravvivenza delle larve di orata esposte ai farmaci, per verificare se l’esposizione determinasse effetti di tossicità acuta; successivamente si è passati alla valutazione di due biomarker : il danno al DNA e la perossidazione lipidica per verificare la presenza di effetti tossici sub-letali. Le larve sono state esposte per 96 ore alle concentrazioni di 0.1, 1 (MEC), 10 e 50 µg/L (>MEC) di carbamazepina e novobiocina, a 0.1, 5 (MEC),10 e 50 µg/L (> MEC) di ibuprofene ed a 0.1, 5 (MEC),15 e 50 µg/L (> MEC) di caffeina, rappresentative delle concentrazioni riscontrate in ambiente acquatico e al di sopra di quest’ultimo. L’analisi dei dati sulla sopravvivenza ha dimostrato che la carbamazepina, l’ibuprofene, la novobiocina e la caffeina non hanno effetti significativi alle concentrazioni testate. La valutazione dei biomarker ha evidenziato un generale decremento significativo dei livelli di danno primario al DNA e per la perossidazione lipidica è stato generalmente osservato un decremento alle dosi dei farmaci più basse, seguito da un aumento a quelle più elevate. Nell’insieme i dati indicano che alle concentrazioni testate, i farmaci carbamazepina, caffeina, ibuprofene e novobiocina non hanno prodotto alterazioni attribuibili alla comparsa di effetti avversi nelle larve di S. aurata dopo 96 ore di esposizione.

Increased potential of a cationic liposome-based delivery system:enhancing stability and sustained immunological activity in pre-clinical development

The combination of dimethyl dioctadecyl ammonium bromide (DDA) and the synthetic cord factor trehalose dibehenate (TDB) with Ag85B-ESAT-6 (H1 fusion protein) has been found to promote strong protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. The development of a vaccine formulation that is able to facilitate the requirements of sterility, stability and generation of a vaccine product with acceptable composition, shelf-life and safety profile may necessitate selected alterations in vaccine formulation. This study describes the implementation of a sterilisation protocol and the use of selected lyoprotective agents in order to fulfil these requirements. Concomitantly, close analysis of any alteration in physico-chemical characteristics and parameters of immunogenicity have been examined for this promising DDA liposome-based tuberculosis vaccine. The study addresses the extensive guidelines on parameters for non-clinical assessment, suitable for liposomal vaccines and other vaccine delivery systems issued by the World Health Organisation (WHO) and the European Medicines Agency (EMEA). Physical and chemical stability was observed following alteration in formulations to include novel cryoprotectants and radiation sterilisation. Immunogenicity was maintained following these alterations and even improved by modification with lysine as the cryoprotective agent for sterilised formulations. Taken together, these results outline the successful alteration to a liposomal vaccine, representing improved formulations by rational modification, whilst maintaining biological activity.

Strategic development and physicochemical analysis of oral preparations for unstable drugs

Oral liquid formulations are ideal dosage forms for paediatric, geriatric and patient with dysphagia. Dysphagia is prominent among patients suffering from stroke, motor neurone disease, advanced Alzheimer’s and Parkinson’s disease. However oral liquid preparations are particularly difficult to formulate for hydrophobic and unstable drugs. Therefore current methods employed in solving this issue include the use of ‘specials’ or extemporaneous preparations. In order to challenge this, the government has encouraged research into the field of oral liquid formulations, with the EMEA and MHRA publishing list of drugs of interest. The current work investigates strategic formulation development and characterisation of select API’s (captopril, gliclazide, melatonin, L-arginine and lansoprazole), each with unique obstacles to overcome during solubilisation, stabilisation and when developing a palatable dosage from. By preparing a validated calibration protocol for each of the drug candidates, the oral liquid formulations were assessed for stability, according to the ICH guidelines along with thorough physiochemical characterisation. The results showed that pH and polarity of the solvent had the greatest influence on the extent of drug solubilisation, with inclusion of antioxidants and molecular steric hindrance influencing the extent of drug stability. Captopril, a hydrophilic ACE inhibitor (160 mg.mL-1), undergoes dimerisation with another captopril molecule. It was found that with the addition of EDTA and HP-β-CD, the drug molecule was stabilised and prevented from initiating a thiol induced first order free radical oxidation. The cyclodextrin provided further steric hindrance (1:1 molar ratio) resulting in complete reduction of the intensity of sulphur like smell associated with captopril. Palatability is a crucial factor in patient compliance, particularly when developing a dosage form targeted towards paediatrics. L-arginine is extremely bitter in solution (148.7 g.L-1). The addition of tartaric acid into the 100 mg.mL-1 formulation was sufficient to mask the bitterness associated with its guanidium ions. The hydrophobicity of gliclazide (55 mg.L-1) was strategically challenged using a binary system of a co-solvent and surfactant to reduce the polarity of the medium and ultimately increase the solubility of the drug. A second simpler method was developed using pH modification with L-arginine. Melatonin has two major obstacles in formulation: solubility (100 μg.mL-1) and photosensitivity, which were both overcome by lowering the dielectric constant of the medium and by reversibly binding the drug within the cyclodextrin cup (1:1 ratio). The cyclodextrin acts by preventing UV rays from reaching the drug molecule and initiated the degradation pathway. Lansoprazole is an acid labile drug that could only be delivered orally via a delivery vehicle. In oral liquid preparations this involved nanoparticulate vesicles. The extent of drug loading was found to be influenced by the type of polymer, concentration of polymer, and the molecular weight. All of the formulations achieved relatively long shelf-lives with good preservative efficacy.

Cost efficient supply processes for the Compact Slim Elevator Door

The aim of this thesis was to observe possibilities to enhance the development of manufacturing costs savings and competitiveness related to the compact KONE Renova Slim elevator door. Compact slim doors are especially designed for EMEA markets. EMEA market area is characterized by highly competitive pricing and lead times which are manifested as pressures to decrease manufacturing costs and lead times of the compact elevator door. The new elevator safety code EN81-20 coming live during the spring 2016 will also have a negative impact on the cost and competitiveness development making the situation more acute. As a sheet metal product the KONE Renova slim is highly variable. Manufacturing methods utilized in the production are common and robust methods. Due to the low volumes, high variability and tight lead times the manufacturing of the doors is facing difficulties. Manufacturing of the doors is outsourced to two individual suppliers Stera and Wittur. This thesis was implemented in collaboration with Stera. KONE and Stera pursue a long term and close partnership where the benefits reached by the collaboration are shared equally. Despite the aims, the collaboration between companies is not totally visible and various barriers are hampering the development towards more efficient ways of working. Based on the empirical studies related to this thesis, an efficient standardized (A+) process was developed for the main variations of the compact elevator door. Using the standardized process KONE is able to order the most important AMDS door variations from Stera with increased quality, lower manufacturing costs and manufacturing lead time compared to the current situation. In addition to all the benefits, the standardized (A+) process also includes risks in practice. KONE and the door supplier need to consider these practical risks together before decisions are made.