Étude du rôle de l’auto-antigène nucléaire centromérique B (CENP-B) et des auto-anticorps anti-CENP-B dans l’activation des cellules musculaires lisses vasculaires : implication potentielle dans la pathophysiologie de la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.

Mécanismes traductionnels impliqués dans la potentialisation à long-terme de la transmission synaptique des cellules pyramidales de l’hippocampe chez le rongeur.

La mémoire et l’apprentissage sont des phénomènes complexes dont on ne comprend pas encore bien l’origine au niveau cellulaire et moléculaire. Cependant, il est largement admis que des changements plus simples au niveau synaptique, tels que la potentialisation à long-terme (long-term potentiation ou LTP) pourraient constituer la base cellulaire de la formation des nouveaux souvenirs. Ces mécanismes sont couramment étudiés au niveau de l’hippocampe, une région du lobe temporal reconnue comme étant nécessaire à la formation de la mémoire explicite chez les mammifères. La LTP est classiquement définie comme un renforcement durable de l’efficacité de connexions synaptiques ayant été stimulées de façon répétée et soutenue. De plus, on peut distinguer deux formes de LTP: une LTP précoce, qui repose sur la modification de protéines déjà formées, et une LTP tardive, qui requiert, elle, la synthèse de nouvelles protéines. Cependant, bien que de nombreuses études se soient intéressées au rôle de la traduction pour la maintenance de la LTP, les mécanismes couplant l’activité synaptique à la machinerie de synthèse protéique, de même que l’identité des protéines requises sont encore peu connus. Dans cette optique, cette thèse de doctorat s’est intéressée aux interactions entre l’activité synaptique et la régulation de la traduction. Il est par ailleurs reconnu que la régulation de la traduction des ARNm eukaryotiques se fait principalement au niveau de l’initiation. Nous avons donc étudié la modulation de deux voies majeures pour la régulation de la traduction au cours de la LTP : la voie GCN2/eIF2α et la voie mTOR. Ainsi, nos travaux ont tout d’abord démontré que la régulation de la voie GCN2/eIF2α et de la formation du complexe ternaire sont nécessaires à la maintenance de la plasticité synaptique et de la mémoire à long-terme. En effet, l’activité synaptique régule la phosphorylation de GCN2 et d’eIF2α, ce qui permet de moduler les niveaux du facteur de transcription ATF4. Celui-ci régule à son tour la transcription CREB-dépendante et permet ainsi de contrôler les niveaux d’expression génique et la synthèse de protéines nécessaires pour la stabilisation à long-terme des modifications synaptiques. De plus, la régulation de la voie mTOR et de la traduction spécifique des ARNm 5’TOP semble également jouer un rôle important pour la plasticité synaptique à long-terme. La modulation de cette cascade par l’activité synaptique augmente en effet spécifiquement la capacité de traduction des synapses activées, ce qui leur permet de traduire et d’incorporer les protéines nécessaires au renforcement durable des synapses. De telles recherches permettront sans doute de mieux comprendre la régulation des mécanismes traductionnels par l’activité synaptique, ainsi que leur importance pour la maintenance de la potentialisation à long-terme et de la mémoire à long-terme.

La Visualisation in vivo des « espèces oxygénées radiculaires» au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine.

Titre: La Visualisation in vivo des « espèces oxygénées radiculaires» au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine. Le But : Les espèces d'oxygène réactives sont non seulement produites à la suite de la blessure cellulaire, mais servent aussi des molécules faisantes des signes pour une variété de processus critiques, en incluant mitosis et de mort de cellule. Nous avons auparavant dit que la blessure à RGC axons incite un éclatement de superoxyde dans le corps de cellule, probablement de l'origine mitochondrial (Lieven et al, 2006). Nous décrivons maintenant une méthode pour refléter des espèces d'oxygène réactives dans la rétine de l'animal vivant en utilisant un confocal le lisant rapidement du laser ophthalmoscope a appelé la Rétine de Heidelberg Angiograph 2 (HRA2) équipé avec les lasers doubles. La méthodolologie : Après les études préliminaires en utilisant d'autres indicateurs (hydroethidium; HEt) pour les espèces d'oxygène réactives, nous avons essayé de refléter des espèces d'oxygène réactives dans le dans le modèle de vivo l'utilisation 5-(et 6)-chloromethyl-2', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate, l'acétyle ester (le CM-H2DCFDA). Un nerf optique de Longs-Evans rats a été écrasé intraorbitalement, en épargnant la circulation retinal. Dans certains rats colliculi supérieur de Longs rats Evans avait été auparavant exposé via craniotomy et surposé avec Gelfoam saturé avec le vert indocyanine (ICG). Aux points de temps variables les animaux ont été injectés intraveineusement ou intravitreally avec HEt ou le CM-H2DCFDA et reflétés avec fluorescein et-ou les filtres d'ICG en utilisant le HRA2. Les résultats: Nous avons démontré le foyer brillant multiple de fluorescence dans la couche de cellule de ganglion quand nous avons rétrogradement étiqueté d'ICG bilatéralement, en indiquant qu'ICG était un colorant rétrogradement transporté qui pourrait être découvert avec le HRA2. Après axotomy et l'injection intravitreal de CM-H2DCFDA, il y avait la fluorescence brillante dans le canal fluorescein dans quelques cellules dans la couche de cellule de ganglion, en accord avec la production d'une ou plusieurs espèces d'oxygène réactives. Les conclusions : RGCs peut être identifié et les niveaux d'espèces d'oxygène réactives mesurés en utilisant une fréquence double confocal Mots-clés : cellules ganglionnaires de la rétine; especes oxygenique radiculaire; la visualisation;

Le 17B-Estradiol combiné à un biopolymère à base de chitosan accroît la biocompatibilité des cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse

Les cellules dérivées de la moelle osseuse, principalement les cellules endothéliales progénitrices, sont réduites chez les patients souffrant de maladies cardiovasculaires. Leur mobilisation et leur incorporation aux sites de lésion vasculaire sont des évènements prépondérants dans l’accélération des processus de réendothélialisation. Dans un modèle murin, le 17β-estradiol favorise les processus de guérison vasculaire par la mobilisation et le recrutement des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse. Il existe présentement plusieurs stratégies afin d’augmenter la mobilisation des cellules progénitrices ainsi que leur incorporation à la paroi vasculaire. Cependant, peu d’études privilégient la livraison locale d’un nombre élevé de cellules progénitrices fonctionnelles par un véhicule biodégradable et leur maintien au site de lésion afin de favoriser la réendothélialisation ciblée. Un polymère d’intérêt pour cette application s’avère être le chitosan. Ce biopolymère non toxique et biodégradable est couramment utilisé dans l’ingénierie tissulaire et, depuis peu, est utilisé dans la guérison vasculaire. Le chitosan complexé à la phosphorylcholine voit sa solubilité s’accroître dans les solutions aqueuses ainsi que sa biocompatibilité cellulaire en condition physiologique. Le projet de ce mémoire visait donc : 1) à étudier in vitro, la capacité d’un polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine à influencer l’adhésion, la survie, la différenciation et la fonctionnalité cellulaire dans un modèle murin de culture mixte de cellules dérivées de la moelle osseuse et 2) de déterminer l’impact de la présence du 17β-estradiol sur ces mêmes comportements cellulaires. Nos travaux démontrent que la matrice de chitosan-phosphorylcholine s’avère compatible avec notre modèle de culture cellulaire. En effet, ce polymère est capable de promouvoir l’organisation et le développement des cellules dérivées de la moelle osseuse de façon comparable à la matrice normalement utilisée dans la croissance in vitro des cellules endothéliales progénitrices, la fibronectine. De plus, ce polymère n’a nullement compromis l’activité migratoire des cellules, laissant supposer qu’il pourrait éventuellement être un véhicule approprié pour effectuer une livraison cellulaire à un site de lésion. Il s’avère que le 17β-estradiol, lorsqu’ajouté au milieu de culture ou complexé au polymère de chitosan phosphorylcholine, est capable de moduler le comportement cellulaire, et ce, de façon différente. Le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine démontre, par rapport à sa forme soluble, une plus grande aptitude à accroître le nombre de cellules hématopoïétiques ainsi que des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. De plus, le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine permet une amplification marquée des cellules endothéliales progénitrices et leur offre un support adéquat afin de favoriser la guérison vasculaire. L’ensemble de nos travaux suggère que le polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine en présence ou non de 17β-estradiol est une matrice compatible avec les cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. Le 17β-estradiol complexé au polymère est toutefois plus efficace que sa forme soluble à promouvoir l’amplification du nombre de cellules progénitrices. Ce polymère représente un outil thérapeutique attrayant et une matrice de livraison d’agent bioactif prometteuse pour le recrutement cellulaire dans l’accélération de la guérison vasculaire.

Étude des interactions entre Haemophilus parasuis et des cellules endothéliales et épithéliales porcines: implications d’une composante bactérienne, le lipooligosaccharide (LOS)

Haemophilus parasuis est un pathogène porcin causant la maladie de Glässer caractérisée par de la polysérosite fibrineuse, polyarthrite, méningite et septicémie. La pathogenèse de l’infection et les facteurs de virulence sont encore mal connus. Le site de colonisation de Haemophilus parasuis dans le tractus respiratoire supérieur est controversé. Pour accéder à la circulation sanguine, H. parasuis doit envahir la muqueuse. H. parasuis adhère à des cellules épithéliales porcines de trachée (NPTr). Pour accéder au système nerveux central et causer la méningite, H. parasuis doit traverser la barrière hémato-méningée. H. parasuis adhère à et envahit des cellules endothéliales porcines de microvaisseaux cérébraux (PBMEC) provenant de la BBB. Le but de cette étude était d’étudier certaines interactions entre H. parasuis et son lipooligosccharide (LOS), et des cellules endothéliales et épithéliales porcines. Les résultats démontrent que l’adhésion de H. parasuis Nagasaki aux NPTr et aux PBMEC est en partie médiée par son LOS. H. parasuis induit l’apoptose des NPTr et des PBMEC, mais le LOS ne semble pas impliqué. H. parasuis, et à un niveau moindre son LOS, stimulent la sécrétion d’interleukine- (IL) 6 et d’IL-8. Différentes souches de H. parasuis sérotypes 4 et 5 (sérotypes les plus prévalents en Amérique du Nord) stimulent également les NPTr et PBMEC à produire IL-6 et IL-8. Les résultats suggèrent que le LOS de H. parasuis joue un certain rôle dans la pathogenèse de l’infection, mais d’autres composantes bactériennes sont également impliquées.

Rôle des GTPases ARF dans la migration des cellules endothéliales et la sécrétion du NO

ARF6 et ARF1 sont des petites GTPases de la famille des ARF(s) qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant, la formation et le mouvement des vésicules, la transformation des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. À ce jour, le rôle de la protéine ARF6 et de la protéine ARF1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dans les cellules endothéliales est encore très peu étudié. Le but de cette étude a été de caractériser le rôle de la protéine ARF6 dans la migration des cellules endothéliales induite par l’endothéline-1, ainsi que le rôle de la protéine ARF1 dans la sécrétion du monoxyde d’azote (NO) stimulées par le VEGF. Dans cette étude, nous montrons qu’ARF6 est essentielle à la migration des cellules endothéliales induite par l’endotheline-1. L’inhibition de l’expression d’ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée de la kinase FAK et son association constitutive avec Src. Par ailleurs, cette inhibition affecte l’association entre GIT1 et la kinase FAK. Ceci se traduit par une inhibition du désassemblage des contacts focaux et une augmentation de l’adhésion cellulaire menant à une diminution de la motilité. De plus, nos résultats montrent que la protéine ARF1 est essentielle à l’activation d’eNOS et à la sécrétion du NO suite à l’activation du VEGFR2 dans les cellules endothéliales BAEC. En effet, l’inhibition de l’expression d’ARF1 par interférence à l’ARN entraîne une inhibition du recrutement de la kinase Akt à la membrane plasmique et une inhibition de son activation induite par le VEGF. L’inhibition de l’activation de la kinase Akt par le VEGF conduit à une inhibition de l’activation de eNOS et de la sécrétion du NO. Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les protéines ARF6 et ARF1 sont essentielles à la signalisation de l’ETB et du VEGFR2 pour les processus menant à la migration cellulaire et à la sécrétion du NO respectivement, deux évènements essentiels à l’angiogenèse.

Étude des interactions entre les cellules progénitrices endothéliales et l’adiponectine

L’adiponectine, une adipokine aux niveaux plasmatiques inversement associés aux composantes du syndrome métabolique, protège contre l’athérosclérose et réduit les risques d’infarctus du myocarde. Les cellules progénitrices endothéliales (EPCs) jouent un rôle dans la réparation vasculaire et leur nombre est réduit chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires. Nous croyons que les effets de l’adiponectine peuvent s’expliquer entre autres via ses interactions avec les EPCs. Trois sous-population d’EPCs, isolées du sang de donneurs sains, ont été caractérisées par immunophénotypage par cytométrie en flux. L’expression des récepteurs de l’adiponectine, AdipoR1, AdipoR2 et H-cadherin par les EPCs et les cellules endothéliales a été évaluée par qPCR. Les effets de l’adiponectine sur la migration et l’apoptose des EPCs et sur l’apoptose des HUVECs ont été étudiés. L’expression de l’élastase des neutrophiles par les EPCs et son activité ont été testées. Les résultats de qPCR montrent que l’AdipoR1 est plus fortement exprimé que l’AdipoR2 alors qu’H-cadhérine n’est pas détectable dans les EPCs. Les EPCs précoces expriment aussi l’élastase. L’expression d’AdipoR1 a été confirmée par immunobuvardage. L’adiponectine augmente de façon significative la survie de deux sous-populations d’EPCs, mais pas celle des HUVECs, en condition de privation de sérum. L’activité de l’élastase a été confirmée dans le milieu conditionné par les EPCs. Les EPCs expriment les récepteurs de l’adiponectine et l’élastase. L’adiponectine protège les EPCs contre l’apoptose et pourrait augmenter leur capacité de réparation vasculaire. L’activité élastase des EPCs pourrait moduler localement l’activité de l’adiponectine par la génération de sa forme globulaire.

Thérapie par les cellules souches mésenchymateuses dans la guérison tendineuse chez le cheval

Les tendinites sont des lésions communes chez le cheval athlète, ayant un impact financier et sportif considérable. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) de moelle osseuse (MO) sont empiriquement utilisées en clinique pour améliorer la guérison des affections myoarthrosquelettiques. Cependant, il est nécessaire de standardiser les protocoles d’isolement des CSMs équines et d’analyser leurs effets sur la guérison tendineuse pour ajuster leur dose. Les objectifs de cette étude étaient de comparer 3 méthodes d’isolement des CSMs équines et d’établir un modèle de guérison tendineuse minimal invasif pour analyser l’effet des CSMs sur cette guérison. Des CSMs de MO du sternum de juments étaient isolées par 3 protocoles couramment utilisés (adhérence au pétri (Classique) et 2 méthodes par gradient de densité (Percoll et Ficoll)). La viabilité des cellules après isolement, le rendement d’isolement, le nombre de CSMs obtenues après 14 jours de culture et leurs caractéristiques fonctionnelles (renouvellement et différentiation) étaient comparés entre les 3 protocoles. Les résultats suggéraient que le Percoll était le meilleur protocole en termes de rendement et de capacité de renouvellement des cellules. La différence n’était pas significative pour leur viabilité et leur capacité de différentiation. Un modèle de guérison tendineuse, consistant en une ténectomie du tendon extenseur latéral du doigt fut ensuite développé. Cependant, la grande variabilité interindividuelle de qualité de guérison dans le groupe pilote implique une ré-évaluation du modèle. Des études futures, avec des CSMs isolées par le Percoll dans de nouveaux modèles de guérison tendineuse devraient permettre de déterminer la dose adéquate de CSMs.

Modulation de l’expression du récepteur B1 des kinines par l’angiotensine II et l’endothéline-1 dans des cellules musculaires lisses vasculaires

Le stress oxydatif est impliqué dans l’expression du récepteur B1 des kinines (RB1) dans différents modèles de diabète et d'hypertension. Puisque l'angiotensine II (Ang II) et l'endothéline-1 (ET-1) sont des peptides prooxydants impliqués dans les maladies cardiovasculaires, leur contribution dans l'augmentation de l'expression du RB1 a été étudiée dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Le QRT-PCR et l’immunobuvardage de type Western ont été utilisés pour mesurer l’expression du RB1 dans des CMLV dérivées de la lignée A10 et de l’aorte de rats Sprague-Dawley. Cette étude montre que l’Ang II augmente l’expression du RB1 (ARNm et protéine) en fonction de la concentration et du temps (maximum 1 μM entre 3-6 h). Cette augmentation implique le récepteur AT1, la PI3K et le NF-κB, mais non le récepteur AT2 et ERK1/2. Aussi, le récepteur ETA de l’ET-1 est impliqué dans la réponse à l’Ang II à 6-8 h et non à 1-4 h. Par contre, l’ET-1 augmente l’expression du RB1 (maximum 2-4 h) via la stimulation des récepteurs ETA et ETB. L’augmentation du RB1 causée par l’Ang II et l’ET-1 est bloquée par les antioxydants (N-acétyl-cystéine et diphénylèneiodonium). Ces résultats suggèrent que l’Ang II induit le RB1 dans les CMLV par le récepteur AT1 dans la première phase, et par la libération d’ET-1 (majoritairement par ETA) dans la phase tardive, via le stress oxydatif et l’activation de la PI3K et du NF-κB. Ces résultats précisent le mécanisme impliqué dans la surexpression du RB1 ayant des effets néfastes dans le diabète et l'hypertension.

Étude du dysfonctionnement du compartiment des cellules B chez des patients à différents stades d’infection par le virus d’immunodéficience humaine (VIH)

Les anomalies phénotypiques et fonctionnelles des lymphocytes B (LB) sont typiques d'une infection au VIH et se traduisent principalement par une activation polyclonale, une perte de la mémoire immunitaire ainsi qu'une réponse humorale déficiente et des phénomènes auto-immunitaires souvent précurseurs de lymphomes B. Ces anomalies se retrouvent principalement chez les patients lors de la phase chronique de la maladie et semblent être reliées en partie au niveau de la charge virale ainsi qu'à un compartiment de lymphocytes T CD4+ altéré. Cependant, quoique controversé, des éléments d’activation polyclonale ont également été observés chez les non-progresseurs à long terme (LTNPs) qui présentent une charge virale faible et un compartiment T CD4+ semblable aux individus séronégatifs. Ainsi, les objectifs principaux de cette étude sont 1) d’établir une chronologie des anomalies du compartiment des cellules B chez des individus infectés par le VIH qui ont une progression différente de la maladie (PHI normaux, rapides, sains et LTNP). 2) corréler les niveaux sériques du stimulateur de lymphocytes B (BLyS), un facteur de croissance des cellules B, avec les phénotypes observés chez ces mêmes patients. L’hyperglobulinémie, les niveaux sériques de BLyS et d’auto-anticorps ont été mesuré longitudinalement chez une cohorte d’individus en primo-infection (PHI) avec des progressions différentes de la maladie (rapides et normaux), LTNP et sujets sains. Nos résultats démontrent que l’activation polyclonale des LB survient indépendamment de la vitesse de progression et persiste chez les LTNP ou malgré une thérapie antirétrovirale efficace chez les progresseurs rapides. Des niveaux élevés de BLyS dans le sérum des progresseurs rapides corrèlent avec des fréquences altérées de monocytes et cellules dendritiques, suggérant un rôle de celles-ci dans l’atteinte du compartiment des cellules B.

Effets de la purification d’alginate et de la co-encapsulation avec des cellules canaliculaires sur la survie et fonction d’îlots de Langerhans microencapsulés

La transplantation d’îlots chez des sujets diabétiques permet la normalisation de leur glycémie mais nécessite l’utilisation d’immunosuppresseurs. Afin d’éliminer l’utilisation de ceux-ci, une capsule d’alginate capable d’immunoprotéger l’îlot a été proposée. Cependant, un problème persiste : la survie de l’implant est limitée. Deux moyens afin d’améliorer ce facteur seront présentés dans ce mémoire: l’utilisation d’alginate purifié et la co-encapsulation des îlots avec des cellules canaliculaires pancréatiques. La première étude rapporte un aspect nouveau : les effets directs de l’alginate non-purifié, versus purifié, sur la survie d’îlots encapsulés. Ceci est démontré in vitro sur la viabilité à long terme des îlots, leur fonction et l’incidence de leur mort cellulaire par apoptose et nécrose. Ces investigations ont permis de conclure que l’alginate purifié permet de maintenir à long terme une meilleure survie et fonction des îlots. De plus, cette étude ajoute un autre rôle aux contaminants de l’alginate en plus de celui d’initier la réaction immunitaire de l’hôte; celle-ci étant indirectement reliée à la mort des îlots encapsulés. La deuxième étude consiste à déterminer les impacts possibles d’une co-encapsulation d’îlots de Langerhans avec des cellules canaliculaires pancréa-tiques. Les résultats obtenus démontrent que cette co-encapsulation n’améliore pas la survie des îlots microencapsulés, par des tests de viabilité et de morts cellulaires, ni leur fonction in vivo testée par des implantations chez un modèle murin immmunodéficient. Pour conclure, la survie des îlots encapsulés peut être améliorée par la purification de l’alginate mais reste inchangée lors d’une co-encapsulation avec des cellules canaliculaires pancréatiques.

Étude de l'implication des navettes du pyruvate découlant du métabolisme mitochondrial du glucose dans la régulation de la sécrétion d'insuline par les cellules bêta pancréatiques

Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l’insuline des tissus périphériques et par une incapacité des cellules β pancréatiques à sécréter les niveaux d’insuline appropriés afin de compenser pour cette résistance. Pour mieux comprendre les mécanismes déficients dans les cellules β des patients diabétiques, il est nécessaire de comprendre et de définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Dans les cellules β pancréatiques, le métabolisme du glucose conduit à la production de facteurs de couplage métabolique, comme l’ATP, nécessaires à la régulation de l’exocytose des vésicules d’insuline. Le mécanisme par lequel la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose déclenche l’exocytose des vésicules d’insuline est bien décrit dans la littérature. Cependant, il ne peut à lui seul réguler adéquatement la sécrétion d’insuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage métaboliques qui ont été suggérés afin de relier le métabolisme du glucose à la régulation de la sécrétion d’insuline. Les mécanismes impliqués demeurent cependant à être caractérisés. Le but de la présente thèse était de déterminer l’implication des navettes du pyruvate, découlant du métabolisme mitochondrial du glucose, dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans les cellules β, les navettes du pyruvate découlent de la combinaison des processus d’anaplérose et de cataplérose et permettent la transduction des signaux métaboliques provenant du métabolisme du glucose. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la navette pyruvate/citrate dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose, puisque cette navette conduit à la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage métabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux métabolique à travers la glycolyse en réoxydation le NADH. Une étude effectuée précédemment dans notre laboratoire avait suggéré la présence de cette navette dans les cellules β pancréatique. Afin de tester notre hypothèse, nous avons ciblé trois étapes de cette navette dans la lignée cellulaire β pancréatique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et l’activité de l’ATP-citrate lyase (ACL) et l’enzyme malique (MEc), deux enzymes clés de la navette pyruvate/citrate. L’inhibition de chacune de ces étapes par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interférant a corrélé avec une réduction significative de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Les résultats obtenus suggèrent que la navette pyruvate/citrate joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Parallèlement à notre étude, deux autres groupes de recherche ont suggéré que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate étaient aussi importantes pour la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ainsi, trois navettes découlant du métabolisme mitochondrial du glucose pourraient être impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’insuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage métabolique possiblement très important pour la sécrétion d’insuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est formé par MEc, alors que l’isocitrate déshydrogénase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate. Dans notre première étude, nous avions démontré l’importance de l’expression de ME pour la sécrétion adéquate d’insuline en réponse au glucose. Dans notre deuxième étude, nous avons testé l’implication de IDHc dans les mécanismes de régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. La diminution de l’expression de IDHc dans les INS 832/13 a stimulé la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par un mécanisme indépendant de la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose. Ce résultat a ensuite été confirmé dans les cellules dispersées des îlots pancréatiques de rat. Nous avons aussi observé dans notre modèle que l’incorporation du glucose en acides gras était augmentée, suggérant que la diminution de l’activité de IDHc favorise la redirection du métabolisme de l’isocitrate à travers la navette pyruvate/citrate. Un mécanisme de compensation à travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la sécrétion d’insuline observée en réponse à la diminution de l’expression de IDHc. Les travaux effectués dans cette deuxième étude remettent en question l’implication de l’activité de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate, dans la transduction des signaux métaboliques reliant le métabolisme du glucose à la sécrétion d’insuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate à conduire à la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules β. Le malonyl-CoA régule le métabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transférase 1, l’enzyme limitante dans l’oxydation des acides gras. Ainsi, l’élévation des niveaux de malonyl-CoA en réponse au glucose entraîne une redirection du métabolisme des acides gras vers les processus d’estérification puis de lipolyse. Plus précisément, les acides gras sont métabolisés à travers le cycle des triglycérides/acides gras libres (qui combinent les voies métaboliques d’estérification et de lipolyse), afin de produire des molécules lipidiques signalétiques nécessaires à la modulation de la sécrétion d’insuline. Des études effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que l’activité lipolytique de HSL (de l’anglais hormone-sensitive lipase) était importante, mais non suffisante, pour la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans une étude complémentaire, nous nous sommes intéressés au rôle d’une autre lipase, soit ATGL (de l’anglais adipose triglyceride lipase), dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et aux acides gras. Nous avons démontré que ATGL est exprimé dans les cellules β pancréatiques et que son activité contribue significativement à la lipolyse. Une réduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interférant ou son absence dans les îlots pancréatiques de souris déficientes en ATGL a conduit à une réduction de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose en présence ou en absence d’acides gras. Ces résultats appuient l’hypothèse que la lipolyse est une composante importante de la régulation de la sécrétion d’insuline dans les cellules β pancréatiques. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ce mécanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du métabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question l’implication de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Le rôle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant à être déterminé. Finalement, nos travaux ont aussi démontré un rôle pour ATGL et la lipolyse dans les mécanismes de couplage métabolique régulant la sécrétion d’insuline.

Le rôle des cellules gliales de Müller dans la mort des cellules ganglionnaires de la rétine par des mécanismes cellulaires non-autonomes

Les cellules gliales sont essentielles au fonctionnement du système nerveux. Dans la rétine, les cellules gliales de Müller assurent à la fois l’homéostasie du tissu et la protection des neurones, notamment celle des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs). L’hypothèse principale de la thèse est que les cellules de Müller joueraient un rôle primordial dans la survie neuronale tant au plan de la signalisation des neurotrophines/proneurotrophines par suite d’une blessure que lors des mécanismes d’excitotoxicité. Contrairement au brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le nerve growth factor (NGF) n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs après une section du nerf optique. Le premier objectif de la thèse a donc été de localiser les récepteurs p75NTR et TrkA du NGF dans la rétine adulte et d’établir leur fonction respective en utilisant des ligands peptidomimétiques agonistes ou antagonistes spécifiques pour chacun des récepteurs. Nos résultats ont démontré que TrkA est surexprimé par les CGRs après l’axotomie, tandis que p75NTR est spécifiquement exprimé par les cellules de Müller. Alors que NGF n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs, l’activation spécifique de TrkA par des ligands peptidomimétique est nettement neuroprotectrice. De façon surprenante, le blocage sélectif de p75NTR ou l’absence de celui-ci protège les CGRs de la mort induite par l’axotomie. De plus, la combinaison de NGF avec l’antagoniste de p75NTR agit de façon synergique sur la survie des CGRS. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel le récepteur p75NTR exprimé par les cellules gliales de Müller peut grandement influencer la survie neuronale. Ensuite, nous avons voulu déterminer l’effet des proneurotrophines dans la rétine adulte. Nous avons démontré que l’injection de proNGF induit la mort des CGRs chez le rat et la souris par un mécanisme dépendant de p75NTR. L’expression de p75NTR étant exclusive aux cellules de Müller, nous avons testé l’hypothèse que le proNGF active une signalisation cellulaire non-autonome qui aboutit à la mort des CGRs. En suivant cette idée, nous avons montré que le proNGF induit une forte expression du tumor necrosis factor α (TNFα) dans les cellules de Müller et que l’inhibition du TNF bloque la mort neuronale induite par le proNGF. L’utilisation de souris knock-out pour la protéine p75NTR, son co-récepteur sortiline, ou la protéine adaptatrice NRAGE a permis de montrer que la production de TNF par les cellules gliales était dépendante de ces protéines. Le proNGF semble activer une signalisation cellulaire non-autonome qui cause la mort des neurones de façon dépendante du TNF in vivo. L’hypothèse centrale de l’excitotoxicité est que la stimulation excessive des récepteurs du glutamate sensibles au N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) est dommageable pour les neurones et contribue à plusieurs maladies neurodégénératives. Les cellules gliales sont soupçonnées de contribuer à la mort neuronale par excitotoxicité, mais leur rôle précis est encore méconnu. Le dernier objectif de ma thèse était d’établir le rôle des cellules de Müller dans cette mort neuronale. Nos résultats ont démontré que l’injection de NMDA induit une activation du nuclear factor κB (NF-κB) dans les cellules de Müller, mais pas dans les CGRs, et que l’utilisation d’inhibiteurs du NF-κB empêche la mort des CGRs. De plus, nous avons montré que les cellules de Müller en réaction à l’activation du NF-κB produisent la protéine TNFα laquelle semble être directement impliquée dans la mort des CGRs par excitotoxicité. Cette mort cellulaire se produit principalement par l’augmentation à la surface des neurones des récepteurs AMPA perméables au Ca2+, un phénomène dépendant du TNFα. Ces donnés révèlent un nouveau mécanisme cellululaire non-autonome par lequel les cellules gliales peuvent exacerber la mort neuronale lors de la mise en jeu de mécanismes excitotoxiques.

Altérations métaboliques et nature des acides gras : implication dans la différenciation des cellules régénératives du tissu adipeux

Par la sécrétion d’adipokines, le tissu adipeux blanc viscéral présent chez des patients souffrant d’obésité promeut l’installation d’altérations métaboliques telles que l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les complications cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints de diabète de type 2. Il a été démontré que la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est composée de cellules régénératives dérivées du tissu adipeux (CRTA) et que ces cellules possèdent des caractéristiques des cellules progénitrices stromales (CPS). L’impact de l’intolérance au glucose et du diabète de type 2 sur les adipocytes sont assez bien documentés. Par contre, les conséquences de ces pathologies sur le comportement des CRTA n’ont pas été mesurées d’une façon approfondie. Plus particulièrement, l’impact de ces altérations métaboliques sur le potentiel de différenciation des CRTA en adipocytes et en cellules endothéliales n’a pas été étudié. Ce projet a pour but d’évaluer, dans un modèle murin, l’effet de ces altérations métaboliques sur l’équilibre de la différenciation in vitro des CRTA en adipocytes ou en cellules endothéliales. L’intolérance au glucose et le diabète de type 2 ont été induit chez les souris par la prise de deux diètes riches en acides gras de provenance végétale (DV) ou animale (DA). L’impact de l’origine des acides gras sur la différenciation des CRTA a également été étudié. Pour ce faire, une mise au point de la culture cellulaire des CRTA s’est avérée nécessaire et compte pour une partie de ces travaux de maîtrise. Nos travaux ont démontré en premier lieu, que le DMSO est un agent qui conserve la viabilité et les propriétés progénitrices des CRTA suite à leur congélation. De plus, parmi les matrices testées, le collagène s’est avéré être celle qui conserve le mieux les caractéristiques des progéniteurs et même, qui enrichie la population cellulaire ensemencée en cellules progénitrices. La densité cellulaire des cellules non-adipeuses du tissu adipeux s’avère être significativement plus élevée chez les souris du groupe de la DV comparativement aux souris contrôles. De plus, l’évaluation in vitro de la différenciation adipogénique démontre un potentiel de différenciation plus important pour les CRTA provenant des souris de la DV par rapport au groupe contrôle et à la DA. Cependant, la différenciation en cellules endothéliales est inhibée chez les CRTA de la DV, comparativement à un retard de ce processus pour la DA. Nos travaux suggèrent que le potentiel de différenciation adipogénique et endothéliale des CRTA est affecté par le statut métabolique des souris ainsi que par la nature de la diète. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois l’importance d’évaluer le comportement des CRTA en fonction du statut métabolique du donneur, un paramètre pouvant avoir un impact majeur dans l’utilisation des CRTA autologues en thérapie cellulaire pour la réparation de tissus vasculaires chez des patients diabétiques.

Impact de HOXB4 sur les cellules B

La greffe de cellules souches hématopoïétiques autologue est une thérapie de plus en plus utilisée. Cependant, les traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie intensifs peuvent affecter les cellules souches et diminuer le nombre de ces cellules pouvant être mobilisées à des fins de transplantation. Il serait donc très utile de pouvoir expandre ces cellules souches afin de s’assurer qu’elles soient en quantité suffisante pour procéder à la greffe. Or, il a été démontré que la protéine HOXB4 a la capacité d’expandre les cellules souches hématopoïétiques humaines et murines. Lors d’une greffe autologue, la moelle osseuse est cependant colonisée par des cellules malignes. Notre objectif était donc de s’assurer que la protéine HOXB4 expand les cellules souches hématopoïétiques normales mais n’expand pas les cellules « souches » leucémiques. De plus, comme des expériences précédentes ont démontré que chez des souris transplantées avec des cellules souches surexprimant HOXB4, la reconstitution du système hématopoïétique pouvait favoriser les cellules myéloïdes aux dépends des cellules lymphoïdes, nous avons aussi voulu déterminer l’impact de HOXB4 sur la différenciation des cellules progénitrices lymphoïdes normales. Pour ce faire, nous avons exposé des cellules humaines et murines à la protéine HOXB4 afin de comparer la prolifération des cellules B malignes à celle des cellules B normales. De plus, nous avons évalué l’impact de HOXB4 sur les cellules B à leurs différents stades de différenciation. Nos résultats démontrent que HOXB4 ne favorise pas l’expansion des cellules leucémiques. De plus, nous avons observé que les cellules lymphoïdes surexprimant la protéine HOXB4 ont un ralentissement dans leur processus de différenciation. Aussi, la surexpression de HOXB4 entraîne une diminution de la fréquence et du nombre de progéniteurs lymphoïdes normaux. Ces résultats démontrent donc que la protéine HOXB4 ne produit pas d’expansion des cellules malignes. De plus, elle confère un désavantage prolifératif aux cellules lymphoïdes.