Clonagem de sequências codificantes de citocinas felinas para construção de curva padrão para PCR em tempo real

A quantificação de citocinas felinas possibilita uma avaliação do sistema imune do animal em diferentes doenças, permite também a identificação de diferentes fatores que alteram sua secreção, e colabora na compreensão da patogênese das enfermidades. Em humanos e camundongos essa mensuração é feita principalmente pelo método de ELISA, mas para os felinos há uma menor disponibilidade de kits específicos para determinadas citocinas, e estes possuem um custo elevado. Assim, uma alternativa é utilizar a reação de PCR em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR) para quantificação absoluta dos RNAs mensageiros das citocinas felinas, uma técnica bastante sensível e específica para analisar a expressão desses genes. Com esse intuito, esse trabalho teve como objetivo clonar as sequências gênicas codificantes de citocinas, para construir uma curva padrão para a qPCR. Assim, foi feita extração de RNA de amostras de sangue total de gatos domésticos, e estes foram tratados com DNAse para evitar contaminação por DNA genômico. O cDNA foi sintetizado, e amplificado com os primers específicos para cada fragmento codificante de citocina e o GAPDH felino. Cada amplicon purificado foi inserido em um plasmídeo comercial, e introduzido em bactérias E. coli cepa DH5. Os clones recombinantes foram sequenciados para confirmar a inserção do fragmento no vetor. As curvas padrão da qPCR foram construídas com cada plasmídeo recombinante numa de 106 a 101 cópias por reação. O sequenciamento mostrou que todos os clones eram semelhantes àqueles encontrados no GenBank. A eficiência das amplificações, baseado no slope das curvas padrão foram: 101,3% para GAPDH, 99,1% para IL-1, 83,2% para IL-6, 94,4% para IL-10, 105,5% para IL-12, 83,4% para IFN- e 83,8% para TNF-. O valor de r2 foi de 0,99 em todas as reações. Dessa forma, com a clonagem dos fragmentos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

PCR em tempo real para caracterização de fontes alimentares de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae)

Os flebotomíneos são insetos hematófagos de grande importância médica e veterinária atuando como vetores de parasitas como Leishmania. O estudo do padrão alimentar desses vetores pode ajudar a compreender a sua interação com potenciais reservatórios de Leishmania. Neste estudo, desenvolvemos ensaios de PCR em tempo real para identificação de sangue em flebotomíneos. Seis pares de primers foram desenhados com base no gene citocromo b de sequencias disponíveis no GenBank dos seguintes hospedeiros potenciais: cão, gato, cavalo, galinha, rato e humano. Primeiramente, os ensaios de PCR em tempo real utilizando SYBR Green foram conduzidos usando uma curva padrão com oito concentrações diferentes (i.e., 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg e 1 fg por 2 µl) de amostras do DNA extraído do sangue com EDTA a partir de cada espécie de animal. Em seguida, o DNA foi extraído de 100 fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas de campo pertencentes a três espécies (i.e., Lutzomyia longipalpis, L. migonei e L. lenti) foram testadas pelos protocolos aqui padronizados. Fêmeas de flebotomíneos foram experimentalmente alimentadas em um rato (Rattus rattus) e utilizadas para avaliar a detecção do ensaio. Os protocolos funcionaram de forma eficiente com limites de detecção de 10 pg a 100 fg. Fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas coletadas no campo estavam alimentadas de humanos (73 por cento), galinhas (23 por cento), cães (22 por cento), cavalos (15 por cento), ratos (11 por cento) e gatos (2 por cento). Curiosamente, 76,1 por cento das fêmeas de L. longipalpis foram positivas para o sangue humano. No total, 48 por cento das fêmeas testadas estavam alimentadas em uma única fonte, 31 por cento em duas e 12 por cento em três. A análise do curso de tempo mostrou que a técnica de PCR em tempo real visando o DNA de roedor foi capaz de detectar pequenas quantidades de DNA do hospedeiro até 5 dias após o repasto sanguíneo. Esses protocolos representam ferramentas promissoras para a identificação da fonte alimentar de flebotomíneos de campo

Evolução do sistema de custos baseados em atividades: um estudo exploratório da utilização da metodologia de ABC ao longo do tempo

Muito tem se escrito desde o surgimento da Metodologia de Custeio Baseado em AtividadesABC como técnica alternativa aos modelos contábeis de custeio. A seu respeito diversos autores buscaram exaltar suas vantagens, sugeriram aplicações variadas, inclusive em apoio a outras ferramentas de gestão e revelaram segredos para realizar implantar essa técnica com sucesso. Visto que são passados mais de 10 anos de implantações dessa técnica em diversas empresas no Brasil e considerando-se a existência de uma curva de aprendizagem em relação ao uso e aplicações da metodologia, muito pouco se falou sobre o que aconteceu depois de uma implantação de sucesso. O que houve depois que os primeiros resultados apareceram, depois que as informações de custos se incorporaram no dia-a-dia das empresas, o que se criou a partir do uso da metodologia? A proposta desse trabalho é portanto explorar a realidade das empresas que implementaram o ABC e ver como a técnica evoluiu. Assim busca-se responder a questões como quais aplicações são realmente colocadas em prática e que tipo de lições os usuários com mais de três anos de uso aprenderam no dia-a-dia. As respostas encontradas passaram pela definição e classificação de sete diferentes categorias para as aplicações sugeridas para a metodologia. Posteriormente, através dos dados da pesquisa de campo foi possível a identificação daquelas categorias com maior grau de utilização. Os dados da pesquisa também revelaram as tendências no uso da metodologia e confirmaram a existência de um processo de amadurecimento no uso da metodologia, bem como as variáveis influentes nesse processo.

Curva de crescimento e marcha de absorção de macronutrientes em mudas de goiabeira

A utilização de mudas de goiabeira com adequado estado nutricional determina o sucesso da implantação de um pomar. O objetivo deste trabalho foi determinar crescimento e acúmulo de macronutrientes em mudas de duas cultivares de goiabeira obtidas por estaquia herbácea. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, com parcelas subdivididas, com três repetições. Assim, foram utilizadas como parcelas duas cultivares de goiabeira (Paluma e Século XXI) e, como subparcelas, sete coletas de plantas ao longo do período experimental (120 dias), em solução nutritiva. As plantas foram avaliadas quinzenalmente quanto a: altura, número de folhas, diâmetro do caule, área foliar e massa de matéria seca (folhas, caule e raízes). Nos diferentes órgãos das mudas, determinou-se o acúmulo de macronutrientes. Houve acúmulo quadrático de matéria seca das mudas de goiabeira com o tempo de cultivo. A muda de goiabeira da cultivar Século XXI tem maior exigência de macronutrientes que a da cultivar Paluma, e o período de maior exigência é a partir dos 75 e 45 dias, para ambas as cultivares. O acúmulo de macronutrientes pelas mudas de goiabeira das cultivares Paluma e Século XXI foi de: K (726 e 696), N (552 e 585), Ca (293 e 302), S (73 e 66), P (64 e 66) e Mg (39 e 41) mg por planta, respectivamente.

Número mínimo de tensões para determinação da curva característica de retenção de água de um latossolo vermelho eutrófico sob sistema de semeadura direta

Para o conhecimento do comportamento físico-hídrico do solo, é fundamental a determinação da curva de retenção de água (CRA). A aquisição de dados para obtenção da CRA envolve processos demorados e custos elevados. A hipótese deste estudo foi a de que é possível determinar a CRA com menor número de tensões, reduzindo seu tempo de obtenção, sem, contudo, comprometer a acurácia dos resultados. Assim, o objetivo deste trabalho foi determinar quais tensões podem ser utilizadas para determinação da CRA de Latossolo Vermelho eutrófico de maneira acurada e em menor tempo. Foram determinados os conteúdos de água retidos em amostras de um Latossolo Vermelho eutrófico sob sistema de semeadura direta (SSD). As tensões utilizadas na determinação dos conteúdos de água foram: 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 500, 700, 1.000, 3.000, 5.000 e 15.000 hPa. Os dados foram combinados e determinaram-se 450 CRAs ajustadas pelo modelo de van Genuchten. Os parâmetros α, m, n e Ug res, gerados pelo modelo, foram submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott (p = 0,05). A hipótese deste estudo foi confirmada, ou seja, é possível determinar a CRA com menor número de tensões, reduzindo seu tempo de obtenção em até cinco vezes, sem, contudo, comprometer a acurácia dos resultados. A tensão de 15.000 hPa deve estar contida na combinação de tensões a serem utilizadas para determinação da curva característica de retenção de água, quando se emprega o modelo matemático de van Genuchten para ajuste dos dados. As curvas características de retenção de água do solo, definidas com as combinações de tensões (0, 60, 700 e 15.000 hPa), (0, 80, 700 e 15.000 hPa), (0, 100, 1.000 e 15.000 hPa), (0, 20, 60, 100, 700 e 15.000 hPa), (0, 80, 300, 700 e 15.000 hPa) e (0, 100, 300, 1.000 e 15.000 hPa), sendo os dados ajustados ao modelo de van Genuchten, proporcionaram estimativas dos conteúdos de água, retidos no Latossolo Vermelho eutrófico sob sistema de semeadura direta, com a mesma acurácia, quando comparada à curva de referência partindo-se de um conjunto de 15 valores de tensões.

Comparação de alguns modelos matemáticos para ajuste à curva de lactação média de um rebanho da raça Caracu

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Efeito de variáveis de processo no tempo de fermentação e na concentração das dicetonas vicinais totais

Among the main challenges in the beer industrial production is the market supply at the lowest cost and high quality, in order to ensure the expectations of customers and. consumers The beer fermentation stage represents approximately 70% of the whole time necessary to its production, having a obligatoriness of strict process controls to avoid becoming bottleneck in beer production. This stage is responsible for the formation of a series of subproducts, which are responsible for the composition of aroma/bouquet existing in beer and some of these subproducts, if produced in larger quantities, they will confer unpleasant taste and odor to the final product. Among the subproducts formed during the fermentation stage, total vicinal diketones is the main component, since it is limiting for product transfusion to the subsequent steps, besides having a low perception threshold by the consumer and giving undesirable taste and odor. Due to the instability of main raw materials quality and also process controls during fermentation, the development of alternative forms of beer production without impacting on total fermentation time and final product quality is a great challenge to breweries. In this work, a prior acidification of the pasty yeast was carried out, utilizing for that phosphoric acid, food grade, reducing yeast pH of about 5.30 to 2.20 and altering its characteristic from flocculent to pulverulent during beer fermentation. An increase of six times was observed in amount of yeast cells in suspension in the second fermentation stage regarding to fermentations by yeast with no prior acidification. With alteration on two input variables, temperature curve and cell multiplication, which goal was to minimize the maximum values for diketones detected in the fermenter tank, a reduction was obtained from peak of formed diacetyl and consequently contributed to reduction in fermentation time and total process time. Several experiments were performed with those process changes in order to verify the influence on the total fermentation time and total vicinal diketones concentration at the end of fermentation. This experiment reached as the best production result a total fermentation time of 151 hours and total vicinal diketone concentration of 0.08 ppm. The mass of yeast in suspension in the second phase of fermentation increased from 2.45 x 106 to 16.38 x 106 cells/mL of yeast, which fact is key to a greater efficiency in reducing total vicinal diketones existing in the medium, confirming that the prior yeast acidification, as well as the control of temperature and yeast cell multiplication in fermentative process enhances the performance of diketones reduction and consequently reduce the total fermentation time with diketones concentration below the expected value (Max: 0.10 ppm)

Análise tempo-intensidade dos estímulos doce e amargo de extrato de folhas de estévia [Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni] em doçura equivalente a sacarose

O extrato de folhas de estévia (Stevia rebaudiana Bertoni) é o único edulcorante utilizado na substituição da sacarose, que pode ser produzido totalmente no Brasil. O objetivo deste estudo foi determinar os comportamentos de características temporais dos estímulos doce e amargo da estevia em doçuras equivalentes a soluções de sacarose (DESS) a 3 e 10%. As curvas tempo-intensidade (T-I) para cada substância foram coletadas utilizando-se o programa Sistema de Coleta de Dados Tempo-Intensidade - SCDTI para Windows, onde os provadores registravam com auxílio do mouse a percepção de cada estímulo solicitado em função do tempo, para cada amostra. Os parâmetros das curvas T-I coletados foram: tempo de intensidade máxima (TImax), intensidade máxima (Imax), tempo onde a intensidade máxima começa a declinar (Td), tempo de platô (Platô), área sob a curva (Área) e tempo total de duração do estímulo (Ttot). Os parâmetros Td, Ttot, Área e Platô das curvas T-I para o estímulo doce nos dois níveis de doçura foram significativamente superiores para estévia, enquanto TImax e Imax foram significativamente menores (p£0,05), sendo que as diferenças entre os valores para as duas substâncias foram muito maiores a DESS a 10%. A sacarose não apresentou nenhum registro para o estímulo amargo tanto a 3 como a 10%, enquanto a estévia apresentou curvas T-I características, com intensidade e o tempo total de duração dependente da concentração.

Análise tempo-intensidade dos gostos doce e amargo de extrato de folhas de estévia (Stévia rebaudiana Bertoni) em doçura equivalente a sacarose

O extrato de folhas de estévia (Stévia rebaudiana Bertoni) é o único edulcorante utilizado na substituição da sacarose, que pode ser produzido totalmente no Brasil. Este trabalho objetivou determinar o comportamento de características temporais dos estímulos doce e amargo do extrato de estévia em doçuras equivalentes a soluções de sacarose (DESS) a 3 e 10%. As curvas tempo-intensidade (T-I) para cada substância foram coletadas utilizando-se o programa Sistema de Coleta de Dados Tempo-Intensidade - SCDTI para Windows, onde os provadores registravam com auxílio do mouse a percepção de cada estímulo solicitado em função do tempo, para cada amostra. Os parâmetros das curvas T-I determinados foram: tempo de intensidade máxima (TImax), intensidade máxima (Imax), tempo onde a intensidade máxima começa a declinar (Td), tempo de platô (Platô), área sob a curva (Área) e tempo total de duração do estímulo (Ttot). Os parâmetros Td, Ttot, Área e Platô das curvas T-I para o estímulo doce nos dois níveis de doçura significativamente foram superiores para o extrato de estévia, enquanto TImax e Imax foram significativamente menores (p£ 0,05). As diferenças entre os valores de sacarose e extrato de estévia foram muito maiores a DESS a 10%. A sacarose não apresentou nenhum registro para o estímulo amargo tanto a 3 como a 10%, enquanto a estévia apresentou curvas T-I características, com intensidade e o tempo total de duração dependente da concentração.

Curva de aprendizado em cirurgia aórtica videolaparoscópica: estudo experimental em porcos

CONTEXTO: A cirurgia videolaparoscópica (CVL) vem evoluindo como alternativa cirúrgica menos invasiva para o tratamento da doença aterosclerótica oclusiva aorto-ilíaca e do aneurisma da aorta abdominal. Poucos estudos avaliaram objetivamente a curva de aprendizado com essa técnica em cirurgia vascular. OBJETIVO: Avaliar objetivamente os tempos e a evolução de cada passo cirúrgico e demonstrar a exeqüibilidade dessa técnica. MÉTODOS: Entre outubro 2007 e janeiro de 2008, dois cirurgiões vasculares iniciantes na CVL operaram, após cursos e treinamentos, seis porcos consecutivos, com dissecção aórtica e interposição de um enxerto de dácron em um segmento da aorta infra-renal abdominal, com técnica totalmente laparoscópica. RESULTADOS: Todos os tempos cirúrgicos foram decrescentes ao longo do estudo, apresentando redução de 45,9% no tempo total de cirurgia, 85,8% no tempo de dissecção da aorta, 81,2% na exposição da aorta, 55,1% no clampeamento total, 71% na confecção da anastomose proximal e 64,9% na anastomose distal. CONCLUSÃO: O presente estudo mostrou que os resultados técnicos satisfatórios da CVL vascular ocorreram somente após longa curva de aprendizado, que foi decrescente ao longo do tempo, à medida que aumentou a experiência e vivência com os materiais e com a visão não-estereoscópica. Essa técnica pode ser realizada com perfeição por cirurgiões vasculares desde que façam cursos especializados, com treinamento em simuladores e animais, e desde que busquem constante aprimoramento a fim de conseguir resultados similares aos obtidos com a cirurgia convencional.

A curva de regressão da gonadotrofina coriônica humana é útil no diagnóstico precoce da neoplasia trofoblástica gestacional pós-molar?

OBJETIVO: avaliar a utilidade da curva de regressão normal da gonadotrofina coriônica humana (hCG) no diagnóstico precoce de neoplasia trofoblástica gestacional pós-molar (NTG). MÉTODOS: estudo longitudinal, incluindo 105 pacientes com mola hidatiforme completa (MHC) acompanhadas no Centro de Doenças Trofoblásticas de Botucatu, entre 1998 e 2005. Os títulos da hCG sérica foram mensurados quinzenalmente em todas as pacientes. Curvas individuais de regressão da hCG das 105 pacientes foram estabelecidas. A comparação entre a curva de regressão normal estabelecida em nosso serviço com as curvas individuais da hCG foi usada no rastreamento e diagnóstico (platô/ascensão) de NTG. O número de semanas pós-esvaziamento quando a hCG excedeu o limite normal foi comparado com o número semanas em que a hCG apresentou platô/ascensão. RESULTADOS: das 105 pacientes com MHC, 80 apresentaram remissão espontânea (RE) e 25 desenvolveram NTG. Das 80 pacientes com RE, 7 (8,7%) apresentaram, inicialmente, dosagem da hCG acima do normal, mas, no devido tempo, alcançaram a remissão. Todas as 25 pacientes com NTG apresentaram desvio da curva normal da hCG em 3,8±2,5 semanas e mostraram platô ou ascensão em 8,4±2,9 semanas (p<0,001). CONCLUSÕES: a curva de regressão normal da hCG pós-molar pode ser útil para diagnóstico de NTG.

Curva de absorção de água em sementes de atemóia (Annona cherimola Mill. x Annona squamosa L.) cv. Gefner

O presente trabalho teve o objetivo de caracterizar a curva de absorção de água em sementes de atemóia (Annona cherimola Mill x Annona squamosa L.) cv. Gefner, submetidas a três métodos de embebição: sementes submersas em água destilada (MSSA), sementes entre papel de filtro embebido em água destilada acondicionada em caixa tipo gerbox (MPEA) e teste-padrão (MTP), com sementes mantidas em rolo de papel de filtro umedecido em água destilada. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com 6 tratamentos e 4 repetições de 25 sementes por parcela, constituídos por três métodos de embebição, empregando-se sementes vivas e mortas. O tempo de embebição entre 27; 34 e 47 horas, nos métodos MTP, MPEA e MSSA, representam indicativo para tratamento de sementes, podendo funcionar como tempo mínimo necessário para embebição em solução com reguladores vegetais. Conclui-se que os métodos que caracterizaram as três fases de absorção de água em sementes de atemóia foram o MTP e MPEA com mudança entre as fases I e II após 27 e 34 horas, respectivamente, atingindo a fase III com 234 horas, o que permite determinar o tempo de imersão para tratamentos pré-germinativos.

Usando um voltímetro para medir tempo

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Coronariografia via transradial: curva de aprendizagem, avaliada por estudo multicêntrico

INTRODUÇÃO: A via de acesso femoral tem sido a preferida para os procedimentos diagnósticos e terapêuticos coronarianos, mas apresenta limitações, principalmente relacionadas a complicações vasculares e hemorrágicas. O aces-so transradial é uma técnica mais recentemente empregada com o objetivo principal de diminuir essas complicações, além de produzir maior conforto e redução dos custos de hospitalização, embora com maior curva de aprendizagem. O objetivo deste estudo foi avaliar a realização de coronariografia transradial, executada por operadores sem experiência na técnica, e comparar com a abordagem clássica (Sones e femoral) em termos de sucesso do procedimento e complicações, analisando a influência da curva de aprendizagem. MÉTODO: Estudo multicêntrico realizado em 14 hospitais do interior de São Paulo, no período de um ano. Foram randomizados mil pacientes de maneira equivalente para as técnicas transradial ou clássica. RESULTADOS: A taxa de sucesso em ambos os grupos foi similar (97,8% vs. 98,5%; P = 0,47). No grupo clássico, 95,2% dos procedimentos foram realizados pela técnica de Sones. O número de cateteres utilizados, a duração do procedimento e o tempo de exposição aos raios X foram maiores no grupo transradial (P < 0,001). Não houve diferença quanto às complicações maiores (morte, infarto e acidente vascular cerebral) e quanto às complicações vasculares e hemorrágicas. Os grupos que realizaram mais de 100 procedimentos pela artéria radial (3 centros/5 operadores) obtiveram menor taxa de insucesso (1,6% vs. 3,6%; P = 0,04). CONCLUSÃO: Um período de aprendizagem para a realização de procedimentos pela via transradial mostra-se necessário, porém não se acompanha de menor índice de sucesso, nem tampouco de maior taxa de complicações para os pacientes.

Estudo da recidiva da sobremordida relacionada com a curva de Spee, em pacientes Classe II, divisão 1, na fase pós-contenção

INTRODUÇÃO: a estabilidade dos resultados do tratamento ortodôntico é um assunto muito estudado na literatura, sem respostas conclusivas. A sobremordida, ou trespasse vertical, define-se como a relação vertical entre as bordas incisais dos incisivos superiores e inferiores, apresentando-se como um aspecto importante na avaliação dos resultados do tratamento e sua estabilidade. OBJETIVO: este estudo se propôs a avaliar a recidiva da sobremordida e sua relação com a curva de Spee. METODOLOGIA: a amostra (grupo experimental) constituiu-se de 29 pacientes, de ambos os gêneros, apresentando má oclusão de Classe II, divisão 1, e sobremordida mínima de 3,5mm, tratados com extração dos 4 primeiros pré-molares. Este grupo foi comparado a um grupo controle, com oclusão normal. A amostra faz parte do Arquivo da Disciplina de Ortodontia da FOB-USP. Avaliaram-se as telerradiografias em norma lateral e os modelos de estudo do início, final e 5 anos pós-tratamento e, para o grupo controle, as telerradiografias de dois tempos de avaliação, compatível com o tempo de tratamento do grupo experimental. Para comparação intergrupos, utilizou-se o teste t independente e, para comparação intragrupo, os testes ANOVA e Tukey. Para verificar a relação da recidiva da sobremordida com a curva de Spee, utilizou-se o coeficiente de correlação de Pearson. RESULTADOS: pela análise dos resultados obtidos, observou-se que a sobremordida apresentou uma correção significante durante o tratamento, comparando-se ao grupo controle. Porém, apresentou recidiva significante na fase pós-contenção. CONCLUSÃO: a recidiva da sobremordida apresentou uma correlação significante com a curva de Spee na fase pós-contenção.