Influence de deux milieux séquentiels pour la culture d'embryons sur la production d'hormone gonadotrophine chorionique et de progestérone par des cellules JEG-3 et BeWo [Effects of different embryo development media on hCG and progesterone release by JEG-3 and BeWo cells]

Current in vitro fertilisation (IVF) practice requires synchronisation between the¦environment of cultured oocytes and embryos and the surroundings to what they would have¦been exposed to in vivo. Commercial, sequential media follow this requirement but their exact¦composition is not available. We have compared two widely used IVF culture media systems using¦the two choriocarcinoma cell lines JEG-3 and BeWo. The two hormones hCG and progesterone¦were determined in the culture supernatants as endpoints. In both cell lines, but in a more¦pronounced way in JEG-3, progesterone rather than hCG production was stimulated, and a¦higher hormone release was observed in the fertilisation than in the cleavage media. Differences¦between manufacturers were small and did not favour one system over the other. We conclude¦that both sequential media systems can be equally well used in current IVF laboratory practice.¦© 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Organisation structurale du noyau et de microtubules de cellules de mammifères observés par cryo-microscopie électronique de sections hydratées

RESUME L'architecture nucléaire ainsi que l'ultrastructure des microtubules ont été abondamment étudiées par des méthodes cytochimiques utilisant des échantillons fixés chimiquement, enrobés dans des résines ou fixés à basse température. Les échantillons fixés à basse température pouvant aussi avoir été substitués, déshydratés et enrobés dans des résines pour la plupart hydrophiles. Ici, nous avons étendu ces études en utilisant la microscopie électronique effectuée sur des sections hydratées (CEMOVIS) permettant d'observer les échantillons dans un état le plus proche de leur état natif. De plus, nous avons effectué de la tomographie électronique sur des sections hydratées (TOVIS) afin d'obtenir une vision tridimensionnelle de : 1) la périphérie du noyau et de la région périchromatinienne et 2) de la lumière des microtubules. Concernant l'architecture nucléaire Nos observations montrent que le nucléole et la chromatine condensée sont facilement visualisés grâce à la texture spécifique qu'ils arborent. Au contraire, la visualisation de domaines nucléaires importants et spécialement ceux qui contiennent des ribonucléoprotéines, est rendue difficile, à cause du faible contraste qui caractérise l'espace interchromatinien. Ceci est essentiellement dû à la quantité d'information présente dans le volume de la section qui semble être superposée, lorsque observée sur des micrographies en deux dimensions. La tomographie nous a permis de mieux visualiser les différentes régions du noyau. Les mottes de chromatine condensée sont décorées à leur périphérie (région périchromatinienne), par nombre de fibrilles et granules. Des tunnels d'espace interchromatinien sont occasionnellement observés en train de traverser des régions de chromatine condensée favorisant l'accès aux pores nucléaires. Enfin, nous avons pu, au niveau d'un pore unique, observer la plupart des structures caractéristiques du complexe de pore nucléaire. Concernant l'ultrastructure des microtubules: Nous avons démontré que la polarité d'un microtubule observé in situ en section transversale, par CEMOVIS, est directement déduite de l'observation de la chiralité de ses protofilaments. Cette chiralité, a été établie précédemment comme étant liée à la morphologie des sous unités de tubuline. La tomographie électronique effectuée sur des sections hydratées, nous a permis d'observer les microtubules dans leur contexte cellulaire avec une résolution suffisante pour visualiser des détails moléculaires, comme les monomères de tubuline. Ainsi, des molécules n'ayant pas encore été caractérisées, ont été observées dans la lumière des microtubules. Ces observations ont été effectuées autant sur des cellules observées en coupe par CEMOVIS que sur des cellules congelées dans leur totalité par immersion dans un bain d'éthane liquide. Enfin, nous avons montré que les microtubules étaient aussi de formidables objets, permettant une meilleure compréhension des artéfacts de coupe occasionnés lors de la préparation des échantillons par CEMOVIS. Les buts des études qui seront menées â la suite de ce travail seront de 1) essayer de localiser des domaines nucléaires spécifiques par des approches cytochimiques avant la congélation des cellules. 2) Appliquer des méthodes de moyennage afin d'obtenir un modèle tridimensionnel de la structure du complexe de pore nucléaire dans son contexte cellulaire. 3) Utiliser des approches biochimiques afin de déterminer la nature exacte des particules qui se trouvent dans la lumière des microtubules. ABSTRACT Nuclear architecture as well as microtubule ultrastructure have been extensively investigated by means of different methods of ultrastructural cytochemistry using chemically fixed and resin embedded samples or following cryofixation, cryosubstitution and embedding into various, especially partially hydrophilic resins. Here, we extend these studies using cryoelectron microscopy of vitreous sections (CEMOVIS) which allows one to observe the specimen as close as possible to its native state. Furthermore, we applied cryoelectron tomography of vitreous sections (TOVIS) in order to obtain athree-dimensional view of: 1) the nuclear periphery, and of the perichromatin region, and 2) the microtubule lumen. Concerning the nuclear architecture: Our observations show that nucleoli and condensed chromatin are well recognisable due to their specific texture. Conversely, the visualisation of other important nuclear domains, especially those containing ribonucleoproteins, is seriously hampered by a generally low contrast of the interchromatin region. This is mainly due to the plethora of information superposed in the volume of the section observed on two-dimensional micrographs. Cryoelectron tomography allowed us to better visualise nuclear regions. Condensed chromatin clumps are decorated on their periphery, the perichromatin region, by numerous fibrils and granules. Tunnels of interchromatin space can occasionally be found as crossing condensed chromatin regions, thus, allowing the access to nuclear pores. Finally, we were able to use TOVIS to directly distinguish most of the nuclear pore complex structures, at the level of a single pore. Concerning the microtubule ultrastructure: We have demonstrated that the polarity of across-sectioned microtubule observed in situ by CEMOVIS wás directly deducible from the visualisation of the tubulin protofiíaments' chirality. This chirality has been established before as related to the shape. of the tubulin subunits. Cryoelectron tomography allowed us to observe microtubules in their cellular context at a resolution sufficient to resolve molecular details such as their tubulin monomers. In this way, uncharacterized molecules were visualised in the microtubule lumen. These observations were made either on samples prepared by CEMOVIS or plunge freezing of whole cells. Finally, we have shown that microtubules are also relevant objects for the understanding of cutting artefacts, when performing CEMOVIS. The goals of our further studies will be to: 1) try to speciifically target different nuclear domains by cytochemical approaches in situ, prior to cryofixation. 2) Apply averaging methods in order to obtain a three-dimensional model of the nuclear pore complex at work, in its cellular context. 3) Use biochemical analysis combined in a second time to immunocytochemical approaches, to determine the exact nature of the microtubule's luminal particles.

Rôle du transporteur de glucose GLUT2 dans les mécanismes centraux de glucodétection impliqués dans le contrôle de la sécrétion du glucagon et de la prise alimentaire

Résumé Rôle du transporteur de glucose GLUT2 dans les mécanismes centraux de glucodétection impliqués dans le contrôle de la sécrétion du glucagon et de la prise alimentaire. Les mécanismes centraux de glucodétection jouent un rôle majeur dans le contrôle de l'homéostasie glucidique. Ces senseurs régulent principalement la sécrétion des hormones contre-régulatrices, la prise alimentaire et la dépense énergétique. Cependant, la nature cellulaire et le fonctionnement moléculaire de ces mécanismes ne sont encore que partiellement élucidés. Dans cette étude, nous avons tout d'abord mis en évidence une suppression de la stimulation de la sécrétion du glucagon et de la prise alimentaire en réponse à une injection intracérébroventriculaire (i.c.v.) de 2-déoxy-D-glucose (2-DG) chez les souris de fond génétique mixte et déficientes pour le gène glut2 (souris RIPG1xglut2-/-). De plus, chez ces souris, l'injection de 2-DG n'augmente pas l'activation neuronale dans l'hypothalamus et le complexe vagal dorsal. Nous avons ensuite montré que la ré-expression de GLUT2 dans les neurones des souris RIPG1xg1ut2-/- ne restaure pas la sécrétion du glucagon et la prise alimentaire en réponse à une injection i.c.v. de 2-DG. En revanche, l'injection de 2-DG réalisée chez les souris RIPG1xg1ut2-/- ré-exprimant le GLUT2 dans leurs astrocytes, stimule la sécrétion du glucagon et l'activation neuronale dans le complexe vagal dorsal mais n'augmente pas la prise alimentaire ni l'activation neuronale dans l'hypothalamus. L'ensemble de ces résultats démontre l'existence de différents mécanismes centraux de glucodétection dépendants de GLUT2. Les mécanismes régulant la sécrétion du glucagon sont dépendants de GLUT2 astrocytaire et pourraient être localisés dans le complexe vagal dorsal. L'implication des astrocytes dans ces mécanismes suggère un couplage fonctionnel entre les astrocytes et les neurones adjacents « sensibles au glucose ». Lors de cette étude, nous avons remarqué chez les souris RIPG1xg1ut2-/- de fond génétique pur C57B1/6, que seul le déclenchement de la prise alimentaire en réponse à l'injection i.p. ou i.c.v. de 2-DG est aboli. Ces données mettent en évidence que suivant le fond génétique de la souris, les mécanismes centraux de glucodétection impliqués dans la régulation de la sécrétion peuvent être indépendants de GLUT2. Summary. Role of transporter GLUT2 in central glucose sensing involved in the control of glucagon secretion and food intake. Central glucose sensors play an important role in the control of glucose homeostasis. These sensors regulate general physiological functions, including food intake, energy expenditure and hormones secretion. So far the cellular and molecular basis of central glucose detection are poorly understood. Hypoglycemia, or cellular glucoprivation by intraperitoneal injection of 2-deoxy¬glucose (2-DG) injection, elicit multiple glucoregulatory responses, in particular glucagon secretion and stimulation of feeding. We previously demonstrated that the normal glucagon response to insulin-induced hypoglycemia was suppressed in mice lacking GLUT2. This indicated the existence of extra-pancreatic, GLUT2-dependent, glucose sensors controllling glucagon secretion. Here, we have demonstrated that the normal glucagon and food intake responses to central glucoprivation, by intracerebroventricular (i.c.v.) injections of 2-DG, were suppressed in mice lacking GLUT2 (RIPG1xglut2-/- mice) indicating that GLUT2 plays a role in central glucose sensing units controlling secretion of glucagon and food intake. Whereas it is etablished that glucose responsive neurons change their firing rate in response to variations of glucose concentrations, the exact mechanism of glucose detection is not established. In particular, it has been suggested that astrocytic cells may be the primary site of glucose detection and that a signal is subsequently transmitted to neurons. To evaluate the respective role of glial and neuronal expression of GLUT2 in central glucodetection, we studied hypoglycemic and glucoprivic responses following cellular glucoprivation in RIPG1xglut2-/- mice reexpressing the transgenic GLUT2 specifially in their astrocytes (pGFAPG2xRIPG1xglut2-/- mice) or their neurons (pSynG2xRIPG1xglut2-/- mice). The increase of food intake after i.p. injection of 2-DG in control mice was not observed in the pGFAPG2xRIPG1xglut2-/- mice. Whereas a strong increase of glucagon secretion was observed in control and pGFAPG2xRIPG1xglut2-/- mice, not glucagonemic response was induced in pSynG2xRIPG1xglut2-/- mice. Our results show that GLUT2 reexpression in glial cells but not in neurons restored glucagon secretion and thus present a strong evidence that glucose detection and the control of glucagon secretion require a coupling between glial cells and neurons. Furthermore, these results show the existence of differents glucose sensors in CNS. Résumé tout public. Rôle du transporteur de glucose GLUT2 dans les mécanismes centraux de glucodétection impliqués dans le contrôle de la sécrétion du glucagon et de la prise alimentaire. Chez les mammifères, en dépit des grandes variations dans l'apport et l'utilisation du glucose, la glycémie est maintenue à une valeur relativement constante d'environ 1 g/l. Cette régulation est principalement sous le contrôle de deux hormones produites par le pancréas l'insuline et le glucagon. A la suite d'un repas, la détection de l'élévation de la glycémie par le pancréas permet la libération pancréatique de l'insuline dans le sang. Cette hormone va alors permettre le stockage dans le foie du glucose sanguin en excès et diminuer ainsi la glycémie. Sans insuline, le glucose s'accumule dans le sang. On parle alors d'hyperglycémie chronique. Cette situation est caractéristique du diabète et augmente les risques de maladies cardiovasculaires. A l'inverse, lors d'un jeûne, la détection de la diminution de la glycémie par le cerveau permet le déclenchement de la prise alimentaire et stimule la sécrétion de glucagon par le pancréas. Le glucagon va alors permettre la libération dans le sang du glucose stocké par le foie. Les effets du glucagon et de la prise de nourriture augmentent ainsi les concentrations sanguines de glucose pour empêcher une diminution trop importante de la glycémie. Une hypoglycémie sévère peut entraîner un mauvais fonctionnement du cerveau allant jusqu'à des lésions cérébrales. Contrairement aux mécanismes pancréatiques de détection du glucose, les mécanismes de glucodétection du cerveau ne sont encore que partiellement élucidés. Dans le laboratoire, nous avons observé, chez les souris transgéniques n'exprimant plus le transporteur de glucose GLUT2, une suppression de la stimulation de la sécrétion du glucagon et du déclenchement de la prise alimentaire en réponse à une hypoglycémie, induite uniquement dans le cerveau. Dans le cerveau, le GLUT2 est principalement exprimé par les astrocytes, cellules gliales connues pour soutenir, nourrir et protéger les neurones. Nous avons alors ré-exprimé spécifiquement le GLUT2 dans les astrocytes des souris transgéniques et nous avons observé que seule la stimulation de la sécrétion du glucagon en réponse à l'hypoglycémie est restaurée. Ces résultats mettent en évidence que la sécrétion du glucagon et la prise alimentaire sont contrôlées par différents mécanismes centraux de glucodétection dépendants de GLUT2.

Controlling cytokinesis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe : the role of dma1; and ubc8

ABSTRACT The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is a single celled eukaryote that has proved to be an excellent model system for the study of cell cycle control. S. pombe cells are rod shaped and grow mainly by elongation at their tips. They divide by formation of medially-placed cell wall, or septum, which cleaves the cell in two. Once the cell commits itself to mitosis the site of division is determined by formation of an acto-myosin based contractile ring at the cell cortex. The ring is assembled in stages throughout mitosis and contracts at the end of anaphase, coincident with spindle disassembly. The contraction, but not the assembly, of the ring requires the signal transduction network called the septation initiation network or SIN. The core components of the SIN are three protein kinases (cdc7p, sidl p and sid2p) and their regulatory subunits (spg1 p, cdcl4p and moblp, respectively). Signalling is dependent upon the nucleotide status of the GTPase spgl p, which is regulated by a two-component GAP protein, cdc16p-byr4p. Signalling is thought to emanate from the spindle pole body, where core SIN components are anchored to a scaffold comprised of sid4p and cdc11p. Activation of the SIN requires the protein kinase plolp, which also has additional roles in mitosis. SIN signalling is tightly regulated to assure the proper co-ordination of mitosis and cytokinesis. Ectopic activation of the SIN in interphase can uncouple septum formation from mitosis, while deregulated SIN signalling leads to formation of cells with multiple septa that do not cleave. Regulators of SIN activity are therefore of considerable interest. This study has concentrated upon two of these, dma1 and ubc8. I have demonstrated that dmal becomes essential when SIN signalling is activated. This leads me to propose a tripartite model for regulation of the SIN during the mitotic cell cycle. Increased expression of dma1 inhibits SIN signalling and prevents cell division. To identify potential targets and mediators of this, multicopy suppressors of dma1 toxicity were identified. One of these, ubc8, is the subject of this thesis. Genetic and molecular analyses are consistent with the view that ubc8p acts as an inhibitor of the SIN Localisation of ubc8p indicates that it is a nuclear protein. The ubc8 gene is not essential, but in its absence cells are unable to prevent septum formation if progression through mitosis is impaired. These data suggest that it may be an effector of the spindle assembly checkpoint. Together, these data shed new light upon the mechanisms by which cytokinesis is regulated in S. pombe. RESUME La levure Schizosaccharomyces pombe est un eucaryote unicellulaire qui est un bon système d'étude du cycle cellulaire. Les cellules de S. pombe sont en forme de bâtonnets et poussent par allongement aux deux bouts. Elles se divisent en formant une paroi au milieu de la cellule, qui s'appelle un septum et qui sépare la cellule en deux. Une fois que la cellule est engagée dans la mitose, le site de clivage est déterminé par la formation d'un anneau contractile d'acto-myosine au niveau du cortex cellulaire. Cet anneau est séquentiellement assemblé au cours de la mitose et se contacte à la fin de l'anaphase, au moment où le fuseau mitotique et désassemblé. La contraction, mais non pas l'assemblage, de l'anneau dépend d'un réseau de signalisation appelé septation initiation netvvork' ou SIN. Les composants centraux du SIN sont trois kinases (cdc7, sidi et sid2) ainsi que leurs sous-unités régulatrices (spgl, cdc14 et mob1, respectivement). La signalisation dépend du nucléotide rattaché à la GTPase spgl qui est régulée par une GAP comprenant deux sous-unités cdc16 et byr4. La signalisation est présumée provenir du pôle du fuseau où les composants centraux du SIN sont ancrés grâce à un échafaudage comprenant sid4 et cdcl 1. La signalisation est étroitement régulée pour assurer une bonne coordination entre mitose et cytokinèse. Une activation ectopique du SIN en interphase peut découpler la formation du septum de la mitose, engendrant des cellules à multiples septa qui ne sont pas clivés. C'est pourquoi les régulateurs du SIN sont d'un intérêt considérable. Cette étude se concentre autour de deux ces régulateurs, dma1 et ubc8. J'ai montré que dma1 devient essentiel quand la signalisation du SIN est activée. Ceci m'amène à proposer un modèle en trois parties pour la régulation du SIN durant la mitose. Une expression élevée de dma1 inhibe la signalisation du SIN et empêche la division cellulaire. Afin d'identifier des substrats ou médiateurs potentiels de la toxicité de dma1, des supresseurs en copies multiples ont été identifiés. Un de ces supresseurs, ubc8, constitue le deuxième sujet de cette thèse. Les études génétiques et moléculaires suggèrent un rôle inhibiteur du SIN par ubc8. Ubc8p est une protéine nucléaire, non essentielle, mais en son absence les cellules ne peuvent pas restreindre la fomation du septum, lorsque la progression de la mitose est perturbée. Les données suggèrent que ubc8 pourrait être un effecteur de point de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique. Prises dans leur ensemble, ces données apportent un nouvel éclairage sur les mécanismes de régulation de la cytokinèse dans S. pombe.

The role of nonhematopoietic MHC class II expression in immune responses and tolerance

Si les rôles fonctionnels de diverses cellules immunitaires infiltrant des tissus enflammés sont assez bien compris, par contre, étonnamment, on connaît bien moins la capacité des cellules non hématopoïétiques résidant dans des tissus, à moduler l'activité biologique des cellules immunitaires immigrantes, et donc le résultat de la réponse immunitaire. La présentation des antigènes, dans le contexte des molécules du CMH de classe II (CMHII) à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA) professionnelles à une sous- population de lymphocytes T, est cruciale pour le développement des réponses immunitaires protectives spécifiques de l'antigène. En général, l'expression de CMHII est réservée aux CPAs. Toutefois, au cours des pathologies inflammatoires spécifiques d'organe, telles que l'auto-immunité ou la maladie inflammatoire de l'intestin, l'expression de CMHII est également induite par la cytokine interféron (IFN)-y sur des cellules non hématopoïétiques qui résident dans des tissus enflammés. Les conséquences de ce phénomène sont encore peu comprises. Dans cette étude, nous avons utilisé une souche de souris génétiquement modifiées, qui n'a pas la capacité d'induire l'expression de CMHII sur les cellules non hématopoïétiques, mais a maintenu la régulation normale d'expression de CMHII sur les cellules hématopoïétiques. Nous avons appliqué ces souris à différents modèles d'inflammation intestinale et à un modèle de maladie qui imite la maladie auto-immune de l'inflammation du muscle cardiaque (myocardite) chez l'homme. Nous avons pu montrer que, au cours de l'inflammation intestinale, l'expression du CMHII nonhématopoïétique, ou encore l'expression du CMHII par les cellules épithéliales de l'intestin, confère une protection contre la maladie, en réduisant les cellules immunitaires inflammatoires et en augmentant les cellules Τ régulatrices anti-inflammatoires. Ces résultats pourraient expliquer l'échec des traitements d'anti-IFN-γ dans les maladies intestinales inflammatoires chez l'homme. En revanche, dans la myocardite auto-immune, nos résultats indiquent que la présentation d'antigènes par les cellules non hématopoïétiques du coeur est nécessaire pour l'apparition de la pathologie cardiaque, comme nos souris sont résistantes à la maladie. Toutefois, cela n'est pas dû à un défaut d'activation des lymphocytes T, car les lymphocytes Τ des souris mutantes sont parfaitement capables de promouvoir la maladie après le transfert adoptif dans des animaux de type naturel. Nos résultats suggèrent que, durant les maladies inflammatoires spécifiques d'organe, la présentation d'antigène par des cellules non hématopoïétiques module et contribue au résultat de la réponse immunitaire d'une manière opposée, conférant soit la protection contre la maladie ou sa promotion. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à des thérapies qui prennent en compte la contribution de la présentation d'antigènes par les cellules non hématopoïétiques, au cours des maladies inflammatoires spécifiques d'organe. - Les molécules du CMH de classe II (CMHII) sont fondamentales pour la présentation des antigènes aux lymphocytes Τ CD4+, car elles permettent le développement des réponses immunitaires spécifiques de l'antigène. Il est largement admis que l'expression de CMHII est réservée aux cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Cependant, dans des conditions inflammatoires, l'expression de CMHII est en principe également induite par l'interféron (IFN)-y sur les cellules non hématopoïétiques, telles que les cellules épithéliales et les cardiomyocytes. Une controverse existe jusqu'à présent au sujet de la fonction de cette présentation d'antigènes non professionnelle, pour savoir si elle favorise la tolérance ou l'immunité dépendante des lymphocytes Τ in vivo. Pour répondre à cette question, nous avons testé des souris qui ne sont pas capables d'induire l'expression du CMHII sur les cellules non hématopoïétiques (souris PIV-/- K14 CIITA Tg) parmi différents modèles murins de pathologies inflammatoires, à savoir les modèles de vaccination pour induire des réponses spécifiques d'antigènes des lymphocytes B, plusieurs modèles de colite et un modèle de myocardite auto-immune expérimental (EAM). Pour cela, nous avons administré à ces souris un modèle de colite atténuée, induite par une infection chronique à Helicobacter hepaticus et par l'administration d'anticorps monoclonaux bloquant le récepteur de l'interleukine (IL)-10 (anti-IL-10R). Dans ce système, nous avons pu observer que l'expression abrogée de CMHII a aggravé la colite bactérienne, soit par les cellules non hématopoïétiques, soit exclusivement par les cellules épithéliales intestinales (CEI) dans un autre modèle murin (souris plV_fl/fl vil-Cre Tg). Ce phénotype du côlon a été associé à une augmentation des fréquences de cellules immunitaires innées, de lymphocytes Th1 CD4+, et d'expression des cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, y compris l'IFN-γ. Notamment, l'expression défectueuse de CMHII non hématopoïétique a également réduit les cellules Τ régulatrices (Treg) Forkhead box P3 (FoxP3)+, sans influencer les fréquences des cellules innées lymphoïdes et des cellules Th17. Ces résultats suggèrent un rôle tolérogène de CEIs CMHII+ qui contribue à l'homéostasie immunitaire intestinale. En revanche, dans le modèle d'EAM, les souris ayant subi une ablation de CMHII non hématopoïétique étaient résistantes à l'induction de la maladie, alors que la progression de la pathologie cardiaque, dans les souris de type naturel ou hétérozygotes, a été accompagnée par une régulation positive de l'expression de CMHII du myocarde. Cependant, l'inflammation cardiaque pourrait être transférée de manière adoptive depuis des souris amorcées PIV-/- K14 CIITA Tg vers des souris de type naturel, indiquant l'absence de défaut intrinsèque d'amorçage des cellules T CD4+ dans notre modèle de souris. Ces observations impliquent un rôle à jouer pour des cellules CMHII+ non hématopoïétiques résidentes du coeur, dans la promotion active de ΙΈΑΜ. En conclusion, nos résultats, provenant de diverses pathologies inflammatoires spécifiques d'organes, suggèrent un rôle complexe et divergent, soit tolérogène, soit immunogène/ pathologique, pour l'expression de CMHII non hématopoïétique au cours des pathologies inflammatoires. L'expression non professionnelle de CMHII semble influencer le résultat des réponses immunitaires en fonction de différents facteurs, tels que le tissu cible, le(s) type(s) de cellule(s) non hématopoïétique(s) participante(s) et l'origine de l'inflammation. Nos résultats pourraient potentiellement ouvrir la voie à des applications thérapeutiques, qui tiennent compte de la contribution de la présentation d'antigènes par des CPAs non professionnelles, au cours de l'inflammation spécifique d'organe. - MHC class II (MHCII) molecules are fundamental for the presentation of antigens to CD4+ Τ cells, allowing the development of antigen-specific immune responses. It is widely accepted that MHCII expression is restricted to antigen-presenting cells (APC). However, under inflammatory conditions, MHCII expression is typically also induced by interferon (IFN)-y on nonhematopoietic cells such as epithelial cells and cardiomyocytes. So far, it remains controversial whether this nonprofessional antigen-presentation function promotes CD4+ Τ cell-dependent tolerance or immunity in vivo. To address this issue, we utilised mice which lack inducible MHCII expression on nonhematopoietic cells (pIV-/- K14 CIITA Tg mice) in different mouse models of inflammatory pathologies, namely immunisation models to induce antigen-specific Β cell responses, various colitis models and a model of experimental autoimmune myocarditis (EAM). In an attenuated model of colitis induced by chronic Helicobacter hepaticus infection and treatment with anti-interleukin (IL)-10 receptor (anti-IL-10R) monoclonal blocking antibody, we observed that abrogated MHCII expression by nonhematopoietic cells or, in an alternative tamoxifen-inducible mouse model (plV_fl/fl vil-Cre Tg mice), exclusively by intestinal epithelial cells (IEC), exacerbated bacterial-driven colitis, which was associated with increased colonic frequencies of innate immune cells, CD4+ Th1 cells and expression of proinflammatory cytokines and chemokines, including IFN-γ. Notably, defective nonhematopoietic MHCII expression also resulted in reduced Forkhead box P3 (FoxP3)+ regulatory Τ (Treg) cells without influencing innate lymphoid cell (ILC) and Th17 cell frequencies. These findings suggest a tolerogenic role of MHClT lECs to contribute to intestinal immune homeostasis. In contrast, in the EAM model, mice ablated of nonhematopoietic MHCII were resistant to disease induction, whereas progression of cardiac pathology in WT and heterozygous control mice was accompanied by upregulation of myocardial MHCII expression. However, cardiac inflammation could be adoptively transferred from primed pIV-/- K14 CIITA Tg mice into WT mice, indicating no intrinsic defect of CD4+ Τ activation in our mouse model. These observations imply a role for MHCIT heart-resident nonhematopoietic cells in actively promoting EAM. In conclusion, our findings from different organ-specific inflammatory pathologies suggest a complex and diverging role - either tolerogenic or immunogenic/ pathologic - for nonhematopoietic MHCII expression during inflammatory pathologies: Nonprofessional MHCII expression appears to influence the outcome of immune responses depending on 7 factors such as the target tissue, participating non hematopoietic cell type(s) and the origin of inflammation. Our findings may potentially open the way to therapeutic applications taking into account the contribution of antigen presentation by nonprofessional, tissue-resident APCs during organ-specific inflammation.

Rôle des cellules souches épithéliales de la cornée et de leur micro-environnement dans le traitement des destructions de la surface oculaire [Darwin or Lamarck? Understanding the ocular surface and its normal or abnormal differentiation in order to cure ocular surface destruction with corneal opacification].

According to the World Health Organization, 5.1% of blindnesses or visual impairments are related to corneal opacification. Cornea is a transparent tissue placed in front of the color of the eye. Its transparency is mandatory for vision. The ocular surface is a functional unit including the cornea and all the elements involved in maintaining its transparency i.e., the eyelids, the conjunctiva, the lymphoid tissue of the conjunctiva, the limbus, the lacrymal glands and the tear film. The destruction of the ocular surface is a disease caused by : traumatisms, infections, chronic inflammations, cancers, toxics, unknown causes or congenital abnormalities. The treatment of the ocular surface destruction requires a global strategy including all the elements that are involved in its physiology. The microenvironnement of the ocular surface must first be restored, i.e., the lids, the conjunctiva, the limbus and the structures that secrete the different layers of the tear film. In a second step, the transparency of the cornea can be reconstructed. A corneal graft performed in a healthy ocular surface microenvironnement will have a better survival rate. To achieve these goals, a thorough understanding of the renewal of the epitheliums and the role of the epithelial stem cells are mandatory.

Cellules souches cancéreuses et futures modalités thérapeutiques du cancer. [Cancer stem cells and future therapeutic implications].

A growing body of evidence indicates that a subpopulation of tumor cells, the so-called cancer stem cells (CSCs), drive tumor growth and metastasis and preclude therapy efficiency. CSCs have been isolated in virtually all type of tumors. These findings may have important consequences for clinical prognostic. Current cancer research aims to unravel the CSCs' unique biological mechanisms. The development of new CSCs-targeted treatments shed therefore new hopes in improving cancer therapy.

RTM mould design and construction for a DN 50 PN 16 flansch

The objective of this project consists of designing and constructing a RTM mould for a loose flange of glass fibre reinforced plastic (GRP). The design phase has the mission to realise a quality and simple design of the RTM mould, with the objective to obtain an easy and economic phase of construction and the more possible great characteristics of the loose flange. In fact this RTM mould will be a mould prototype, which will be developed in the future to obtain an RTM mould able to support a loose flange production. Therefore when more steps are developed in this project, then the future objective will be near

Nouveautés dans la reconstruction cutanée: cultures de cellules et substituts dermiques et revue de la littérature.

La prise en charge de patients souffrant de brûlures profondes et étendues reste un défi important pour les chirurgiens reconstructeurs. Ceci est d'autant plus vrai que les grands progrès réalisés dans la réanimation assurent actuellement la survie de patients brûlés sur plus de 90% de leur surface corporelle. De ce fait la reconstruction moderne a dû innover et est devenue une chirurgie complexe nécessitant un plan stratégique impliquant des matériaux et des méthodes chirurgicales multiples adaptées à chaque situation clinique. Ce type de prise en charge nécessite aussi la collaboration étroite et coordonnée de plusieurs équipes hautement spécialisées. Le taux de survie ainsi que de la qualité de vie de ces patients sont alors nettement améliorés. De même nous observons clairement que le nombre de complications secondaires telles que les rétractions et les instabilités cicatricielles ont également diminué de façon significative.Mots-clés: brûlure, greffe, culture, substitut dermique, reconstruction.

The role of Toll-like Receptor (TLR) 9 in the development of a T-helper (Th)1/Th2 response in the murine model of infection with " Leishmania major "

1.1 SUMMARY The role of the non-specific innate immune system is as important as the elaboration of the adaptive immune system in the initiation of an immune response to pathogens. The role of the Toll-like receptors (TLRs) in the innate immune response to virus and bacterial pathogens is widely recognised, however, little is known about the role of TLRs in host defence against eukaryotic pathogens. Immunologic investigations on the marine model of infection with Leishmania major (L. major) have correlated the outcome of the disease with expansion of different subsets of CD4+ cells, designated Th1 and Th2. The resistance of C57BL/6, CBA and C3H/He mice is linked with an IL-12 driven Th1 response. In BALB/c mice the susceptibility correlates with an IL-4 driven Th2 response. The initial event promoting the development of a Th1 or Th2 response still remains elusive. Recently, the contribution of the TLR signalling pathway in the innate and acquired immune response to infection with the intracellular protozoan parasite L. major has been demonstrated. Thus, the purpose of this study is to determine whether TLRs may play a role in influencing the outcome of the infection by directing the development of a Th1 or a Th2 response during infection with L, major parasites, in resistant C57BL/6 and susceptible BALB/c mice, respectively. We demonstrated that MyD88, the major TLR adaptor molecule is necessary for C57BL/6 to develop a resistant Th1 response following L. major infection. Our data show the essential role of MyD88 in the establishment of a protective Th1 response. We subsequently aimed to determine which TLRs may be involved in the protective response. Since TLR2 and TLR4 have shown to have a potential role for Leishmania recognition, we analysed the course of infection in TLR2 and TLR4 deficient mice on a C57BL/6 resistant background following L. major infection. Our results clearly demonstrate that TLR2 or TLR4 aze dispensable to control the outcome of the disease as the TLR2 and TLR4 knockout mice developed a protective Th1 response. With the aim of determining a potential TLR candidate important in the initiation of the Thl response, we assessed the mRNA expression of different TLRs (TLR1 to TLR9) using quantitative real-time RT-PCR at different time points during the first week of infection. The results clearly showed an upregulation of TLR7 and TLR9 mRNA expression during the early phase of infection in resistant C57BL/6 mice but not in susceptible BALB/c mice. To provide in vivo evidence for the role for, these TLRs in the outcome of cutaneous leishmaniasis, studies using TLR7 and TLR9 deficient mice on a resistant C57BL/6 background were performed. The TLR7 deficient mice developed a resistance phenotype that was comparable with C57BL/6 wild type mice. Thus, the presence of TLR7 is not indispensable for the development of a Th1 response and resistance to infection. On the contrary, TLR9 deficient mice on the C57BL/6 resistant background showed high variability in the outcome of the disease. Although some mice behave as resistant C57BL/6 mice, half of them developed high lesion following infection and showed a decrease in IFN-γ production and an increase in IL-4 as compared to wild type mice. These results suggest that TLR9 may be involved in the control of infection. To test the hypothesis that regulatory T cells (Treg) are playing a role in the high variability in the disease outcome in TLR9 deficient mice, depletion of CD4+CD25+ T cells with a specific antibody three days before infection with L. major were performed Interestingly, these treated mice developed large lesions, low IL-4 and decreased IFN-γ producion when compared to untreated mice. A better understanding of the mechanism by which Treg cells influence the outcome of the disease in TLR9 deficient mice following L. major infection is currently under investigation. Altogether, this study demonstrates the importance of TLR9 in the induction of a protective T'h1 response, a process that is involved in the resolution of the lesion induced by L. major infection. 1.2 RÉSUMÉ Le rôle de la réponse immunitaire innée a longtemps été négligé quant à l'impact qu'elle pourrait avoir dans l'initiation d'une réponse immune adaptative efficace dirigée contre un pathogène. Si l'importance des récepteurs Toll-like (TLR) du système inné dans la reconnaissance des virus et bactéries a été démontrée, son rôle dans la défense contre les pathogènes eucaryotes reste encore très élusif. Récemment, il a été montré que les voies de signalisation provenant de l'activation des TLRs pouvaient initier la réponse immunitaire innée et adaptative après une infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major). Dans un modèle marin d'infection avec L. major alors que la plupart des souches de souris telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1) induite par IL-12, peu de souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse Th2 induite par IL-4. La différentiation Th1/Th2 est un événement qui prend place de manière définitive lors de la première semaine après infection. Les événements précoces promouvant le développement d'une réponse Th1 ou Th2 n'étant pas connus, l'objectif de ce travail a été de démontrer un rôle des TLRs dans l'initiation d'une réponse immune innée et adaptative suite à l'infection par L. major. Nous avons démontré que MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, est nécessaire pour que les souris résistantes C57BL/6 développent une réponse Th1 protectrice. L'importance du rôle de TLR2 et TLR4 dans la reconnaissance du parasite Leishmania ayant été démontrée, nous avons privilégié l'analyse de la réponse immunitaire suite à une infection in vivo de souris déficiente en TLR2 ou TLR4 sur un fond génétique résistant. Les résultats obtenus montrent que la présence de ces récepteurs n'est pas indispensable pour le contrôle de l'infection et la polarisation d'une réponse Th1 caractéristique de la résistance à L. major. Cependant d'autres TLRs peuvent aussi activer la voie de signalisation MyD88 dépendante. L'expression de l'ARNm des différents TLRs dans les ganglions drainant de souris sensibles et résistantes pendant la première semaine d'infection a été déterminée par PCR quantitative en temps réel. Les résultats obtenus montrent que l'ARNm de TLR7 et TLR9 était régulé positivement suite à l'infection par L. major chez les souris résistantes C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était détectable chez les souris sensibles BALB/c. Le rôle des récepteurs TLR7 et TLR9 a donc été évalué par l'infection par L. major des souris déficientes en TLR7 et TLR9 sur fond génétique C57BL/6. Nos résultats ont clairement démontré que les souris déficientes en TLR7 montrent une réponse immunitaire identique à celle des souris résistantes C57BL/6, signifiant que TLR7 n'est pas indispensable au développement d'une Th1 ainsi qu'au contrôle de la parasitémie. Paz contre, les souris déficientes en TLR9 sur un fond génétique résistant ont montré une grande variabilité dans la réponse à l'infection. En effet, la moitié des souris deviennent sensibles à l'infection, ceci étant associé à une diminution dans la production d'IFN-γ et à une augmentation de la production d'IL-4. Ces résultats suggèrent que TLR9 est impliqué dans le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Cependant les résultats avec les souris déficientes en TLR9 montrant une grande hétérogénéité et une balance Th1/Th2 instable, nous avons émis l'hypothèse que les cellules T régulatrices pouvaient être impliquées dans ce phénomène. Nous avons effectivement constaté qu'après déplétion des cellules CD4+CD25+, les souris déficientes en TLR9 développent des lésions aussi grandes que les souris BALB/c après infection par L. major. Cependant le nombre de parasites reste le même que chez les souris C57BL/6. De plus la production d'IL-4 ainsi que celle d'IFN-γ reste extrêment bas. Les mécanismes régulateurs impliqués dans ce processus sont en cours d'analyse. Ce travail met en évidence l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. 1.3 RESUME POUR UN LARGE PUBLIC La leishmaniose est une maladie parasitaire répandue dans le monde entier et touchant plus de 88 pays. L'incidence mondiale de la leishmaniose cutanée et de 1 à 1,5 million de nouveaux cas par année. Plus de 12 millions de personnes sont affectées par la maladie et 350 millions de personnes sont une population à risque. Un modèle marin d'infection avec Leishmania major (L. major) a été établi qui reproduit plusieurs tableaux cliniques observés dans le cas de la leishmaniose cutanée chez l'homme. L'analyse de la réponse immunitaire dans les souris infectées par L. major a permis de distinguer deux groupes : les souris de la plupart des souches telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1), alors que quelques souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse de type Th2. La réponse immune adaptative dans le modèle d'infection avec L. major à été largement étudiée. Cependant, les événements précoces déterminants pour le développement d'une réponse Th1 ou Th2 restent encore très flous. Récemment, plusieurs publications ont montré que les récepteurs Toll-like (TLR) peuvent contribuer à l'initiation de la réponse immunitaire lors d'une infection avec le parasite intracellulaire L. major. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié le rôle de MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, dans la réponse immune suite à une infection avec L. major. En l'absence de MyD88, les souris normalement résistantes à l'infection avec L. major deviennent sensibles et développent des lésions importantes. Ces souris ne sont plus capables de développer une réponse Thl, normalement caractéristique de leur phénotype résistant. Nous avons ensuite tenté de comprendre quels TLRs, plus précisément, pouvait être impliqué dans ce processus. Malgré quelques évidences démontrant que TLR2 et TLR4 pouvaient avoir un rôle important dans l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative à Leishmania, nous avons montré que, in vivo après infection avec L. major, la déficience d'un de ces récepteurs n'était pas suffisante à faire basculer la réponse immunitaire. Les souris C57BL/6 déficient en TLR2 ou TLR4 peuvent parfaitement contrôler l'évolution de la maladie. De plus, ces souris, malgré l'absence de TLR2 ou TLR4, sont capables de monter une parfaite réponse Thl. Etant donné que TLR2 et TLR4 n'étaient pas essentiels pour la résistance à la maladie, nous avons analysé les TLRs, parmi les 12 décrits qui pouvaient être indispensables au développement d'une réponse de type Th1 associée à la résistance à l'infection par Leishmania. Nos expériences ont montré que l'expression de l'ARN messager (ARNm) de TLR7 et TLR9 était modulée suite à l'infection par L. major chez la souris résistante C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était visible chez les souris sensible BALB/c. Pensant que ces TLRs pourraient jouer un rôle dans la réponse immunitaire au parasite, nous avons étudié l'évolution de l'infection dans les souris déficientes en TLR7 et TLR9. Nos résultats ont clairement démontré que TLR7 n'était pas indispensable à la résistance au parasite alors que l'absence de TLR9 avait des conséquences radicales sur le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Ce travail révèle ainsi l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. Il est a noté que nos résultats sont en accord avec le fait que les motifs CpG, qui sont des immunostimulateurs interagissant avec le TLR9, ont une activité adjuvante importante dans la préparation de vaccins contre la leishmaniose. Une meilleure compréhension des mécanismes immunologiques impliquant le TLR9 dans la reconnaissance du parasite est alors indispensable pour le développement de vaccins thérapeutiques efficaces.

Novel immunotherapeutic strategies against human papillomavirus type 16 (HPV 16) induced lesions and cervical cancer

RESUME Le cancer du col de l'utérus, deuxième cause de mort par cancer chez la femme, a pu être associé à une infection par plusieurs types de virus du Papillome Humain (HPV), et en particulier HPV 16. Les vaccins prophylactiques sont efficaces à prévenir le cancer du col utérin alors que les lésions de haut grade sont généralement traitées par ablation chirurgicale et par d'éventuels traitements additionnels. Les risques de récurrence liés aux ablations et le taux de mortalité (50%) lié au cancer, démontrent le besoin de développer des stratégies alternatives afin de cibler les lésions précancéreuses. A ce jour, les vaccins thérapeutiques ont démontré peu de résultats cliniques, contrastant avec les régressions de tumeurs ectopiques observées après vaccination dans des modèles murins avec tumeurs associées à HPV. L'induction de réponses immunitaires protectrices dans la muqueuse génitale semble être cruciale pour l'efficacité des vaccins thérapeutiques HPV et évaluer leur efficacité dans un modèle murin avec tumeurs-HPV génitales représente un pré-requis important avant de procéder à des études cliniques. Par conséquent, nous avons établi un modèle murin orthotopique où des tumeurs se développent dans (a muqueuse génitale après une instillation intra-vaginale (i.vag) de cellules tumorales exprimant les oncogènes E6/E7 d'HPV 16 et transduites par un vecteur lentiviral codant la luciferase afin de suivre le développement de ces tumeurs in vivo par imagerie. La caractérisation histologique a démontré que les tumeurs grandissaient dans l'épithélium vaginal et en accord avec leur localisation, des cellules Τ CD8 spécifiques à E7 induites par la tumeur n'étaient détectées que dans la muqueuse génitale et les ganglions drainants. Une infiltration de cellules Τ régulatrices a aussi été mise en évidence, empêchant la régression spontanée de ces tumeurs. Par conséquent, ce modèle devrait être plus adéquat pour tester des stratégies thérapeutiques, étant donné qu'il partage certaines similarités immunologiques avec les lésions génitales naturelles causées par HPV. Etant donné que les oncogènes E6 et E7 d'HPV sont nécessaires à la maintenance du phénotype cancéreux des cellules cervicales, elles représentent des antigènes cibles pour la vaccination thérapeutique. Nous avons démontré que des souris immunisées par voie sous-cutanée (s.c.) avec une dose d'un vaccin à base de polypeptide E7 d'HPV 16 et d'adjuvants, présentaient de nombreuses cellules Τ CD8 sécrétant de l'IFN-γ spécifiquement à E7 dans leurs organes lymphatiques mais également dans la muqueuse génitale. De plus, le manque de corrélation entre les réponses spécifiques mesurées dans la périphérie et dans la muqueuse génitale souligne la nécessité et l'importance de déterminer les réponses immunitaires localement là où les lésions dues à HPV se développent. Si une vaccination par voie muqueuse est plus propice à traiter/régresser des infections génitales/tumeurs que le voie parentérale est un sujet débattu. Nos données montrent que seule la voie s.c. était capable de régresser la quasi totalité des tumeurs génitales chez la souris bien que des réponses CD8 spécifiques à E7 similaires étaient mesurées dans la muqueuse génitale après des vaccinations intra-nasale et i.vag. Afin d'augmenter la réponse spécifique au vaccin dans la muqueuse génitale, des immunostimulants ont été administrés par voie i.vag après vaccination. Nous avons démontré qu'une application i.vag d'agonistes des Toll like receptors après une vaccination s.c. induisait de manière significative une augmentation des cellules Τ CD8 sécrétant de l'IFN-γ spécifiquement à E7 dans la muqueuse génitale. Plus précisément et concernant les CpG et Poly l:C, l'effet était probablement associé à une attraction locale des cellules Τ CD8 et deuxièmement dépendait respectivement des voies de signalisation TLR9 et TLR3/Mda5. Finalement, cette stratégie combinatoire a permis de régresser des grosses tumeurs génitales chez la souris, suggérant qu'une telle immunothérapie pourrait adéquatement traiter des lésions dues à HPV chez les femmes. SUMMARY Cervical cancer is the second leading cause of cancer mortality in women worldwide and results from an infection with a subset of Human Papillomavirus (HPV), HPV 16 representing the most prevalent type. The available prophylactic vaccines are an effective strategy to prevent cervical cancer while already established high grade lesions usually require surgical ablation of lesion with possible additional treatments. Recurrence risks linked to conventional ablations and the high mortality (50%) related to cervical cancer demonstrate the need for alternative strategies like immunotherapies to target pre¬cancerous lesions. Until now, therapeutic vaccines only showed limited clinical results, which strongly contrast with the regression of ectopic tumors observed in the available murine HPV tumor models after vaccination. Induction of protective immune responses in the genital mucosa (GM) may be crucial for efficacy of HPV therapeutic vaccines and evaluating their efficacy in a murine model with genital HPV- tumors represents an important prerequisite for clinical trials. Thus, we have here established an orthotopic mouse model where tumors in the GM develop after an intravaginal (i.vag) instillation of HPV 16 E6/E7 oncogenes-expressing tumor cells transduced with a luciferase encoding lentivirus vector for in vivo imaging of tumor growth. Histological characterization showed that tumor grew within the vaginal epithelium and according to their mucosal location tumor- induced E7-specific CD8 Τ cells were restricted to the GM and genital draining lymph nodes together with high Τ regulatory cells infiltrates preventing spontaneous regression. Consequently, sharing several immunological similarities with natural genital HPV lesions, this novel genital tumor model may be more adequate to test therapeutic strategies. As E6 and/or E7 HPV oncogenes expression is required for the maintenance of the cancerous phenotype of cervical cells, they represent target antigens for therapeutic vaccination. We reported that mice subcutaneously (s.c.) immunized once with an adjuvanted HPV 16 E7 polypeptide vaccine harbored high E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells in their lymphoid organs and more importantly in the GM. In addition, the lack of correlation between specific responses measured in the periphery with those measured in the GM highlighted the necessity and relevance to determine the immune responses locally where HPV 16-induced lesions develop. Whether a mucosal route of immunization is better to treat/regress genital infections/tumors than parenteral immunization is still debated. Our data shows that although similar E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells responses were measured in the GM upon mucosal routes of E7 vaccine delivery (nasal and vaginal immunizations), only the s.c immunization was able to regress at least all genital tumors in mice. To further increase the vaccine-specific responses in the GM, immunostimulatory agents were i.vag administrated after vaccination. We demonstrated that a single i.vag application of toll like receptor (TLR) agonists after a s.c. E7 vaccination induced a significant increase of E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells in the GM. More precisely, regarding CpG and Poly l:C, the effect is most probably associated with a local attraction of total CD8 Τ cells and secondly depends on TLR9 and TLR3/Mda5 signaling pathways, respectively. Finally, this combinatorial strategy induced tumor regression in mice harboring large genital tumors, suggesting that such an immunotherapy could be adequate to treat HPV-induced lesions in women.