Progressive erosion of genetic and epigenetic variation in callus-derived cocoa (Theobroma cacao) plants

Relatively little is known about the timing of genetic and epigenetic forms of somaclonal variation arising from callus growth. We surveyed for both types of change in cocoa (Theobroma cacao) plants regenerated from calli of various ages, and also between tissues from the source trees. For genetic change, we used 15 single sequence repeat (SSR) markers from four source trees and from 233 regenerated plants. For epigenetic change, we used 386 methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) markers on leaf and explant (staminode) DNA from two source trees and on leaf DNA from 114 regenerants. Genetic variation within source trees was limited to one slippage mutation in one leaf. Regenerants were far more variable, with 35% exhibiting at least one mutation. Genetic variation initially accumulated with culture age but subsequently declined. MSAP (epigenetic) profiles diverged between leaf and staminode samples from source trees. Multivariate analysis revealed that leaves from regenerants occupied intermediate eigenspace between leaves and staminodes of source plants but became progressively more similar to source tree leaves with culture age. Statistical analysis confirmed this rather counterintuitive finding that leaves of ‘late regenerants’ exhibited significantly less genetic and epigenetic divergence from source leaves than those exposed to short periods of callus growth.

A novel regeneration system for a wild passion fruit species (Passiflora cincinnata Mast.) based on somatic embryogenesis from mature zygotic embryos

The objective of the present work was to induce somatic embryogenesis from zygotic embryos of Passiflora cincinnata Masters. Zygotic embryos formed calli on media with different concentrations of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4.5 mu M benzyladenine (BA) after 30 days of in vitro culture. A concentration of 18.1 mu M 2,4-D resulted in the largest number of somatic embryos. Embryogenic calli were yellowish and friable, forming whitish proembryogenic masses. Morphologically, embryogenic cells were small and had large nuclei and dense cytoplasm, whereas non-embryogenic cells were elongated, with small nuclei and less dense cytoplasm. Calli cultured under white light on basal Murashige and Skoog`s medium with activated charcoal produced embryos in all developmental stages. There were differences among the treatments, with some leading to the production of calli with embryos and some only to callus formation. Some abnormalities were associated with somatic embryos, including fused axes, fused cotyledons and polycotyledonary embryos. Production of secondary somatic embryos occurred in the first cycle of primary embryo development. Secondary embryos differentiated from the surface of the protodermal layer of primary embryos with intense cell proliferation, successive mitotic divisions in the initial phase of embryoid development, and a vascular system formed with no connection to the parental tissue. This secondary embryogenic system of P. cincinnata is characterized by intense proliferation and maintenance of embryogenic competence after successive subcultures. This reproducible protocol opens new prospects for massive propagation and is an alternative to the current organogenesis-based transformation protocol.

In vitro morphogenesis and cell suspension culture establishment in Piper solmsianum C. DC. (Piperaceae)

In vitro morphogenesis and cell suspension culture establishment in Piper solmsianum C. DC. (Piperaceae)). Piper solmsianum is a shrub from Southeast Brazil in which many biologically active compounds were identified. The aim of this work was to establish a cell suspension culture system for this species. With this in mind, petiole and leaf explants obtained from in vitro plantlets were cultured in the presence of different plant growth regulator combinations (IAA, NAA, 2,4-D and BA). Root and indirect shoot adventitious formation, detected by histological analysis, was observed. Besides the different combinations of plant growth regulators, light regime and the supplement of activated charcoal (1.5 mg.l(-1)) were tested for callus induction and growth. Cultures maintained in light, on a 0.2 mg.l(-1) 2,4-D and 2 mg.l(-1) BA supplemented medium, and in the absence of activated charcoal, showed the highest calli fresh matter increment. From a callus culture, cell suspension cultures were established and their growth and metabolite accumulation studied. The achieved results may be useful for further characterization of the activated secondary metabolites pathways in in vitro systems of P. solmsianum.

Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

DESENVOLVIMENTO DE CALOS em EXPLANTES DE CUPUAÇUZEIRO (Theobroma grandiflorum Schum.) em FUNÇÃO da CONCENTRAÇÃO DE AUXINAS E do MEIO LÍQUIDO

Objetivou-se estudar o efeito da concentração de auxina e do meio líquido sobre o desenvolvimento de calos de cupuaçuzeiro. Segmentos de eixos embrionários e cotilédones, obtidos de frutos de cupuaçu dos tipos Mamorana e Redondo, foram cultivados em 4 meios de cultura diferentes: 1) meio MS (50%), suplementado com 2,4-D (1; 2; 4; 8 mg/L); 2) sais N6 (SIGMA) (4 g/L), acrescidos de 2,4-D (0; 2; 4 mg/L) e ANA (0; 3; 5 mg/L); 3) igual ao anterior, suplementado apenas com ANA (3 mg/L); e 4) meio MS, acrescido com ANA (1 mM). Calos com aspecto branco e brilhante foram observados em segmentos de eixos embrionários e cotilédones, cultivados nas menores concentrações de meio 1 (1 e 2 mg/L), enquanto nas maiores concentrações (4 e 8 mg/L) se observou a formação de calos e massa calosa branco-opaca, em eixos embrionários e em segmentos cotiledonares, estas estruturas tornaram-se escuras dentro de oito semanas. Usando o meio 2, um grande número de raízes foram formadas, enquanto o mesmo meio suplementado apenas com ANA (3; 5 mg/L) originou uma massa calosa. A combinação de ANA e 2,4-D, 3 e 2 mg/L, respectivamente, promoveu a formação de calos brancos e raízes. A transferência das culturas para meio líquido, sem regulador de crescimento, promoveu aumento de tamanho dos explantes e escurecimento dos mesmos. O cultivo desses explantes no meio 3 resultou no aparecimento de calos amarelos, com aspecto friável, que permaneceram com a mesma aparência no meio 4.

Indução de embriogênese somática em cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.)

Folhas jovens de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.) foram empregadas para indução de embriogênese somática, as quais foram cultivadas inicialmente em meio MS suplementado com 6,0 mg/L BAP e 0,5 mg/L AIA (meio de estabelecimento), seguindo-se o cultivo em meio MS suplementado com 2,20 mg/L TDZ (meio de indução). A região da nervura mostrou intumescimento três dias após inoculação no meio de estabelecimento, o qual foi seguido pela formação de cachos de calos. As massas calosas foram transferidas para o meio de indução, e as estruturas com características pró-embriogênicas puderam ser observadas após uma semana. Estudos de microscopia eletrônica de varredura revelaram estruturas com características de embriões somáticos no meio com TDZ.

Indução de calos embriogênicos em explantes de cupuaçuzeiro

Objetivou-se a indução de calos embriogênicos em cupuaçuzeiro, em função do tipo de explante e meio de cultura. Foram testados como explantes, segmentos cotiledonares e eixos embrionários divididos em três partes: região da plúmula, radícula e hipocótilo. Os explantes foram cultivados em 2 diferentes meios de cultura: 1) MS suplementado com 2,4-D (1 mg L-1) e Cinetina (0,25 mg L-1); 2) MS acrescido de ANA (5 mg L-1) e Cinetina (0,25 mg L-1). Constatou-se que a região do hipocótilo foi a parte mais responsiva do eixo embrionário, formando calos com aspecto branco e friável. As auxinas testadas nos meios não estimularam o processo embriogênico em calos de cupuaçuzeiro.

Ultrastructural analysis of in vitro direct and indirect organogenesis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

New insights into the in vitro organogenesis process: the case of Passiflora

We present evidences that ultrastructural electron microscope findings are valuable ways to understand the in vitro regeneration process, in particular in the yellow passion fruit. Shoot-regeneration was induced in hypocotyl and leaf-derived explants using 4.44 mu M BAP, and the entire organogenic process was analyzed using conventional histology, scanning and transmission electronic microscopy. Both direct and indirect regeneration modes were observed in hypocotyl explants, but only direct regeneration occurred in leaf-derived cultures. In the direct pathway from both explant types, meristemoids developed into globular structures, here called protuberances. The peripheral meristematic layers of the protuberances displayed ultrastructural characteristics indicative of a high metabolic activity, and only these cells originated shoots and leaf primordia, the latter being frequent when leaf explants were used. Moreover, the peripheral cells of the protuberances derived from leaf explants lost adhesion during the culture, diminishing the regeneration rates. We recommend the use of hypocotyls as a source of explant to obtain shoots as well as a genetic transformation system for the yellow passion fruit. However, the direct pathway is preferred because a type of amitosis occurred in the peripheral cells of hypocotyl-derived calli, which has the potential to result in genetic instability of the regenerating plants/tissue.

Physiological and genomic variations in rice cells recovered from direct immersion and storage in liquid nitrogen

The use of cryoprotectants and slow cooling rates are routine procedures for the cryopreservation of plant cell lines. However, our results with rice (Oryza sativa L,, ev. Taipei 309) show that calli can be cryopreserved by direct immersion and stored in liquid nitrogen without any cryoprotection, the efficiency of recovery using this method, as well as a conventional method was generally increased with a previous abscisic acid (ABA) treatment. Following cryopreservation, calli demonstrated some differences with respect to unfrozen calli of the same lines, Thus, resistance to freezing stress (- 20 degrees C for 2 h) increased significantly in all lines tested, irrespective of their pre-incubation with ABA, Calli that had been directly stored in liquid nitrogen also demonstrated a higher competence for genetic transformation than their unfrozen counterparts, as indicated by the transient gene expression levels obtained after particle bombardment, These differences might lead to further biotechnological applications, A genetic analysis of amplified DNA polymorphisms was performed with three independent lines that had been subjected to four combinations of ABA treatment and direct immersion in liquid nitrogen, At the loci screened with the randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers tested, the genetic variations among lines and among calli of the same line appear to bd more related to tissue-culture-induced somaclonal variation than to cryoselection.

In vitro propagation of Maytenus ilicifolia (Celastraceae) as potential source for antitumoral and antioxidant quinomethide triterpenes production. A rapid quantitative method for their analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography

Cell culture of Maytenus ilicifolia were established in order to produce and to quantify the antitumoral and antioxidant quinonemethide triterpenes. In vitro calli were induced from leaf explants of native plants and cultured in semi-solid medium under controlled conditions of humidity, temperature and photoperiod. The quinonemethide triterpenes showed maximum accumulation in the logarithmic phase growth of the cell culture. A rapid, sensitive and reliable reverse-phase HPLC method was used for quantitative determination of the antitumoral and antioxidant quinonemethide triterpenes, 22β-hydroxymaytenin and maytenin in callus of Maytenus ilicifolia. Well resolved peaks with good detection response and linearity in the range 1.0 - 100 μg/mL were obtained. This quantitative work was performed by an external standard method.

Indução e detecção de azadiractina em calos de Azadirachta indica Adr. Juss. (Nim)

Pós-graduação em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) - FCAV

A dehydrorotenoid produced by callus tissue culture and wild plant roots of Boerhaavia coccinea

“Um desidro-rotenóide produzido por cultura de calos e por raízes de plantas silvestres de Boerhaavia coccinea”. Cultura de calos foram estabelecidos de folhas e galhos finos de plântula de B. coccinea produzida in vitro e analisada para isofl avonóide. A quantificação do 6,9,11-triidroxi-6a,12a-desidro-rotenóide isolado das raízes de B. coccinea P Miller, coletada em seu habitat natural, e do mesmo rotenóide produzido na cultura de células estão descritos neste artigo. A análise rotineira em CLAE mostrou que a cultura de calos produziu o mesmo isoflavonóide encontrado nas raízes da planta do campo. A quantidade do metabólito secundário produzido in vitro foi de 955.35

Morfogênese in vitro de nim a partir de explantes cotiledonares

Azadirachta indica A. Juss, popularmente conhecido como nim, é uma espécie arbórea que se destaca por possuir substâncias de ação inseticida, fungicida, bactericida e nematicida. Sementes de nim foram inoculadas em meio de cultura WPM (Wood Plant Medium) contendo diferentes concentrações de ácido giberélico (GA₃) (0; 3,0; 6,0; 9,0; e 12,0 mg L^-1). Após 30 dias, cotilédones obtidos a partir de plântulas germinadas in vitro foram inoculados em meio WPM suplementado com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (0,0; 1,0; 2,0; e 3,0 mg L^-1) e, ou, 6-benzilaminopurina (BAP) (0,0; 1,0; 2,0; e 3,0 mg L^-1). As culturas foram incubadas no escuro, a 28 ºC. Os calos formados foram avaliados com base na sua coloração e textura, e três subcultivos foram realizados mensalmente em meio WPM contendo 2,0 mg L^-1 BAP, na presença de luz. A cada 30 dias, avaliou-se o número de brotos formados a partir dos calos subcultivados. Entre os meios testados, o mais apropriado para germinação in vitro de nim foi o WPM na ausência de GA₃. Explantes cotiledonares cultivados em WPM suplementado com 2,0 mg L^-1 de BAP promoveram a maior formação de calos com potencial morfogênico. Quando esses calos foram transferidos para meio de composição similar, obteve-se alta formação de brotações até o terceiro subcultivo.

Adventitious shoot induction from leaf segments in Anthurium andreanum is affected by age of explant, leaf orientation and plant growth regulator

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)