Extraction and purification of triterpenic acids from eucalypt bark

A indústria da pasta e do papel é um sector importante da economia mundial, particularmente a que assenta em espécies de Eucalyptus. No entanto, essas indústrias geram quantidades significativas de correntes secundárias de subprodutos e resíduos de biomassa que podem ser exploradas em aplicações de valor acrescentado em vez de serem queimadas para produção de energia. Um exemplo nobre pode ser a produção de ácidos triterpénicos com estruturas dos tipos lupano, oleanano e ursano, dada a sua abundância em alguns destes resíduos, em particular na casca, adotando o conceito de biorrefinaria integrada numa fábrica de pasta. Estes compostos são conhecidos pelas suas inúmeras actividades biológicas, por exemplo, antioxidante, anti-inflamatória e antitumoral, e podem encontrar aplicações em produtos de elevado valor, tais como cosméticos, nutracêuticos ou farmacêuticos. Neste sentido, o estudo das potencialidades das cascas das espécies de eucalipto mais exploradas enquanto fontes de compostos triterpénicos é um tópico relevante. Por conseguinte, foram analisados e comparados em pormenor os teores e composições em ácidos triterpénicos (TTAs) das cascas externas de várias espécies de eucalipto (E. globulus, E. grandis, E. urograndis, E. maidenii e E. nitens). Os teores dos principais TTAs identificados nestas espécies variaram entre 4.5 g/kg no E. urograndis e 21.6 g/kg no E. nitens. Observou-se que as cascas externas de Eucalyptus de zonas temperadas e Mediterrânicas, nomeadamente E. nitens e E. globulus, são mais ricas em TTAs que as espécies de regiões tropicais e subtropicais. Além disso, a casca externa do E. globulus é claramente a mais rica em ácidos com estruturas do tipo ursano enquanto a do E. nitens é a mais rica em ácidos do tipo oleanano e lupano. Estes resultados levaram-nos a estudar a extração dos TTAs da casca de Eucalyptus, bem como a sua posterior concentração e purificação, a qual foi efetuada por extração sólido-líquido convencional combinada com a precipitação de solutos, e por extração com fluidos supercríticos (SFE). No que diz respeito à primeira abordagem referida, foi desenvolvido neste trabalho um método patenteado que permite obter extratos enriquecidos em TTAs das cascas de eucalipto baseado em tecnologias disponíveis no imediato. Em relação à segunda abordagem, e de forma a apostar em processos de baixo impacto ambiental exigidos pelas biorrefinarias do futuro, a SFE surge como uma opção natural. Assim, foi efetuada a SFE da casca caduca do E. globulus com dióxido de carbono puro e modificado para recuperar a fração de TTAs, e os resultados foram comparados com os obtidos por extração em Soxhlet com diclorometano. Foram realizados estudos preliminares sobre a influência da pressão (100-200 bar), a adição de co-solvente (0, 5 e 8% m/m de etanol), e operação em múltiplos passos a fim de avaliar a aplicabilidade da alternativa supercrítica para a sua produção eficiente e selectiva. Os resultados destacaram a influência da pressão e o importante papel resumo (cont.) desempenhado pelo co-solvente neste processo, cujo efeito foi mais relevante do que o aumento da pressão em várias dezenas de bar. Este trabalho foi depois otimizado, usando o planeamento factorial de experiências e a metodologia de superfícies de resposta, para analisar a influência da temperatura (40-60 ºC), pressão (100-200 bar), e teor de etanol (0.0-5.0% m/m) na recuperação dos TTAs e respectiva concentração nos extractos. Nestes intervalos, as melhores condições de operação encontradas foram 200 bar, 40 °C e 5% de etanol, para as quais os modelos de regressão estatisticamente validados previram um rendimento de extração de 1.2% com 50% de concentração em TTAs, correspondendo ao rendimento em TTAs de 5.1 g/kg de casca e uma recuperação de 79.2% comparativamente ao valor do Soxhlet. Os TTAs livres e acetilados apresentaram tendências de extracção bastante distintas devido às suas diferentes afinidades para o CO2 causadas pelas diferentes polaridades: os derivados acetilados aproximam-se de um patamar máximo a cerca de 200 bar e 5% de etanol, enquanto a extração dos TTAs livres apresenta uma tendência sempre crescente no intervalo de condições estudado. Foram também medidas curvas cumulativas de SFE da casca do E. globulus de forma a analisar o comportamento cinético do processo em termos de rendimento total, rendimento em TTAs, rendimento em TTAs livres, rendimento em TTAs acetilados, e concentração dos TTAs nos extractos. Foi analisada a influência da pressão, temperatura, teor de co-solvente e caudal do dióxido de carbono sobre as respostas anteriores. Os dados experimentais foram modelados com os modelos Logístico, de Dessorção, de Placa Plana Simples, e de Difusão. Na globalidade, os resultados confirmaram que a pressão e o teor de etanol têm um efeito significativo sobre as curvas de extração, os rendimentos finais e as concentrações dos extratos, e mostraram a presença de limitações externas à transferência de massa em alguns ensaios. Mais uma vez, as famílias individuais de TTAs livres e acetilados apresentaram diferentes tendências de extracção. A modelação permitiu-nos confirmar não só o importante papel desempenhado pela difusão intraparticular na SFE, mas também a contribuição da resistência no filme em alguns ensaios. Após a análise de todos os resultados, foi efetuado um ensaio em duas etapas em série, possibilitando o enriquecimento do teor em TTAs no extracto devido às diferentes condições adotadas em cada etapa. Por último, um éster metílico de um ácido triterpénico do tipo oleanano - morolato de metilo - foi identificado pela primeira vez enquanto componente da casca de Eucalyptus na casca externa do Eucalyptus grandis x globulus, onde ocorre em teores elevados. A sua extração com CO2 supercrítico foi também realizada, visando a conceção de uma alternativa de extração ambientalmente benigna para este composto. A 200 bar e 60 ºC, a remoção do morolato de metilo atingiu um patamar às 6 h para 5.1 kg h-1 de CO2 / kg de casca. Em geral, e de forma semelhante à SFE da casca do E. globulus, os TTAs acetilados foram mais significativamente extraídos quando comparados com os seus ácidos livres, o que está diretamente relacionado com a natureza menos polar destas moléculas. O trabalho apresentado nesta tese é uma contribuição para a valorização de uma corrente de biomassa com baixo valor na indústria de pasta em duas vertentes complementares. Por um lado, aumentou o conhecimento da composição lipofílica das cascas de Eucalyptus spp. com interesse comercial para a produção de pasta, destacando o seu potencial enquanto fontes de ácidos triterpénicos. Por outro lado, foram desenvolvidos dois processos alternativos e facilmente integráveis numa fábrica de pasta para a sua exploração a partir da casca: um baseado em tecnologias convencionais bem estabelecidas a nível industrial, prevendo a sua aplicação a curto prazo, e um outro baseado na SFE, seguindo as tendências das futuras biorrefinarias.

Caesium, potassium and ammonium distributions in different organs of tropical plants

In the present work the distribution of ions in aboveground plant parts was studied in order to establish the suitability of using radiocaesium as a tracer for the plant absorption of nutrients, such as potassium (K(+)) and ammonium (NH(4)(+)). We present the results for the distributions of (137)Cs, (40)K and NH(4)(+) from four tropical plant species: lemon (Citrus aurantifolia), orange (Citrus sinensis), guava (Psidium guajava) and chili pepper (Capsicum frutescens). Activity concentrations of (137)Cs and (40)K were measured by gamma spectrometry and concentrations of free NH(4)(+) ions by a colorimetric method. Similarly to potassium and ammonium, caesium showed a high mobility within the plants, exhibiting the highest values of concentration in the growing parts of the tree (fruits, new leaves, twigs, and barks). A significant correlation between activity concentrations of (137)Cs and (40)K was observed in these tropical plants. The K/Cs discrimination ratios were approximately equal to unity in different compartments of each individual plant, suggesting that caesium could be a good tracer for (40)K in tropical woody fruit species. Despite the similarity observed for the behaviour of caesium and ammonium in the newly grown plant compartments, (137)Cs was not well correlated with NH(4)(+). Significant temporal changes in the NH(4)(+) concentrations were observed during the development of fruits, while the (137)Cs activity concentration alterations were not of great importance, indicating, therefore, that Cs(+) and free NH(4)(+) ions could have distinct concentration ratios for each particular plant organ. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Proteomic analysis reveals suppression of bark chitinases and proteinase inhibitors in citrus plants affected by the citrus sudden death disease

Citrus sudden death (CSD) is a disease of unknown etiology that greatly affects sweet oranges grafted on Rangpur lime rootstock, the most important rootstock in Brazilian citriculture. We performed a proteomic analysis to generate information related to this plant pathogen interaction. Protein profiles from healthy, CSD-affected and CSD-tolerant stem barks, were generated using two-dimensional gel electrophoresis. The protein spots were well distributed over a pI range of 3.26 to 9.97 and a molecular weight (MW) range from 7.1 to 120 kDa. The patterns of expressed proteins on 2-DE gels made it possible to distinguish healthy barks from CSD-affected barks. Protein spots with MW around 30 kDa and pI values ranging from 4.5 to 5.2 were down-regulated in the CSD-affected rootstock bark. This set of protein spots was identified as chitinases. Another set of proteins, ranging in pI from 6.1 to 9.6 with an MW of about 20 kDa, were also suppressed in CSD-affected rootstock bark; these were identified as miraculin-like proteins, potential trypsin inhibitors. Downregulation of chitinases and proteinase inhibitors in CSD-affected plants is relevant since chitinases are well-known pathogenesis-related protein, and their activity against plant pathogens is largely accepted.

Baker v The Queen & Fardon v Attorney General for the State of Queensland

In 2004, the High Court of Australia had cause to revisit its 1996 decision in Kable, as well as to consider the nature of judicial power as it relates to the deprivation of liberty, outside of the parameters of conventional criminal sentencing. The resulting decisions of Fardon and Baker demonstrate the lack of constitutional protections afforded to people who become the focus of governmental campaigns to be "tough on crime". The so-called "Kable principle", as construed by the High Court in 2004, may prove to be the "constitutional watch dog that barks but once".

Species-specific characteristics and individual variation of the bark call produced by male Australian fur seals (Arctocephalus pusillus doriferus)

Australian fur seals Arctocephalus pusillus doriferus are colonial breeding animals forming dense social groups during the breeding season. During this time, males establish and defend territories through physical conflicts, stereotyped posturing and vocalisations. While vocalisations are suggested to play an important role in male recognition systems, it has received little attention. Recordings of nine adult male Australian fur seals were made during the 2000 and 2001 breeding seasons at Kanowna Island (39° 10’S, 146° 18' E), Bass Strait, Australia. The in-air bark vocalisations of territory-holding males were used to characterise the Bark Call and to determine whether males produce individually distinct calls, which could be used as a basis for vocal recognition. Seventeen frequency and temporal variables were measured from a total of 162 barks from nine individual males. The Bark Series was more reliably classified (83%) to the correct caller compared to the Bark Unit. This was assigned with less certainty (68%), although the classification was still relatively high. Findings from this study indicate that there is sufficient stereotypy within individual calls, and sufficient variation between them, to enable vocal recognition in male Australian fur seals.

The behavioural response of Australian fur seals to motor boat noise

Australian fur seals breed on thirteen islands located in the Bass Strait, Australia. Land access to these islands is restricted, minimising human presence but boat access is still permissible with limitations on approach distances. Thirty-two controlled noise exposure experiments were conducted on breeding Australian fur seals to determine their behavioural response to controlled in-air motor boat noise on Kanowna Island (39°10′S, 146°18′E). Our results show there were significant differences in the seals' behaviour at low (64–70 dB) versus high (75–85 dB) sound levels, with seals orientating themselves towards or physically moving away from the louder boat noise at three different sound levels. Furthermore, seals responded more aggressively with one another and were more alert when they heard louder boat noise. Australian fur seals demonstrated plasticity in their vocal responses to boat noise with calls being significantly different between the various sound intensities and barks tending to get faster as the boat noise got louder. These results suggest that Australian fur seals on Kanowna Island show behavioural disturbance to high level boat noise. Consequently, it is recommended that an appropriate level of received boat sound emissions at breeding fur seal colonies be below 74 dB and that these findings be taken into account when evaluating appropriate approach distances and speed limits for boats.

Mutagênese induzida por flavonóides presentes do decocto das cascas da aroeira (Schinus terebinthifolius, Raddi)

The decoction of Brazilian pepper tree barks (Schinus terebinthifolius, Raddi), is used in medicine as wound healing and antiinflamatory. Once extracts from this plant are used for acceleration of scar s process, it is important to study their mutagenic and genotoxic potential. In previous works in our laboratory, it was observed mutagenicity caused by the decoction when in high concentrations. Among the chemical compounds of this plant that could be able to induce mutation, the flavonoids were the only group that was referred to have either an oxidant or antioxidant potential. The flavonoids were isolated, purified and quantified by adsorptive column chromatography under silica gel, bacterial and in vitro genotoxic tests were realized to determine if the flavonoids were the responsible agents for this mutagenicity found. The tests realized with plasmidial DNA were indicative that the flavonoids are probably genotoxic, due to the presence of correlation between increase of the flavonoid concentration and in plasmidial DNA double strand breakage visualized in agarose gel, as well as they were capable to generated abasic sites shown by the in vitro treatment with exonuclease III. The same tests with plasmidial DNA in the presence of copper [10 µM] and of a Tris-HCl pH 7.5 [10 µM] buffer were realized with the isolated flavonoids to determine if there would be or not participation of reactive oxygen species (ROS). The transformation of plasmidial DNA in different bacterial strains proficient and deficient in DNA repair enzymes in the presence or not of a Tris-HCl buffer, suggests that the enzymes that repair oxidative lesions are necessary to repair the lesions generated by the flavonoids and that ROS are generated and are necessary to promote the lesions. Bacterial tests with Escherichia coli strains of the CC collection (deficient or not for DNA repair enzymes), showed that the flavonoids are able to increase the frequency of mutations, mainly in strains mutated in repair enzymes (MutM, MutY-glicosylases and double mutant), suggesting that these agents are responsible for the enhancement in the mutation rate. In order to determine the mutation spectrum caused by the flavonoids of the Brazilian pepper tree stem bark, plasmidial DNA previously treated with the flavonoids were transformed in bacterial strains deficient and proficient in the DNA repair enzymes, followed by a blue-white selection with X-gal, DNA amplification by PCR and sequencing the positive mutant clones. Analysis of the mutants obtained from strains CC104, CC104mutM, CC104mutY, CC104mutMmutY, BW9101, BW9109 indicated a predominance of some mutations like G:C to C:G that can be correlated with the origin of 8-oxoG, due to oxidative lesions caused by the flavonoids. So it can concluded that the flavonoid isolated or in fractions enriched on them are genotoxic and mutagenic, and their mutations are predominantly oxidative, mediated by ROS, and the lesions are recognized by the BER system. In this way it is proposed that the flavonoids can act in two different ways to generate the DNA lesion: 1. in a Fenton-like reaction, when the flavonoid are in the presence of metal ions and that together with the water generate ROS that promotes the DNA lesions; 2. in another way the lesions can be generated by the formation of ROS due to the internal chemical structure of the flavonoid molecule due to the quantity and location of hydroxyl groups, and so producing the DNA lesions, those lesions can be directly (suggested by the in vitro experiments) or indirectly done (supported by the experiments using the CC bacterial strains)

Densidade básica da madeira de sete espécies e três clones de eucalipto antes e durante o cultivo de shiitake

Avaliou-se a densidade básica da madeira e casca de sete espécies (E. saligna, E. grandis, E. urophylla, E. camaldulensis, E. citriodora, E. paniculata e E. pellita) e três clones de eucalipto (híbridos de E. grandis x E. urophylla) antes e durante o cultivo das linhagens LE-95/01 e LE-96/18 de shiitake (Lentinula edodes) em toras. Cada linhagem de shiitake foi inoculada em nove toras de cada tipo de eucalipto com 1 m de comprimento e 9 a 14 cm de diâmetro. Assim, o delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 20 tratamentos e 9 repetições, sendo cada repetição correspondente a uma tora. As toras foram mantidas em estufa climatizada, com temperatura de 25 ± 5ºC e umidade relativa do ar entre 60-80% durante 12 meses. Para a determinação da densidade básica, analisaram-se cunhas de discos e cascas de eucalipto recém-cortadas (sem inoculação das linhagens de L. edodes) e em cunhas de discos retirados de toras já inoculadas com as linhagens de L. edodes após 8 e 12 meses de incubação. Verificou-se que a densidade básica da madeira, ao longo do ciclo de cultivo, foi reduzida em todos os tipos de eucalipto.

Análise química da madeira e casca de diferentes tipos de eucalipto antes e durante o cultivo de shiitake em toras

Avaliaram-se a composição química da madeira e da casca de sete espécies (E. saligna E. grandis, E. urophylla, E. camaldulensis, E. citriodora, E. paniculata e E. pellita) e três clones de eucalipto (híbridos de E. grandis x E. urophylla), antes e durante o cultivo das linhagens LE-95/01 e LE-96/18 de shiitake (Lentinula edodes), em toras. Cada linhagem de shiitake foi inoculada em nove toras de cada tipo de eucalipto com 1 m de comprimento e 9 a 14 cm de diâmetro. Assim, o delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 20 tratamentos e nove repetições, sendo cada repetição correspondente a uma tora. As toras foram mantidas em estufa climatizada, com temperatura de 25 ºC ± 5 e umidade relativa do ar entre 60-80%, durante 12 meses. Para a determinação da composição química da madeira, analisaram-se cunhas de discos e cascas de eucalipto recém-cortadas (sem inoculação das linhagens de L. edodes) e cunhas de discos e cascas retirados de toras já inoculadas com as linhagens de L. edodes após oito meses de incubação. Os resultados mostraram diferenças nos teores de holocelulose, lignina e extrativos totais na madeira e casca após o corte e depois de oito meses de incubação nas espécies e clones de eucalipto; o maior índice de decomposição da holocelulose na madeira, ao longo do tempo, ocorreu no E. saligna (5,5%), indicando, assim, ser o mais favorável para o desenvolvimento micelial do L. edodes. Já na casca aconteceu no clone 24 (22,2%). O E. camaldulensis apresentou o maior índice de decomposição da lignina na madeira (6,8%), ao longo do tempo. Já na casca, entre os eucaliptos testados, o E. grandis sofreu a maior decomposição de lignina (21,9%); o L. edodes degradou muito mais a holocelulose e lignina da casca que da madeira, tornando evidente a importância da casca; a casca da maioria dos tipos de eucaliptos apresentou menor teor de holocelulose, maior teor de extrativos totais e teores de lignina semelhantes ou superiores quando comparados com a madeira. O fator tipo de eucalipto (espécies e clones) teve maior efeito que o fator linhagem de L. edodes na degradação da holocelulose e lignina.

Estudo comparativo da constituição nutricional da madeira e casca de espécies e clones de Eucalipto visando o cultivo de Shiitake em toras

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

In vitro and in vivo safety evaluation of Dipteryx alata Vogel extract

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Análise fitoquímica e atividade antimicobacteriana de extratos metanólicos de Jacaranda cuspidifolia Mart. (Bignoniaceae)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Acoustic and psychoacoustic analysis of the noise produced by the police force firearms

Police officers are exposed to impact noise coming from firearms, which may cause irreversible injuries to the hearing system.Aim: To evaluate the noise exposure in shooting stands during gunfire exercises, to analyze the acoustic impact of the noise produced by the firearms and to associate it with tonal audiometry results.Study design: Cross-sectional.Materials and methods: To measure noise intensity we used a digital sound level meter, and the acoustic analysis was carried out by means of the oscillations and cochlear response curves provided by the Praat software. 30 police officers were selected (27 males and 3 females).Results: The peak level measured was 113.1 dB(C) from a .40 pistol and 116.8 dB(C) for a .38 revolver. The values obtained for oscillation and Praat was 17.9 +/- 0.3 Barks, corresponding to the rate of 4,120 and 4,580 Hz. Audiometry indicated greater hearing loss at 4,000Hz in 86.7% of the cases.Conclusion: With the acoustic analysis it was possible to show cause and effect between the main areas of energy excitation of the cochlea (Praat cochlear response curve) and the frequencies of low hearing acuity.

Enraizamento de estacas de Trichilia catigua A. Juss (catigua) em diferentes estações do ano

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Proteomic analysis reveals suppression of bark chitinases and proteinase inhibitors in citrus plants affected by the citrus sudden death disease

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)