Modulation de la néovascularisation post-ischémique en présence de facteurs de risque cardiovasculaire

L’athérosclérose est la principale cause d’infarctus du myocarde, de mort subite d’origine cardiaque, d’accidents vasculaires cérébraux et d’ischémie des membres inférieurs. Celle-ci cause près de la moitié des décès dans les pays industrialisés. Lorsque les obstructions artérielles athérosclérotiques sont tellement importantes que les techniques de revascularisation directe ne peuvent être effectuées avec succès, la sévérité de l’ischémie tissulaire résiduelle dépendra de l’habilité de l’organisme à développer spontanément de nouveaux vaisseaux sanguins (néovascularisation). La néovascularisation postnatale est le résultat de deux phénomènes : la formation de nouveaux vaisseaux à partir de la vasculature existante (angiogenèse) et la formation de vaisseaux à partir de cellules souches progénitrices (vasculogenèse). Notre laboratoire a démontré que plusieurs facteurs de risque associés aux maladies cardiovasculaires (tabagisme, vieillissement, hypercholestérolémie) diminuaient également la réponse angiogénique suite à une ischémie. Cependant, les mécanismes précis impliqués dans cette physiopathologie sont encore inconnus. Un point commun à tous ces facteurs de risque cardiovasculaire est l’augmentation du stress oxydant. Ainsi, le présent ouvrage visait à élucider l’influence de différents facteurs de risque cardiovasculaire et du stress oxydant sur la néovascularisation. Nos résultats démontrent que l’exposition à la fumée de cigarette et le vieillissement sont associés à une diminution de la néovascularisation en réponse à l’ischémie, et que ceci est au moins en partie causé par une augmentation du stress oxydant. De plus, nous démontrons que les acides gras dérivés de la diète peuvent affecter la réponse à l’ischémie tissulaire. La première étude du projet de recherche visait à évaluer l’impact de l’exposition à la fumée de cigarette sur la néovascularisation post-ischémique, et l’effet d’une thérapie antioxydante. L’exposition à la fumée de cigarette a été associée à une réduction significative de la récupération du flot sanguin et de la densité des vaisseaux dans les muscles ischémiques. Cependant, une récupération complète de la néovascularisation a été démontrée chez les souris exposées à la fumée de cigarette et traitées au probucol ou aux vitamines antioxydantes. Nous avons démontré qu’une thérapie antioxydante administrée aux souris exposées à la fumée de cigarette était associée à une réduction significative des niveaux de stress oxydant dans le plasma et dans les muscles ischémiques. De plus, les cellules endothéliales progénitrices (EPCs) exposées à de l’extrait de fumée de cigarette in vitro présentent une diminution significative de leur activité angiogénique (migration, adhésion et incorporation dans les tissus ischémiques) qui a été complètement récupérée par le probucol et les vitamines antioxydantes. La deuxième étude avait pour but d’investiguer le rôle potentiel de la NADPH oxydase (Nox2) pour la modulation de la néovascularisation post-ischémique dans le contexte du vieillissement. Nous avons trouvé que l’expression de la Nox2 est augmentée par le vieillissement dans les muscles ischémiques des souris contrôles. Ceci est associé à une réduction significative de la récupération du flot sanguin après l’ischémie chez les vieilles souris contrôles comparées aux jeunes. Nous avons aussi démontré que la densité des capillaires et des artérioles est significativement réduite dans les muscles ischémiques des animaux vieillissants alors que les niveaux de stress oxydant sont augmentés. La déficience en Nox2 réduit les niveaux de stress oxydant dans les tissus ischémiques et améliore la récupération du flot sanguin et la densité vasculaire chez les animaux vieillissants. Nous avons aussi démontré que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et adhésion à des cellules endothéliales matures) est significativement diminuée chez les souris vieillissantes comparée aux jeunes. Cependant, la déficience en Nox2 est associée à une récupération de l’activité fonctionnelle des EPCs chez les animaux vieillissants. Nous avons également démontré une augmentation pathologique du stress oxydant dans les EPCs isolées d’animaux vieillissants. Cette augmentation de stress oxydant dans les EPCs n’est pas présente chez les animaux déficients en Nox2. La troisième étude du projet de recherche a investigué l’effet des acides gras dérivés de la diète sur la néovascularisation postnatale. Pour ce faire, les souris ont reçu une diète comprenant 20% d’huile de maïs (riche en oméga-6) ou 20% d’huile de poisson (riche en oméga-3). Nos résultats démontrent qu’une diète riche en oméga-3 améliore la néovascularisation post-ischémique au niveau macro-vasculaire, micro-vasculaire et clinique comparée à une diète riche en oméga-6. Cette augmentation de la néovascularisation postnatale est associée à une réduction du ratio cholestérol total/cholestérol HDL dans le sérum et à une amélioration de la voie VEGF/NO dans les tissus ischémiques. De plus, une diète riche en acides gras oméga-3 est associée à une augmentation du nombre d’EPCs au niveau central (moelle osseuse) et périphérique (rate). Nous démontrons aussi que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et incorporation dans des tubules de cellules endothéliales matures) est améliorée et que le niveau de stress oxydant dans les EPCs est réduit par la diète riche en oméga-3. En conclusion, nos études ont permis de déterminer l’impact de différents facteurs de risque cardiovasculaire (tabagisme et vieillissement) et des acides gras dérivés de la diète (oméga-3) sur la néovascularisation post-ischémique. Nous avons aussi identifié plusieurs mécanismes qui sont impliqués dans cette physiopathologie. Globalement, nos études devraient contribuer à mieux comprendre l’effet du tabagisme, du vieillissement, des oméga-3, et du stress oxydant sur l’évolution des maladies vasculaires ischémiques.

Profil lipidique et statut des acides gras chez les patients avec trouble de déficit d'attention/hyperactivité (TDAH)

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le potentiel antioxydant de l’alimentation tel qu'estimé par le score ORAC : une comparaison des apports des personnes âgées avec démence du type Alzheimer avec ceux des témoins sans problèmes cognitifs

Le stress oxydatif et la formation des radicaux libres sont impliqués dans plusieurs mécanismes de la mort neuronale qui caractérisent la maladie d'Alzheimer. Les antioxydants sont reconnus comme une source de protection contre le stress oxydatif et peuvent avoir un effet protecteur sur le développement de la maladie d’Alzheimer. Cette étude visait à évaluer le potentiel antioxydant, par le biais du score « oxygen radical absorbance capacity » (ORAC), de l’alimentation habituelle de personnes âgées atteintes de la maladie d’Alzheimer en comparaison avec des témoins appariés pour l’âge sans problèmes cognitifs. L’hypothèse stipulait que les patients atteints de la maladie d’Alzheimer ont une alimentation dont le potentiel antioxydant est inférieur à celui des témoins sans problèmes cognitifs. L’étude a consisté en des analyses secondaires de données provenant de l’étude « Nutrition-Mémoire » (NMS), durant laquelle quarante-deux patients avec une démence du type Alzheimer (DTA) probable et leurs aidants étaient suivis pendant une période de dix-huit mois. Pour la présente étude, les données provenaient de trois jours de collecte alimentaire, ont été colligées au début (T0) de l’étude NMS, selon la méthode « Multiple-Pass ». Le potentiel antioxydant de l’alimentation a été déterminé à l’aide de la description des aliments énumérés dans la base de données des valeurs ORAC de l’USDA. Les résultats de l’étude ont montré que les patients avaient une alimentation dont le potentiel antioxydant était inférieur à celui des témoins (13784,07 ± 7372,70 μmol TE/100g contre 23220,54 ± 10862,55 μmol TE/100g, patients et témoins, respectivement; p<0,0001). Les analyses de régression hiérarchique pas à pas montraient que l’IMC, l’éducation, et le groupe (patients, témoins) étaient des facteurs influençant le score ORAC total. La consommation des aliments riches en antioxydants est un comportement préventif à faible risque qui pourrait bénéficier des individus susceptibles de développer la maladie d'Alzheimer.

The Effects of Pro-inflammatory Cytokines on the L-type Calcium Current in Mouse Ventricular Myocytes

L’inflammation: Une réponse adaptative du système immunitaire face à une insulte est aujourd’hui reconnue comme une composante essentielle à presque toutes les maladies infectieuses ou autres stimuli néfastes, tels les dommages tissulaires incluant l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, l’inflammation se caractérise principalement par une activation à long terme du système immunitaire, menant à une faible, mais chronique sécrétion de peptides modulateurs, appelés cytokines pro-inflammatoires. En effet, la littérature a montré à plusieurs reprises que les patients souffrant d’arythmies et de défaillance cardiaque présentent des taux élevés de cytokines pro-inflammatoires tels le facteur de nécrose tissulaire alpha (TNFα), l’interleukine 1β (IL-1β) et l’interleukine 6. De plus, ces patients souffrent souvent d’une baisse de la capacité contractile du myocarde. Le but de notre étude était donc de déterminer si un lien de cause à effet existe entre ces phénomènes et plus spécifiquement si le TNFα, l’IL-1β et l’IL-6 peuvent affecter les propriétés électriques et contractiles du cœur en modulant le courant Ca2+ de type L (ICaL) un courant ionique qui joue un rôle primordial au niveau de la phase plateau du potentiel d’action ainsi qu’au niveau du couplage excitation-contraction. Les possibles méchansimes par lesquels ces cytokines exercent leurs effets seront aussi explorés. Pour ce faire, des cardiomyocytes ventriculaires de souris nouveau-nées ont été mis en culture et traités 24 heures avec des concentrations pathophysiologiques (30 pg/mL) de TNFα, IL-1β ou IL-6. Des enregistrements de ICaL réalisés par la technique du patch-clamp en configuration cellule entière ont été obtenus par la suite et les résultats montrent que le TNFα n’affecte pas ICaL, même à des concentrations plus élevées (1 ng/mL). En revanche, l’IL-1β réduisait de près de 40% la densité d’ICaL. Afin d’examiner si le TNFα et l’IL-1β pouvaient avoir un effet synergique, les cardiomyocytes ont été traité avec un combinaison des deux cytokines. Toutefois aucun effet synergique sur ICaL n’a été constaté. En outre, l’IL-6 réduisait ICaL significativement, cependant la réduction de 20% était moindre que celle induite par IL-1β. Afin d’élucider les mécanismes sous-jacents à la réduction de ICaL après un traitement avec IL-1β, l’expression d’ARNm de CaV1.2, sous-unité α codante pour ICaL, a été mesurée par qPCR et les résultats obtenus montrent aucun changement du niveau d’expression. Plusieurs études ont montré que l’inflammation et le stress oxydatif vont de pair. En effet, l’imagerie confocale nous a permis de constater une augmentation accrue du stress oxydatif induit par IL-1β et malgré un traitement aux antioxydants, la diminution de ICaL n’a pas été prévenue. Cette étude montre qu’IL-1β et IL-6 réduisent ICaL de façon importante et ce indépendamment d’une régulation transcriptionelle ou du stress oxydatif. De nouvelles données préliminaires suggèrent que ICaL serait réduit suite à l’activation des protéines kinase C mais des études additionelles seront nécessaires afin d’étudier cette avenue. Nos résultats pourraient contribuer à expliquer les troubles du rythme et de contractilité observés chez les patients souffrant de défaillance cardiaque.

Hypertension et régulation de l'expression moléculaire de l'angiotensinogène par la ribonucléoprotéine hétérogène nucléaire K

Le diabète est une maladie chronique dont la principale caractéristique est un niveau plasmatique élevé de glucose, qui est causé soit par un défaut dans la production d’insuline, l’action de l’insuline, ou les deux à la fois. Plusieurs études ont démontré que l’hyperglycémie chronique peut mener à la dysfonction et même la défaillance de plusieurs organes, dont le coeur, le système vasculaire, les yeux et les reins, se traduisant par des infarctus du myocarde, des accidents cérébro-vasculaires et des complications rétinales et rénales, respectivement. La néphropathie diabétique (DN) est la principale cause de déficience rénale et affecte près de 25-40% des patients diabétiques. La DN est invariablement associée à un risque élevé d’accident cérébrovasculaire et de dysfonction cardivasculaire. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique précurseur de tous les types d’angiotensines. En plus du système rénine-angiotensine (RAS) sytémique, le rein possède son propre système intrarénal et exprime tous les composants du RAS. L’Agt est fortement exprimé dans les cellules du tubule proximal rénal (RPTC) et y est converti en angiotensine II (AngII), le peptide biologiquement actif du RAS. Les patients diabétiques présentent de hauts niveaux d’AngII et une augmentation de l’expression des gènes du RAS, suggérant que l’activation du RAS intrarénal joue un rôle important dans la progression de la DN. Les mécanismes qui contrôlent la régulation du niveau rénal d’Agt par l’hyperglycémie et l’insuline demeurent mal compris. Le but global de cette thèse est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression du gène Agt chez la souris Akita (un modèle murin de diabète de type 1). Dans cette optique, la première partie de la thèse se concentre sur deux facteurs de transcription de la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP). Chan et collaborateurs ont déjà identifié 2 protéines nucléaires hnRNP F et hnRNP K, de 48kD et 70kD respectivement. HnRNP F et hnRNP K forment un hétérodimère et se lient à l’élément de réponse à l’insuline (IRE) présent dans le promoteur du gène Agt du rat et inhibent la transcription du gène Agt in vitro. Afin de déterminer si hnRNP F / K sont responsables de l’inhibition de l’expression rénale de Agt par l’insuline in vivo, nous avons étudié des souris Akita males traités ou non avec des implants d’insuline pour une période de 4 semaines. Des souris non-Akita males ont été employées comme contrôles. Les souris Akita développent de l’hypertension et de l’hypertrophie rénale. Le traitement à l’insuline rétablit les niveaux de glucose plasmatiques et la pression systolique (SBP), et atténue l’hypertrophie rénale, l’albuminurie (ratio albumine/créatinine urinaire, ACR) et les niveaux urinaires d’Agt et AngII chez les souris Akita. De plus, le traitement à l’insuline inhibe l’expression rénale du gène Agt, tout en augmentant l’expression des gènes hnRNP F, hnRNP K et ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine-2). Dans des RPTC in vitro, l’insuline inhibe Agt, mais stimule l’expression de hnRNP F et hnRNP K en présence de hautes concentrations de glucose, et ce via la voie de signalisation MAPK p44/42 (protéine kinase activée par un mitogène). La transfection avec des petits ARN interférents (siRNA) contre hnRNP F et hnRNP K prévient l’inhibition de l’expression d’Agt par l’insuline dans les RPTC. Cette étude démontre bien que l’insuline prévient l’hypertension et atténue les dommages rénaux observés chez les souris Akita diabétiques, en partie grâce à la suppression de la transcription rénale de Agt, via une augmentation de l’expression de hnRNP F et hnRNP K. La seconde partie de cette thèse change de focus et se tourne vers le facteur Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Nrf2 est un facteur de transcription qui contrôle les gènes de la réponse antioxydante cellulaire en réponse au stress oxydant ou aux électrophiles. Le but de cette étude est d’examiner l’impact de la surexpression de la catalase (Cat) dans les RPTC sur l’expression du gène Agt via Nrf2 et sur le développement de l’hypertension et des dommages rénaux résultants chez les souris diabétiques Akita transgéniques (Tg). Nos études ont démontré que la surexpression de Cat dans les souris Akita Cat-Tg normalise la SBP, atténue les dommages rénaux et inhibe l’expression des gènes Nrf2 et Agt dans les RPTC. In vitro, le glucose élevé (HG) et l’oltipraz (un activateur de Nrf2) stimulent l’expression de Nrf2 et Agt, et cet effet peut être bloqué par la trigonelline (inhibiteur de Nrf2), des siRNA contre Nrf2, des antioxydants ou des inhibiteurs pharmacologiques NF-κB et MAPK p38. La suppression de sites de réponse à Nrf2 présents dans le promoteur du gène Agt du rat abolit la stimulation par l’oltipraz. Finalement, des souris males adultes non-transgéniques traitées avec l’oltipraz montrent une augmentation de l’expression de Nrf2 et Agt dans leurs RPTC et cette augmentation peut être normalisée par la trigonelline. Ces données permettent d’identifier un nouveau mécanisme d’action de Nrf2, par la stimulation du gène Agt intrarénal et l’activation du RAS, qui induisent l’hypertension et les dommages rénaux par le glucose élevé et les espèces réactives de l’oxygène chez les souris diabétiques. Nos conclusions permettent de démontrer que l’insuline induit l’expression de hnRNP F et hnRNP K, qui jouent ensuite un rôle protecteur en prévenant l’hypertension. La surexpression de la catalase dans les RPTC vient quant à elle atténuer l’activation de Nrf2 et ainsi réduit la SBP chez les souris Akita.

Le rôle du stress oxydant dans les changements épigénétiques contribuant aux complications du syndrome métabolique.

La méthylation de l'ADN est l'une des modifications épigénétiques au niveau des îlots CpG. Cette modification épigénétique catalysée par les ADN méthyltransférases (DNMTs) consiste en la méthylation du carbone 5' d’une cytosine ce qui aboutit à la formation de 5-méthylcytosine. La méthylation de l'ADN est clairement impliquée dans l'inactivation des gènes et dans l'empreinte génétique. Elle est modulée par la nutrition, en particulier par les donneurs de méthyle et par une restriction protéique. Ces modifications épigénétiques persistent plus tard dans la vie et conduisent au développement de nombreuses pathologies telles que le syndrome métabolique et le diabète de type 2. En fait, de nombreux gènes clés subissent une modification de leur état de méthylation en présence des composants du syndrome métabolique. Cela montre que la méthylation de l'ADN est un processus important dans l'étiologie du syndrome métabolique. Le premier travail de ce doctorat a porté sur la rédaction d’un article de revue qui a examiné le cadre central du syndrome métabolique et analyser le rôle des modifications épigénétiques susceptibles d'influer sur l'apparition du stress oxydant et des complications cardiométaboliques. D’autre part, les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées et traitées avec du Fer-Ascorbate pour induire un stress oxydant. Le Fer-Ascorbate a induit une augmentation significative de l’inflammation et de la peroxydation des lipides (malondialdehyde) ainsi que des altérations de de la défense antioxydante (SOD2 et GPx) accompagnées de modifications épigénétiques. De plus, la pré-incubation des cellules avec de la 5-aza-2'-désoxycytidine, un agent de déméthylation et/ou l’antioxydant Trolox a normalisé la défense antioxydante, réduit la peroxydation des lipides et prévenu l'inflammation. Ce premier travail a démontré que les modifications du redox et l’inflammation induites par le Fer-Ascorbate peuvent impliquer des changements épigénétiques, plus particulièrement des changements dans la méthylation de l’ADN. Pour mieux définir l’impact du stress oxydant au niveau nutritionnel, des cochons d’Inde âgés de trois jours ont été séparés en trois groupes : 1) Témoins: alimentation régulière; 2) Nutrition parentérale (NP) 3) H2O2 : Témoins + 350 uM H2O2. Après quatre jours, pour un groupe, les perfusions ont été stoppées et les animaux sacrifiés pour la collecte des foies. Pour l’autre groupe d’animaux, les perfusions ont été arrêtées et les animaux ont eu un accès libre à une alimentation régulière jusqu'à la fin de l’étude, huit semaines plus tard où ils ont été sacrifiés pour la collecte des foies. Ceci a démontré qu’à une semaine de vie, l'activité DNMT et les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient inférieurs pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. A neuf semaines de vie, l’activité DNMT est restée basse pour le groupe NP alors que les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient plus faibles pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. Ce travail a démontré que l'administration de NP ou de H2O2, tôt dans la vie, induit une hypométhylation de l'ADN persistante en raison d'une inhibition de l'activité DNMT. Finalement, des souris ayant reçu une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ont été utilisées comme modèle in vivo de syndrome métabolique. Les souris ont été nourris soit avec un régime standard chow (témoins), soit avec une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ou avec une diète HFHS en combinaison avec du GFT505 (30 mg/kg), un double agoniste de PPARα et de PPARδ, pendant 12 semaines. La diète HFHS était efficace à induire un syndrome métabolique étant donnée l’augmentation du poids corporel, du poids hépatique, des adiposités viscérales et sous-cutanées, de l’insensibilité à l’insuline, des lipides plasmatiques et hépatiques, du stress oxydant et de l’inflammation au niveau du foie. Ces perturbations étaient accompagnées d’une déficience dans l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ concomitant avec une hyperméthylation de leurs promoteurs respectifs. L’ajout de GFT505 à la diète HFHS a empêché la plupart des effets cardiométaboliques induits par la diète HFHS via la modulation négative de l’hyperméthylation des promoteurs, résultant en l’augmentation de l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ. En conclusion, GFT505 exerce des effets métaboliques positifs en améliorant le syndrome métabolique induit par l'alimentation HFHS via des modifications épigénétiques des gènes PPARs. Ensemble, les travaux de cette thèse ont démontré que le stress oxydant provenant de la nutrition induit d’importants changements épigénétiques pouvant conduire au développement du syndrome métabolique. La nutrition apparait donc comme un facteur crucial dans la prévention de la reprogrammation fœtale et du développement du syndrome métabolique. Puisque les mécanismes suggèrent que le stress oxydant agit principalement sur les métabolites du cycle de la méthionine pour altérer l’épigénétique, une supplémentation en ces molécules ainsi qu’en antioxydants permettrait de restaurer l’équilibre redox et épigénétique.

Pathogenèse de l’oedème cérébral dans l’encéphalopathie hépatique minimale : rôles du stress oxydatif et du lactate

L’encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome neuropsychiatrique découlant des complications de l'insuffisance hépatique. Les patients souffrant d'une insuffisance hépatique chronique (IHC) présentent fréquemment une EH minimale (EHM) caractérisée par des dysfonctions cognitives subtiles qui affectent leur qualité de vie. L'insuffisance hépatique entraîne une hyperammoniémie, le facteur central dans la pathogenèse de l'EH. Pourtant, les taux d'ammoniaque sérique ne sont pas corrélés avec la sévérité de l'EH lors d'une IHC, suggérant que d'autres facteurs y contribuent. L'oedème cérébral est une caractéristique neuropathologique décrite chez les patients souffrant d'une EHM et plusieurs facteurs dont le stress oxydatif, les altérations du métabolisme énergétique et l'augmentation de la glutamine cérébrale pourraient contribuer à la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC. Les mécanismes sous-jacents exacts ainsi que les relations entre ces facteurs et l'ammoniaque ne sont pas connus. Présentement, le seul traitement efficace de l'IHC est la transplantation hépatique, une option thérapeutique très limitée. Le but de cette thèse est de contribuer à l'avancement des connaissances sur les mécanismes sous-jacents liés au rôle du stress oxydatif, de la glutamine et du lactate dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC afin d'envisager de nouvelles options thérapeutiques. Les objectifs précis étaient: 1. Établir le rôle de l’ammoniaque et sa relation avec le stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC. 2. Établir le rôle du stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral, sa relation avec l'ammoniaque et l'effet du traitement avec des antioxydants. 3. Confirmer l'effet synergique entre l'ammoniaque et le stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral. 4. Établir le rôle du lactate et de la glutamine dans la pathogenèse de l'oedème cérébral et leur relation avec l’ammoniaque. Pour atteindre ces objectifs, 2 modèles animaux d'EHM obtenus par microchirurgie chez le rat ont été utilisés: 1) la ligature de voie biliaire, un modèle d'IHC et 2) l'anastomose porto-cave, un modèle d'hyperammoniémie induite par la dérivation portosystémique. Nos résultats démontrent que l'ammoniaque et le stress oxydatif indépendamment n'induisent pas l'oedème cérébral lors d'une EHM. Pourtant, lorsque les 2 facteurs agissent ensemble ils présentent ii un effet synergique qui entraîne le développement de l'oedème cérébral, le stress oxydatif étant une première insulte, qui est suivie par l'hyperammoniémie comme deuxième insulte. En plus, le stress oxydatif a été mis en évidence seulement au niveau systémique, et non au niveau central dans notre modèle d'IHC en association avec l'oedème cérébral, suggérant que le stress oxydatif systémique est une conséquence de la dysfonction hépatique et que l'hyperammoniémie n’induit pas le stress oxydatif ni systémique ni central. Nous avons démontré qu’une augmentation du lactate cérébral est une conséquence directe de l'hyperammoniémie et joue un rôle important dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC, tandis qu’une augmentation de la glutamine au niveau cérébral n'est pas un facteur clé. La compréhension de ces mécanismes a entraîné la proposition de 3 nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles pour l'EHM. Elles ciblent la diminution de l'ammoniaque sérique, la réduction du stress oxydatif et l'inhibition de la synthèse du lactate.

Évaluation du rôle du récepteur CD36 comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique

La maladie cardiaque ischémique, la plus commune des maladies qui affectent le cœur, est encore aujourd’hui une importante cause de décès dans les pays industrialisés. Une réponse cardio-métabolique inflammatoire à un changement aigu initié par une modification du métabolisme énergétique du cœur ischémique est accentuée après que l’apport en oxygène ait été rétabli. Parmi les altérations délétères dans le myocarde qui en résultent, sont inclus l’accumulation d’acides gras non estérifiés (AGNE) ainsi que leur oxydation au détriment de l’utilisation du glucose, ce qui amplifie la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les tissus en périphérie du cœur tel que le tissu adipeux peuvent affecter l’étendue des blessures au myocarde par la relâche en circulation de substances bioactives comme les AGNE et l’adiponectine. Le CD36 est le principal facilitateur de l’entrée d’AGNE dans le cœur et les adipocytes et constitue une importante cible métabolique spécialement lors d’un stress d’ischémie-reperfusion (I/R). Il a été rapporté précédemment par notre groupe qu’un ligand synthétique et sélectif envers le CD36 exerce un effet protecteur puissant sur le système vasculaire. Cependant, aucune étude in vivo n’a rapporté d’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs envers le CD36. Ainsi, ce projet visait à évaluer le rôle et possiblement l’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs du récepteur CD36 sur la blessure au myocarde en I/R. Des souris CD36+/+ et CD36-/- ont été traitées quotidiennement avec le EP 80317, le CP-3(iv) ou le véhicule pendant 14 jours avant de subir la ligature temporaire de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD). Notre première étude a montré que le EP 80317 exerce un effet cardioprotecteur puissant tel que montré par la réduction de la surface des lésions et l’amélioration de la fonction cardiaque in vivo suivant la blessure au myocarde en I/R. De plus, le EP 80317 a réduit l’internalisation totale d’AGNE dans le myocarde, mesurée in vivo par l’imagerie métabolique cardiaque, en accord avec la diminution du niveau circulant d’AGNE. Une réduction de la lipolyse révélée par une perfusion de radiotraceur de palmitate et une augmentation du niveau d’expression de gènes adipogéniques et anti-lipolytiques appuient davantage l’effet du EP 80317 dans la prévention de la mobilisation délétère d’acides gras du tissu adipeux. Notre deuxième étude a investigué le mécanisme cardioprotecteur d’une nouvelle génération de ligands dotés d’une plus grande affinité de liaison envers le CD36. Cette étude a montré que le CP-3(iv) est aussi pourvu d’un puissant effet cardioprotecteur comme le montre la réduction de la taille de l’infarctus et l’amélioration de la fonction cardiaque post-I/R du myocarde qui est fonction d’une signalisation métabolique et anti-oxydante de l’adiponectine. En effet, l’augmentation des principales voies de signalisation régulant la sécrétion de l’adiponectine et des gènes antioxydants a été démontrée dans le tissu adipeux suivant l’I/R du myocarde et un traitement avec le CP-3(iv). L’activation de la protéine kinase B ou Akt dans le myocarde avec la diminution de la génération de ROS et de la signalisation de mort cellulaire appuient davantage le rôle cardioprotecteur du CP-3(iv) dans l’I/R du myocarde. En conclusion, le travail présenté dans cette thèse soutient qu’une signalisation du CD36 par le EP 80317 et le CP-3(iv) pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique. Ces ligands synthétiques sélectifs envers le CD36 provoquent un effet salutaire sur le myocarde ischémique par le biais d’une amélioration du profil métabolique dans les premières heures de la reperfusion. Le EP 80317 réduit le niveau délétère d’AGNE et leur internalisation dans le cœur en situation d’excès, tandis que le CP-3(iv) augmente le niveau bénéfique d’adiponectine et son effet cardioprotecteur.

Gene-nutrient interactions in the metabolic syndrome: single nucleotide polymorphisms in ADIPOQ and ADIPOR1 interact with plasma saturated fatty acids to modulate insulin resistance

Background: Progression of the metabolic syndrome (MetS) is determined by genetic and environmental factors. Gene-environment interactions may be important in modulating the susceptibility to the development of MetS traits. Objective: Gene-nutrient interactions were examined in MetS subjects to determine interactions between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the adiponectin gene (ADIPOQ) and its receptors (ADIPOR1 and ADIPOR2) and plasma fatty acid composition and their effects on MetS characteristics. Design: Plasma fatty acid composition, insulin sensitivity, plasma adiponectin and lipid concentrations, and ADIPOQ, ADIPOR1, and ADIPOR2 SNP genotypes were determined in a cross-sectional analysis of 451 subjects with the MetS who participated in the LIPGENE (Diet, Genomics, and the Metabolic Syndrome: an Integrated Nutrition, Agro-food, Social, and Economic Analysis) dietary intervention study and were repeated in 1754 subjects from the LIPGENE-SU.VI.MAX (SUpplementation en VItamines et Mineraux AntioXydants) case-control study (http://www.ucd.ie/lipgene). Results: Single SNP effects were detected in the cohort. Triacylglycerols, nonesterified fatty acids, and waist circumference were significantly different between genotypes for 2 SNPs (rs266729 in ADIPOQ and rs10920533 in ADIPOR1). Minor allele homozygotes for both of these SNPs were identified as having degrees of insulin resistance, as measured by the homeostasis model assessment of insulin resistance, that were highly responsive to differences in plasma saturated fatty acids (SFAs). The SFA-dependent association between ADIPOR1 rs10920533 and insulin resistance was replicated in cases with MetS from a separate independent study, which was an association not present in controls. Conclusions: A reduction in plasma SFAs could be expected to lower insulin resistance in MetS subjects who are minor allele carriers of rs266729 in ADIPOQ and rs10920533 in ADIPOR1. Personalized dietary advice to decrease SFA consumption in these individuals may be recommended as a possible therapeutic measure to improve insulin sensitivity. This trial was registered at clinicaltrials.

Étude des effets de la tétrahydrobioptérine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires induite par circulation extracorporelle dans un modèle porcin

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude des effets de la tétrahydrobioptérine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires induite par circulation extracorporelle dans un modèle porcin

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans un modèle in vitro et in vivo de maladie inflammatoire de l’intestin : caractérisation des polyphénols de la pelure de pomme et de la canneberge par spectrométrie de masse

La muqueuse intestinale est exposée à des agents oxydants provenant de l’ingestion d’aliments modifiés, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une diète élevée en fruits et légumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que l’inflammation via plusieurs mécanismes. Ces effets bénéfiques peuvent être attribuables à leur contenu élevé en polyphénols. La première étude de mon doctorat consistait à tester l’hypothèse que les polyphénols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqués dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractérisé les polyphénols des DAPP par spectrométrie de masse (LC-MS) et examiné leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. L’identification des structures chimiques des polyphénols a été effectuée par LC-MS. Le SOx a été induit par l’ajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 µM/2 mM) et l’inflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200µg/mL) à des cellules intestinales Caco-2/15 pré-incubées avec les DAPP (250 µg/mL). L’effet du SOx est déterminé par le dosage du malondialdéhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturés et de l’activité des enzymes antioxydantes endogènes (SOD et GPx). L’impact des DAPP sur l’inflammation a été testé par l’analyse de l’expression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygénase-2 (COX-2), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a et l’interleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1α par immunobuvardage. Nos données ont montré que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composés polyphénoliques majoritaires des DAPP. L’ajout de Fer2+/Asc a provoqué une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrôles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de l’activité de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhibé leur potentiel à corriger la plupart des perturbations, y compris l’expression protéique anormalement élevée du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que l’inflammation telle que réflétée par les facteurs NF-κB, TNF-α et IL-6. Par ailleurs, les mécanismes sous-jacents à ces changements bénéfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Vraisemblablement, cette première étude a permis de démontrer la capacité des DAPP à amoindrir le SOx et à réduire l’inflammation, deux processus étroitement impliqués dans les MII. Dans la deuxième étape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les résultats de DAPP à ceux des polyphénols dérivant de la canneberge qui est considérée par la communauté scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. À cette fin, nous avons caractérisé l’effet des composés polyphénoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la défense antioxydante et l’inflammation au niveau intestinal tout en définissant leur métabolisme intraluminal. Les différents CPC ont été séparés selon leur poids moléculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont été identifiées par LC-MS. Suite à une pré-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 µg/mL), le Fe/Asc et la LPS ont été administrés comme inducteurs du SOx et de l’inflammation, respectivement. La caractérisation globale des CPC a révélé que les acides phénoliques composaient majoritairement l’extrait de canneberge de petit poids moléculaire (LC) alors que les flavonoïdes et les procyanidines dimériques/trimériques représentaient l’extrait de poids moléculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymériques à l’extrait de haut poids moléculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendrées dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel d’abaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, d’augmenter l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et d’élever l’expression de Nrf2 et PGC1α. En outre, les CPC pouvaient aussi réduire les niveaux élevés des protéines inflammatoires COX-2, TNF-α et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mécanisme impliquant le NF-κB. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomériques ont réussi à corriger les dysfonctions reliées à la production d’énergie (ATP), l’apoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mécanismes d’action des CPC, nous avons défini par LC-MS les composés polyphénoliques qui ont été transportés ou absorbés par l’entérocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoïques (LC); (ii) la quercétine glycosylée et conjuguée et les procyanidines dimériques de type A (MC); et (iii) l’épicatéchine et les procyanidines oligomériques (HC). Les processus de métabolisation (méthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de l’entérocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjuguée. Les procyanidines oligomériques ayant un degré de polymérisation supérieur à 2 (HC) ont semblé adhérer aux cellules Caco-2/15. L’épicatéchine suivi par les procyanidines dimériques de type A ont été trouvés majoritaires au niveau des mitochondries. Même si nous ignorons encore l’action biologique de chaque composé polyphénolique, nous pouvons suggérer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modèle intestinal Caco-2/15. Dans une troisième étape, nous avons procédé à l’évaluation des aspects préventifs et thérapeutique des DAPP tout en sondant les mécanismes sous-jacents dans une étude préclinique. À cette fin, nous avons exploité le modèle de souris avec colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). L’induction de l’inflammation intestinale chez la souris C57BL6 a été effectuée par l’administration orale de DSS à 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont été administrées par gavage pendant 10 jours pré- et post-DSS. L’inflammation par le DSS a provoqué une perte de poids, un raccourcissement du côlon, le décollement dystrophique de l’épithélium, l’exulcération et les infiltrations de cellules mono et polynucléaires au niveau du côlon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une régulation à la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protéique à la hausse de la myéloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins d’alléger la plupart de ces anomalies en situation préventive ou thérapeutique, en plus d’abaisser l’expression protéique de NF-κB et des cytokines inflammatoires (TNF-a et l’IL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Conséquemment, les polyphénols des DAPP ont exhibé leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modèle in vivo. Leurs actions sont associées à la régulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent d’envisager l’évaluation des effets préventifs et thérapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des désordres inflammatoires de l’intestin.

Régulation épigénétique de la défense antioxydante et de l'Angiopoietin-like 2 dans le contexte du vieillissement et des maladies cardiovasculaires

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans un modèle in vitro et in vivo de maladie inflammatoire de l’intestin : caractérisation des polyphénols de la pelure de pomme et de la canneberge par spectrométrie de masse

La muqueuse intestinale est exposée à des agents oxydants provenant de l’ingestion d’aliments modifiés, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une diète élevée en fruits et légumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que l’inflammation via plusieurs mécanismes. Ces effets bénéfiques peuvent être attribuables à leur contenu élevé en polyphénols. La première étude de mon doctorat consistait à tester l’hypothèse que les polyphénols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqués dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractérisé les polyphénols des DAPP par spectrométrie de masse (LC-MS) et examiné leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. L’identification des structures chimiques des polyphénols a été effectuée par LC-MS. Le SOx a été induit par l’ajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 µM/2 mM) et l’inflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200µg/mL) à des cellules intestinales Caco-2/15 pré-incubées avec les DAPP (250 µg/mL). L’effet du SOx est déterminé par le dosage du malondialdéhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturés et de l’activité des enzymes antioxydantes endogènes (SOD et GPx). L’impact des DAPP sur l’inflammation a été testé par l’analyse de l’expression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygénase-2 (COX-2), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a et l’interleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1α par immunobuvardage. Nos données ont montré que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composés polyphénoliques majoritaires des DAPP. L’ajout de Fer2+/Asc a provoqué une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrôles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de l’activité de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhibé leur potentiel à corriger la plupart des perturbations, y compris l’expression protéique anormalement élevée du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que l’inflammation telle que réflétée par les facteurs NF-κB, TNF-α et IL-6. Par ailleurs, les mécanismes sous-jacents à ces changements bénéfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Vraisemblablement, cette première étude a permis de démontrer la capacité des DAPP à amoindrir le SOx et à réduire l’inflammation, deux processus étroitement impliqués dans les MII. Dans la deuxième étape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les résultats de DAPP à ceux des polyphénols dérivant de la canneberge qui est considérée par la communauté scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. À cette fin, nous avons caractérisé l’effet des composés polyphénoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la défense antioxydante et l’inflammation au niveau intestinal tout en définissant leur métabolisme intraluminal. Les différents CPC ont été séparés selon leur poids moléculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont été identifiées par LC-MS. Suite à une pré-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 µg/mL), le Fe/Asc et la LPS ont été administrés comme inducteurs du SOx et de l’inflammation, respectivement. La caractérisation globale des CPC a révélé que les acides phénoliques composaient majoritairement l’extrait de canneberge de petit poids moléculaire (LC) alors que les flavonoïdes et les procyanidines dimériques/trimériques représentaient l’extrait de poids moléculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymériques à l’extrait de haut poids moléculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendrées dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel d’abaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, d’augmenter l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et d’élever l’expression de Nrf2 et PGC1α. En outre, les CPC pouvaient aussi réduire les niveaux élevés des protéines inflammatoires COX-2, TNF-α et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mécanisme impliquant le NF-κB. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomériques ont réussi à corriger les dysfonctions reliées à la production d’énergie (ATP), l’apoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mécanismes d’action des CPC, nous avons défini par LC-MS les composés polyphénoliques qui ont été transportés ou absorbés par l’entérocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoïques (LC); (ii) la quercétine glycosylée et conjuguée et les procyanidines dimériques de type A (MC); et (iii) l’épicatéchine et les procyanidines oligomériques (HC). Les processus de métabolisation (méthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de l’entérocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjuguée. Les procyanidines oligomériques ayant un degré de polymérisation supérieur à 2 (HC) ont semblé adhérer aux cellules Caco-2/15. L’épicatéchine suivi par les procyanidines dimériques de type A ont été trouvés majoritaires au niveau des mitochondries. Même si nous ignorons encore l’action biologique de chaque composé polyphénolique, nous pouvons suggérer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modèle intestinal Caco-2/15. Dans une troisième étape, nous avons procédé à l’évaluation des aspects préventifs et thérapeutique des DAPP tout en sondant les mécanismes sous-jacents dans une étude préclinique. À cette fin, nous avons exploité le modèle de souris avec colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). L’induction de l’inflammation intestinale chez la souris C57BL6 a été effectuée par l’administration orale de DSS à 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont été administrées par gavage pendant 10 jours pré- et post-DSS. L’inflammation par le DSS a provoqué une perte de poids, un raccourcissement du côlon, le décollement dystrophique de l’épithélium, l’exulcération et les infiltrations de cellules mono et polynucléaires au niveau du côlon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une régulation à la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protéique à la hausse de la myéloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins d’alléger la plupart de ces anomalies en situation préventive ou thérapeutique, en plus d’abaisser l’expression protéique de NF-κB et des cytokines inflammatoires (TNF-a et l’IL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Conséquemment, les polyphénols des DAPP ont exhibé leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modèle in vivo. Leurs actions sont associées à la régulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent d’envisager l’évaluation des effets préventifs et thérapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des désordres inflammatoires de l’intestin.

Régulation épigénétique de la défense antioxydante et de l'Angiopoietin-like 2 dans le contexte du vieillissement et des maladies cardiovasculaires

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.