Recruitment of EB1, a master regulator of microtubule dynamics, to the surface of the Theileria annulata schizont

The apicomplexan parasite Theileria annulata transforms infected host cells, inducing uncontrolled proliferation and clonal expansion of the parasitized cell population. Shortly after sporozoite entry into the target cell, the surrounding host cell membrane is dissolved and an array of host cell microtubules (MTs) surrounds the parasite, which develops into the transforming schizont. The latter does not egress to invade and transform other cells. Instead, it remains tethered to host cell MTs and, during mitosis and cytokinesis, engages the cell's astral and central spindle MTs to secure its distribution between the two daughter cells. The molecular mechanism by which the schizont recruits and stabilizes host cell MTs is not known. MT minus ends are mostly anchored in the MT organizing center, while the plus ends explore the cellular space, switching constantly between phases of growth and shrinkage (called dynamic instability). Assuming the plus ends of growing MTs provide the first point of contact with the parasite, we focused on the complex protein machinery associated with these structures. We now report how the schizont recruits end-binding protein 1 (EB1), a central component of the MT plus end protein interaction network and key regulator of host cell MT dynamics. Using a range of in vitro experiments, we demonstrate that T. annulata p104, a polymorphic antigen expressed on the schizont surface, functions as a genuine EB1-binding protein and can recruit EB1 in the absence of any other parasite proteins. Binding strictly depends on a consensus SxIP motif located in a highly disordered C-terminal region of p104. We further show that parasite interaction with host cell EB1 is cell cycle regulated. This is the first description of a pathogen-encoded protein to interact with EB1 via a bona-fide SxIP motif. Our findings provide important new insight into the mode of interaction between Theileria and the host cell cytoskeleton.

Cell cycle-dependent phosphorylation of Theileria annulata schizont surface proteins.

The invasion of Theileria sporozoites into bovine leukocytes is rapidly followed by the destruction of the surrounding host cell membrane, allowing the parasite to establish its niche within the host cell cytoplasm. Theileria infection induces host cell transformation, characterised by increased host cell proliferation and invasiveness, and the activation of anti-apoptotic genes. This process is strictly dependent on the presence of a viable parasite. Several host cell kinases, including PI3-K, JNK, CK2 and Src-family kinases, are constitutively activated in Theileria-infected cells and contribute to the transformed phenotype. Although a number of host cell molecules, including IkB kinase and polo-like kinase 1 (Plk1), are recruited to the schizont surface, very little is known about the schizont molecules involved in host-parasite interactions. In this study we used immunofluorescence to detect phosphorylated threonine (p-Thr), serine (p-Ser) and threonine-proline (p-Thr-Pro) epitopes on the schizont during host cell cycle progression, revealing extensive schizont phosphorylation during host cell interphase. Furthermore, we established a quick protocol to isolate schizonts from infected macrophages following synchronisation in S-phase or mitosis, and used mass spectrometry to detect phosphorylated schizont proteins. In total, 65 phosphorylated Theileria proteins were detected, 15 of which are potentially secreted or expressed on the surface of the schizont and thus may be targets for host cell kinases. In particular, we describe the cell cycle-dependent phosphorylation of two T. annulata surface proteins, TaSP and p104, both of which are highly phosphorylated during host cell S-phase. TaSP and p104 are involved in mediating interactions between the parasite and the host cell cytoskeleton, which is crucial for the persistence of the parasite within the dividing host cell and the maintenance of the transformed state.

Transformation of leukocytes by Theileria parva and T. annulata.

Theileria parva and T. annulata provide intriguing models for the study of parasite-host interactions. Both parasites possess the unique property of being able to transform the cells they infect; T. parva transforms T and B cells, whereas T. annulata affects B cells and monocytes/macrophages. Parasitized cells do not require antigenic stimulation or exogenous growth factors and acquire the ability to proliferate continuously. In vivo, parasitized cells undergo clonal expansion and infiltrate both lymphoid and non-lymphoid tissues of the infected host. Theileria-induced transformation is entirely reversible and is accompanied by the expression of a wide range of different lymphokines and cytokines, some of which may contribute to proliferation or may enhance spread and survival of the parasitized cell in the host. The presence of the parasite in the host-cell cytoplasm modulates the state of activation of a number of signal transduction pathways. This, in turn, leads to the activation of transcription factors, including nuclear factor-kappa B, which appear to be essential for the survival of Theileria-transformed T cells.

A quantitative reverse-transcriptase PCR assay for the assessment of drug activities against intracellular Theileria annulata schizonts.

Intracellular schizonts of the apicomplexans Theileria annulata and Theileria parva immortalize bovine leucocytes thereby causing fatal immunoproliferative diseases. Buparvaquone, a hydroxynaphthoquinone related to parvaquone, is the only drug available against Theileria. The drug is only effective at the onset of infection and emerging resistance underlines the need for identifying alternative compounds. Current drug assays employ monitoring of proliferation of infected cells, with apoptosis of the infected host cell as a read-out, but it is often unclear whether active compounds directly impair the viability of the parasite or primarily induce host cell death. We here report on the development of a quantitative reverse transcriptase real time PCR method based on two Theileria genes, tasp and tap104, which are both expressed in schizonts. Upon in vitro treatment of T. annulata infected bovine monocytes with buparvaquone, TaSP and Tap104 mRNA expression levels significantly decreased in relation to host cell actin already within 4 h of drug exposure, while significant differences in host cell proliferation were detectable only after 48-72 h. TEM revealed marked alterations of the schizont ultrastructure already after 2 h of buparvaquone treatment, while the host cell remained unaffected. Expression of TaSP and Tap104 proteins showed a marked decrease only after 24 h. Therefore, the analysis of expression levels of mRNA coding for TaSP and Tap104 allows to directly measuring impairment of parasite viability. We subsequently applied this method using a series of compounds affecting different targets in other apicomplexan parasites, and show that monitoring of TaSP- and Tap104 mRNA levels constitutes a suitable tool for anti-theilerial drug development.

Flaviviruses in mosquitoes from Southern Portugal, 2009-2010

Os flavivírus são vírus pertencentes à família Flaviviridae, género Flavivirus. Estes formam um grande grupo caraterizado pela sua ampla distribuição e diversidade genética. Os flavivírus são, na sua maioria, transmitidos por artrópodes vectores incluíndo agentes patogénicos para humanos e animais que podem potencialmente provocar grandes epidemias e causar elevadas taxas de mortalidade e morbidade. Nos últimos anos, tem-se registado uma grande expansão a nível da distribuição geográfica dos flavivirus e diversidade dos seus hospedeiros. O vírus do Nilo Ocidental tem sido continuamente detectado em toda a Europa recentemente, e também isolado de mosquitos colhidos no Sul de Portugal, onde já foram registados casos humanos e animais. O principal objectivo deste trabalho é o rastreio de flavivírus em mosquitos colhidos em duas regiões do Sul de Portugal, onde os mesmos foram anteriormente detectados. As colheitas de mosquitos foram realizadas em 24 locais em zonas húmidas nos districtos de Faro e Setúbal, através de armadilhas luminosas tipo CDC com CO2 e aspiradores mecânicos manuais para colheita de mosquitos em repouso em abrigos de animais. Os mosquitos colhidos foram agrupados por lotes contendo aproximadamente 50 espécimens cada, e rastreados para a presença de flavivírus por heminested RT-PCR, direccionado à amplificação de um pequeno fragmento do gene NS5 usando oligonucleótidos degenerados específicos para flavivírus. Entre Abril e Outubro de 2009 e 2010 foram colhidos no total 36273 mosquitos pertencentes às seguintes espécies: Anopheles algeriensis, An.atroparvus, Aedes berlandi, Ae.caspius, Ae.detritus, Coquillettidia richiardii, Culex laticinctus, Cx.pipiens, Cx.theileri, Cx.univittatus, Culiseta annulata, Cs.longiareolata, Cs.subochrea, e Uranotaenia unguiculata. As espécies mais abundantes foram Ae.caspius, Cx.theileri e Cx.pipiens, respectivamente. Contudo, as densidades de mosquitos foram variáveis de acordo com o método de colheita e área de amostragem. As densidades de mosquitos colhidos em 2010 foram quatro vezes superior às registadas no ano anterior. No total foram analisados 745 lotes dos quais 31% testaram positivos para a presença de sequências de flavivirus. As espécies que apresentaram taxas de positividade mais elevadas foram: An.algeriensis com uma Taxa Mínima de Infecção (TMI) de 56/1000 no Algarve em 2009, Cs.annulata TMI =22/1000 no Algarve em 2010, Cx.theileri e Cx.pipiens em Setúbal em 2010, TMI =20/1000. An. atroparvus, Ae. caspius, Ae. detritus e Cx. univittatus também produziram lotes positives. No geral, a positividade foi maior no Algarve. Análise das sequências virais obtidas revelou homologia das nossas sequências virais com sequências de referência de flavivírus específicos de mosquitos depositadas em bases de dados de acesso livre. A análise filogenética reflectiu a variabilidade genética dos flavivírus e revelou a relação genética das nossas sequências com as de outros flavivírus, especialmente os específicos de insectos. Tendo em consideração os anteriores isolamentos do vírus do Nilo Ocidental, o aumento acentuado nas densidades de mosquitos, o aumento de temperaturas que se tem vindo a registar, os casos recentes de transmissão de flavivírus por toda a Europa e o padrão desconhecido e imprevisível dos surtos destes vírus, os programas contínuos de vigilância epidemiológica têm-se revelado uma ferramenta indispensável para a Saúde Pública.

Sôbre os inimigos naturais da lagarta das palmáceas Brassolis sophorae sophorae (L.) (Lep., Brassolidae)

Brassolis sophorae (L.) (Lep., Brassolidae) is an old and important pest of some Brazilian Palmae, among which Cocos nucifera L. and Copemicia cerifera Mart, are the most valuable economically. Eggs are attacked by Anastatus reduvii (Howard) (Eupel-midae) and Telenomus sp. and Telenomus nigrocoxdlis Ashmead (Scelionidae), the larvae being destroyed by Withemia pinguis (F.) (Tachinidae). Six other insects devellop inside the pupae : Xanthozona melanopyga (Wiedmann) and Belvosia sp. (Tachinidae) and the Hymenoptera Brachymeria annulata (F.), B. incerta (Cres-son), Spilochalcis nigrifrons Cameron and S. morleyi Ashmead (Chalcicidae), the last of them being principally treated in this paper. A species of Sarcophagidae (Sarcophaga lambens Wiedmann) was also noted, some flies being gotten from a single pupa. In Piracicaba (State of S. Paulo, Brasil), according to the Author's observations, B. sophorae principal enemy is X. melanopyga, to which our attention has to be directed in a biological fight against the mentioned Brassolidae. The reported Telenomus sp. is also very harmful to B. sophorae eggs. In the whole zone of its distribution, the hosts of B. sophorae caterpillars are Palmae plants, appearing sporadically feeding on banana and sugar cane leaves.

Espécies novas e chave para as espécies de Callia (Coleoptera, Cerambycidae)

New species described: Callia marginata from Peru, C. punctata from Colombia, C. annulata from Ecuador, C. tristis from Bolivia, C. paraguaya from Paraguay; from Brazil: C. divisa and C. tomentosa (Mato Grosso), and C. lissonota (Rondônia). A key to the species of Callia is added.

Himenópteros parasitóides associados a pupas de Methona themisto (Lepidoptera, Nymphalidae) em Florianópolis, Santa Catarina, Brasil

Os objetivos deste estudo foram conhecer a guilda de parasitóides associados a pupas de Methona themisto (Hübner, 1818), avaliando a abundância relativa de cada espécie de parasitóide e o efeito do parasitoidismo na mortalidade do hospedeiro. Foram coletadas 160 pupas de M. themisto, 80 em outubro de 2001 e 80 em outubro de 2002. Essas foram mantidas em temperatura de 25 ± 2,0ºC e fotofase de 14 horas, sendo diariamente observadas, até a emergência de parasitóides ou borboletas. Os seguintes parasitóides foram obtidos das pupas de M. themisto: Brachymeria annulata (Fabricius, 1793), B. mnestor (Walker, 1841) (Chalcididae), Neotheronia sp. (Ichneumonidae), Palmistichus elaeisis Delvare & LaSalle, 1996 e Tetrastichus sp. (Eulophidae). Somente os gêneros Brachymeria e Neotheronia ocorreram nos dois anos de estudo, sendo que o primeiro foi mais abundante em 2001 e o último, em 2002. As outras espécies de parasitóides ocorreram somente no segundo ano de estudo. Este é o primeiro relato da associação de B. annulata, B. mnestor, Neotheronia sp. e P. elaeisis com M. themisto.

Estudos citogenéticos em formigas neotropicais do gênero Gnamptogenys Roger (Hymenoptera, Formicidae, Ectatomminae)

Foram caracterizados os cariótipos de três espécies neotropicais do gênero Gnamptogenys Roger: Gnamptogenys striatula Mayr, Gnamptogenys sp. e Gnamptogenys annulata Mayr, coletadas em Viçosa (Minas Gerais) e Ilhéus (Bahia). O número cromossômico de G. striatula nas duas localidades foi 2n=34, com fórmula cariotípica 2K=24M+10A. Em Gnamptogenys sp., o número cromossômico foi de 2n=46 (fêmea) e n=23 (machos), com a fórmula cariotípica 2K=18M+28A. O número cromossômico de G. annulata foi 2n=68 com a fórmula cariotípica 2K= 6M+62A. Esse tipo de estudo complementa outros estudos iniciados por nosso grupo sobre a citogenética das formigas poneromorfas (sensu Bolton) e poderá contribuir no melhor entendimento da evolução das formigas deste grupo considerado primitivo.

Tabela de vida de fertilidade de três espécies neotropicais de Trichogrammatidae em ovos de hospedeiros alternativos como critério de seleção hospedeira

Tabela de vida de fertilidade de três espécies neotropicais de Trichogrammatidae em ovos de hospedeiros alternativos como critério de seleção hospedeira. O objetivo deste trabalho foi selecionar o hospedeiro alternativo que permita o melhor desenvolvimento das três espécies neotropicais de tricogramatídeos, Trichogramma atopovirilia Oatman & Platner, 1983; Trichogramma bruni Nagaraja, 1983 e Trichogrammatoidea annulata De Santis, 1972, utilizando-se como parâmetro comparativo as tabelas de vida de fertilidade nos respectivos hospedeiros. Foram estimados a duração média de uma geração (T), taxa líquida de reprodução (Ro), razão infinitesimal (r m) e a razão finita de aumento (λ). A tabela de vida de fertilidade pode ser utilizada para selecionar o hospedeiro alternativo mais adequado para as espécies de tricogramatídeos. Corcyra cephalonica (Stainton, 1865) (Lepidoptera, Pyralidae) foi o hospedeiro alternativo mais adequado para criação de T. annulata e de T. bruni, enquanto que para T. atopovirilia, Anagasta kuehniella (Zeller, 1879) (Lepidoptera, Pyralidae) e/ou C. cephalonica foram os hospedeiros mais adequados. Sitotroga cerealella (Olivier, 1819) (Lepidoptera, Gelechiidae) apresentou baixa capacidade de aumento populacional para as três espécies de parasitóides, sendo, portanto, uma espécie inadequada como hospedeiro alternativo para as mesmas.

When rare is just a matter of sampling: unexpected dominance of clubtail dragonflies (Odonata, Gomphidae) through different collecting methods at Parque Nacional da Serra do Cipó, Minas Gerais State, Brazil

When rare is just a matter of sampling: Unexpected dominance of clubtail dragonflies (Odonata, Gomphidae) through different collecting methods at Parque Nacional da Serra do Cipó, Minas Gerais State, Brazil. Capture of dragonfly adults during two short expeditions to Parque Nacional da Serra do Cipó, Minas Gerais State, using three distinct collecting methodsaerial nets, Malaise and light sheet trapsis reported. The results are outstanding due the high number of species of Gomphidae (7 out of 26 Odonata species), including a new species of Cyanogomphus Selys, 1873, obtained by two non-traditional collecting methods. Because active collecting with aerial nets is the standard approach for dragonfly inventories, we discuss some aspects of the use of traps, comparing our results with those in the literature, suggesting they should be used as complementary methods in faunistic studies. Furthermore, Zonophora campanulata annulata Belle, 1983 is recorded for the first time from Minas Gerais State and taxonomic notes about Phyllogomphoides regularis (Selys, 1873) and Progomphus complicatus Selys, 1854 are also given.

Linhagens de Trichogramma e Trichogrammatoidea para controle de Stenoma catenifer

O objetivo deste trabalho foi selecionar espécies e linhagens de Trichogramma e Trichogrammatoidea, com potencial para controle da broca-do-abacate Stenoma catenifer, considerada a principal praga do abacateiro (Persea americana Mill.). Experimentos em laboratório foram realizados com 12 linhagens das seguintes espécies, sendo: oito de Trichogramma pretiosum; uma de Trichogramma atopovirilia; duas de Trichogramma bruni; e uma de Trichogrammatoidea annulata. Em telado, determinou-se o número de parasitóides a ser liberado por ovo de S. catenifer. Os parâmetros biológicos avaliados em laboratório foram: duração do período ovo-adulto, emergência, parasitismo, razão sexual, número de parasitóides emergidos por ovo de S. catenifer e longevidade de fêmeas e machos. Em telado, avaliou-se o número de ovos parasitados. As espécies Trichogrammatoidea annulata e Trichogramma atopovirilia e suas linhagens foram selecionadas por parasitar maior número de ovos de S. catenifer. Nessas condições, o maior parasitismo foi obtido com uma proporção estimada de 28 e 30 parasitóides, por ovo da praga, respectivamente, para Trichogrammatoidea annulata e Trichogramma atopovirilia.

Seleção de hospedeiro alternativo para três espécies de tricogramatídeos neotropicais

O objetivo deste trabalho foi avaliar as características biológicas dos parasitóides Trichogrammatoidea annulata, Trichogramma atopovirilia e Trichogramma bruni, criados em hospedeiros alternativos durante diferentes gerações, para selecionar o melhor hospedeiro para a criação massal desses parasitóides. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente ao acaso, em esquema fatorial 3x3 (três hospedeiros - Anagasta kuehniella, Corcyra cephalonica e Sitotroga cerealella - e três gerações - 1ª, 10ª e 28ª). Avaliaram-se: o total de ovos parasitados por fêmea; a longevidade de fêmeas e machos; a duração do período ovo-adulto; a razão sexual; e a viabilidade dos parasitóides. Os parasitóides Trichogrammatoidea annulata e Trichogramma bruni apresentaram melhores resultados em C. cephalonica. Para Trichogramma atopovirilia, o hospedeiro alternativo é C. cephalonica ou A. kuehniella. O hospedeiro S. cerealella foi o menos adequado para as três espécies de parasitóides. Os tricogramatídeos avaliados apresentaram capacidade adaptativa aos hospedeiros alternativos preferenciais, ao longo das gerações.