Cyclic AMP-dependent protein lysine acylation in mycobacteria regulates fatty acid and propionate metabolism

Acetylation of lysine residues is a posttranslational modification that is used by both eukaryotes and prokaryotes to regulate a variety of biological processes. Here we identify multiple substrates for the cAMP-dependent protein lysine acetyltransferase from Mycobacterium tuberculosis (KATmt). We demonstrate that a catalytically important lysine residue in a number of FadD (fatty acyl CoA synthetase) enzymes is acetylated by KATmt in a cAMP-dependent manner and that acetylation inhibits the activity of FadD enzymes. A sirtuin-like enzyme can deacetylate multiple FadDs, thus completing the regulatory cycle. Using a strain deleted for the KATmt ortholog in Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG), we show for the first time that acetylation is dependent on intracellular cAMP levels. KATmt can utilize propionyl CoA as a substrate and, therefore, plays a critical role in alleviating propionyl CoA toxicity in mycobacteria by inactivating acyl CoA synthetase (ACS). The precision by which mycobacteria can regulate the metabolism of fatty acids in a cAMP-dependent manner appears to be unparalleled in other biological organisms and is ideally suited to adapt to the complex environment that pathogenic mycobacteria experience in the host.

In vitro and in silico biological studies of novel thiazolo3,2-a]pyrimidine-6-carboxylate derivatives

In the present study, we report the synthesis, characterization of new series of thiazolo3,2-a]pyrimidine-6-carboxylate derivatives 3a-f and 4a-f. The newly synthesized compounds were screened for in vitro antimicrobial and antiviral activities. The probable mode of action of these active compounds was determined through in silico docking study by docking the receptor methionyl-tRNA synthetase and human inosine-5'-monophosphate dehydrogenase (IMPDH) for antibacterial and antiviral activities, respectively. Among the compounds, 4c exhibited excellent in vitro antimicrobial activity against all tested strains with binding and docking energies -35.6 and -12.4 kcal/mol, respectively. The antiviral studies were carried out for the selected compounds in which 4a exhibited 73.69 and 54.42 % of inhibition of buffalopox and camelpox viruses, respectively. Furthermore, compound 4a showed minimum docking and binding energy along with the maximum hydrogen/hydrophobic interaction with IMPDH. The study contributes towards identification and screening of potential antimicrobial and antiviral agent's against the pathogens.

Temozolomide-modulated glioma proteome: Role of interleukin-1 receptor-associated kinase-4 (IRAK4) in chemosensitivity

The current treatment for glioblastoma includes temozolomide (TMZ) chemotherapy, yet the mechanism of action of TMZ is not thoroughly understood. Here, we investigated the TMZ-induced changes in the proteome of the glioma-derived cell line (U251) by 2D DIGE. We found 95 protein spots to be significantly altered in their expression after TMZ treatment. MS identified four upregulated spots: aspartyl tRNA synthetase glutathione synthetase, interleukin-1 receptor-associated kinase-4 (IRAK4), and breast carcinoma amplified sequence-1 and one downregulated spot: optineurin. TMZ-induced regulation of these five genes was validated by RT-qPCR andWestern blot analysis. RNAi-mediated knockdown of IRAK4, an important mediator of Toll-like receptors signaling and chemoresistance, rendered the glioma cells resistant to TMZ. High levels of IRAK4 induced upon TMZ treatment resulted in IRAK1 downregulation and inhibition of NFkB pathway. Endogenous IRAK4 protein, but not transcript levels in glioma cell lines, correlated with TMZ sensitivity. Thus, we have identified several TMZ-modulated proteins and discovered an important novel role for IRAK4 in determining TMZ sensitivity of glioma cells through its ability to inhibit Toll-like receptor signaling and NFkB pathway.

Impact of Mutating the Key Residues of a Bifunctional 5,10-Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase-Cyclohydrolase from Escherichia coli on Its Activities

Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolase (FolD) catalyzes interconversion of 5,10-methylene-tetrahydrofolate and 10-formyl-tetrahydrofolate in the one-carbon metabolic pathway. In some organisms, the essential requirement of 10-formyl-tetrahydrofolate may also be fulfilled by formyltetrahydrofolate synthetase (Fhs). Recently, we developed an Escherichia coli strain in which the folD gene was deleted in the presence of Clostridium perfringens fhs (E. coli Delta folD/p-fhs) and used it to purify FolD mutants (free from the host-encoded FolD) and determine their biological activities. Mutations in the key residues of E. coli FolD, as identified from three-dimensional structures (D121A, Q98K, K54S, Y50S, and R191E), and a genetic screen (G122D and C58Y) were generated, and the mutant proteins were purified to determine their kinetic constants. Except for the R191E and K54S mutants, others were highly compromised in terms of both dehydrogenase and cyclohydrolase activities. While the R191E mutant showed high cyclohydrolase activity, it retained only a residual dehydrogenase activity. On the other hand, the K54S mutant lacked the cyclohydrolase activity but possessed high dehydrogenase activity. The D121A and G122D (in a loop between two helices) mutants were highly compromised in terms of both dehydrogenase and cyclohydrolase activities. In vivo and in vitro characterization of wild-type and mutant (R191E, G122D, D121A, Q98K, C58Y, K54S, and Y50S) FolD together with three-dimensional modeling has allowed us to develop a better understanding of the mechanism for substrate binding and catalysis by E. coli FolD.

Asparagine requirement in Plasmodium berghei as a target to prevent malaria transmission and liver infections

The proteins of Plasmodium, the malaria parasite, are strikingly rich in asparagine. Plasmodium depends primarily on host haemoglobin degradation for amino acids and has a rudimentary pathway for amino acid biosynthesis, but retains a gene encoding asparagine synthetase (AS). Here we show that deletion of AS in Plasmodium berghei (Pb) delays the asexual-and liver-stage development with substantial reduction in the formation of ookinetes, oocysts and sporozoites in mosquitoes. In the absence of asparagine synthesis, extracellular asparagine supports suboptimal survival of PbAS knockout (KO) parasites. Depletion of blood asparagine levels by treating PbASKO-infected mice with asparaginase completely prevents the development of liver stages, exflagellation of male gametocytes and the subsequent formation of sexual stages. In vivo supplementation of asparagine in mice restores the exflagellation of PbASKO parasites. Thus, the parasite life cycle has an absolute requirement for asparagine, which we propose could be targeted to prevent malaria transmission and liver infections.

Ischaemic concentrations of lactate increase TREK1 channel activity by interacting with a single histidine residue in the carboxy terminal domain

Key points The physiological metabolite, lactate and the two-pore domain leak potassium channel, TREK1 are known neuroprotectants against cerebral ischaemia. However, it is not known whether lactate interacts with TREK1 channel to provide neuroprotection. In this study we show that lactate increases TREK1 channel activity and hyperpolarizes CA1 stratum radiatum astrocytes in hippocampal slices. Lactate increases open probability and decreases longer close time of the human (h)TREK1 channel in a concentration dependent manner. Lactate interacts with histidine 328 (H328) in the carboxy terminal domain of hTREK1 channel to decrease its dwell time in the longer closed state. This interaction was dependent on the charge on H328. Lactate-insensitive mutant H328A hTREK1 showed pH sensitivity similar to wild-type hTREK1, indicating that the effect of lactate on hTREK1 is independent of pH change. AbstractA rise in lactate concentration and the leak potassium channel TREK1 have been independently associated with cerebral ischaemia. Recent literature suggests lactate to be neuroprotective and TREK1 knockout mice show an increased sensitivity to brain and spinal cord ischaemia; however, the connecting link between the two is missing. Therefore we hypothesized that lactate might interact with TREK1 channels. In the present study, we show that lactate at ischaemic concentrations (15-30mm) at pH7.4 increases TREK1 current in CA1 stratum radiatum astrocytes and causes membrane hyperpolarization. We confirm the intracellular action of lactate on TREK1 in hippocampal slices using monocarboxylate transporter blockers and at single channel level in cell-free inside-out membrane patches. The intracellular effect of lactate on TREK1 is specific since other monocarboxylates such as pyruvate and acetate at pH7.4 failed to increase TREK1 current. Deletion and point mutation experiments suggest that lactate decreases the longer close dwell time incrementally with increase in lactate concentration by interacting with the histidine residue at position 328 (H328) in the carboxy terminal domain of the TREK1 channel. The interaction of lactate with H328 is dependent on the charge on the histidine residue since isosteric mutation of H328 to glutamine did not show an increase in TREK1 channel activity with lactate. This is the first demonstration of a direct effect of lactate on ion channel activity. The action of lactate on the TREK1 channel signifies a separate neuroprotective mechanism in ischaemia since it was found to be independent of the effect of acidic pH on channel activity. Key points The physiological metabolite, lactate and the two-pore domain leak potassium channel, TREK1 are known neuroprotectants against cerebral ischaemia. However, it is not known whether lactate interacts with TREK1 channel to provide neuroprotection. In this study we show that lactate increases TREK1 channel activity and hyperpolarizes CA1 stratum radiatum astrocytes in hippocampal slices. Lactate increases open probability and decreases longer close time of the human (h)TREK1 channel in a concentration dependent manner. Lactate interacts with histidine 328 (H328) in the carboxy terminal domain of hTREK1 channel to decrease its dwell time in the longer closed state. This interaction was dependent on the charge on H328. Lactate-insensitive mutant H328A hTREK1 showed pH sensitivity similar to wild-type hTREK1, indicating that the effect of lactate on hTREK1 is independent of pH change.

New insight into the architecture of oxy-anion pocket in unliganded conformation of GAT domains: A MD-simulation study

Human Guanine Monophosphate Synthetase (hGMPS) converts XMP to GMP, and acts as a bifunctional enzyme with N-terminal ``glutaminase'' (GAT) and C-terminal ``synthetase'' domain. The enzyme is identified as a potential target for anticancer and immunosuppressive therapies. GAT domain of enzyme plays central role in metabolism, and contains conserved catalytic residues Cys104, His190, and Glu192. MD simulation studies on GAT domain suggest that position of oxyanion in unliganded conformation is occupied by one conserved water molecule (W1), which also stabilizes that pocket. This position is occupied by a negatively charged atom of the substrate or ligand in ligand bound crystal structures. In fact, MD simulation study of Ser75 to Val indicates that W1 conserved water molecule is stabilized by Ser75, while Thr152, and His190 also act as anchor residues to maintain appropriate architecture of oxyanion pocket through water mediated H-bond interactions. Possibly, four conserved water molecules stabilize oxyanion hole in unliganded state, but they vacate these positions when the enzyme (hGMPS)-substrate complex is formed. Thus this study not only reveals functionally important role of conserved water molecules in GAT domain, but also highlights essential role of other non-catalytic residues such as Ser75 and Thr152 in this enzymatic domain. The results from this computational study could be of interest to experimental community and provide a testable hypothesis for experimental validation. Conserved sites of water molecules near and at oxyanion hole highlight structural importance of water molecules and suggest a rethink of the conventional definition of chemical geometry of inhibitor binding site.

Molecular Mechanism Underlying ATP-Induced Conformational Changes in the Nucleoprotein Filament of Mycobacterium smegmatis RecA

RecA plays a central role in bacterial DNA repair, homologous recombination, and restoration of stalled replication forks by virtue of its active extended nucleoprotein filament. Binding of ATP and its subsequent recognition by the carboxamide group of a highly conserved glutamine (GIn196 in MsRecA) have been implicated in the formation of active RecA nucleoprotein filaments. Although the mechanism of ATP-dependent structural transitions in RecA has been proposed on the basis of low-resolution electron microscopic reconstructions, the precise sequence of events that constitute these transitions is poorly understood. On the basis of biochemical and crystallographic analyses of MsRecA variants carrying mutations in highly conserved Gln196 and Arg198 residues, we propose that the disposition of the interprotomer interface is the structural basis of allosteric activation of RecA. Furthermore, this study accounts, for the contributions of several conserved amino acids to ATP hydrolysis and to the transition from collapsed to extended filament forms in Mycobacterium smegmatis RecA (MsRecA). In addition to their role in the inactive compressed state, the study reveals a role for GIn196 and Arg198 along with Phe219 in ATP hydrolysis in the active extended nucleoprotein filament. Finally, our data suggest that the primary, but not secondary, nucleotide binding site in MsRecA isomerizes into the ATP binding site present in the extended nucleoprotein filament.

Revealing, illuminating, and modifying proteins in human diseases using noncanonical amino acids

To better understand human diseases, much recent work has focused on proteins to either identify disease targets through proteomics or produce therapeutics via protein engineering. Noncanonical amino acids (ncAAs) are tools for altering the chemical and physical properties of proteins, providing a facile strategy not only to label proteins but also to engineer proteins with novel properties. My thesis research has focused on the development and applications of noncanonical amino acids in identifying, imaging, and engineering proteins for studying human diseases. Chapter 1 introduces the concept of ncAAs and reveals insights to how I chose my thesis projects.

ncAAs have been incorporated to tag and enrich newly synthesized proteins for mass spectrometry through a method termed BONCAT, or bioorthogonal noncanonical amino acid tagging. Chapter 2 describes the investigation of the proteomic response of human breast cancer cells to induced expression of tumor suppressor microRNA miR-126 by combining BONCAT with another proteomic method, SILAC or stable isotope labeling by amino acids in cell culture. This proteomic analysis led to the discovery of a direct target of miR-126, shedding new light on its role in suppressing cancer metastasis.

In addition to mass spectrometry, ncAAs can also be utilized to fluorescently label proteins. Chapter 3 details the synthesis of a set of cell-permeant cyclooctyne probes and demonstration of selective labeling of newly synthesized proteins in live mammalian cells using azidohomoalanine. Similar to live cell imaging, the ability to selectively label a particular cell type within a mixed cell population is important to interrogating many biological systems, such as tumor microenvironments. By taking advantage of the metabolic differences between cancer and normal cells, Chapter 5 discusses efforts to develop selective labeling of cancer cells using a glutamine analogue.

Furthermore, Chapter 4 describes the first demonstration of global replacement at polar amino acid positions and its application in developing an alternative PEGylation strategy for therapeutic proteins. Polar amino acids typically occupy solvent-exposed positions on the protein surface, and incorporation of noncanonical amino acids at these positions should allow easier modification and cause less perturbation compared to replacements at the interior positions of proteins.

Designing conformational control of human tissue transglutaminase

Understanding the mechanisms of enzymes is crucial for our understanding of their role in biology and for designing methods to perturb or harness their activities for medical treatments, industrial processes, or biological engineering. One aspect of enzymes that makes them difficult to fully understand is that they are in constant motion, and these motions and the conformations adopted throughout these transitions often play a role in their function.

Traditionally, it has been difficult to isolate a protein in a particular conformation to determine what role each form plays in the reaction or biology of that enzyme. A new technology, computational protein design, makes the isolation of various conformations possible, and therefore is an extremely powerful tool in enabling a fuller understanding of the role a protein conformation plays in various biological processes.

One such protein that undergoes large structural shifts during different activities is human type II transglutaminase (TG2). TG2 is an enzyme that exists in two dramatically different conformational states: (1) an open, extended form, which is adopted upon the binding of calcium, and (2) a closed, compact form, which is adopted upon the binding of GTP or GDP. TG2 possess two separate active sites, each with a radically different activity. This open, calcium-bound form of TG2 is believed to act as a transglutaminse, where it catalyzes the formation of an isopeptide bond between the sidechain of a peptide-bound glutamine and a primary amine. The closed, GTP-bound conformation is believed to act as a GTPase. TG2 is also implicated in a variety of biological and pathological processes.

To better understand the effects of TG2’s conformations on its activities and pathological processes, we set out to design variants of TG2 isolated in either the closed or open conformations. We were able to design open-locked and closed-biased TG2 variants, and use these designs to unseat the current understanding of the activities and their concurrent conformations of TG2 and explore each conformation’s role in celiac disease models. This work also enabled us to help explain older confusing results in regards to this enzyme and its activities. The new model for TG2 activity has immense implications for our understanding of its functional capabilities in various environments, and for our ability to understand which conformations need to be inhibited in the design of new drugs for diseases in which TG2’s activities are believed to elicit pathological effects.

Efeito protetor da L-arginina e L-glutamina no pênis de ratos submetidos à irradiação pélvica

Os aminoácidos L-arginina e L-glutamina foram analisados como protetores dos tecidos erétil do pênis contra os danos induzidos pela radiação. Grupos de ratos Wistar foram tratadas com: nenhuma intervenção, radiação pélvica e sacrifício 7 (RAD7) ou 15 (RAD15) dias; e radiação pélvica, a suplementação diária com L-arginina (A) ou L-glutamina (G), e sacrifício 7 (RAD7 + A, RAD7 + G) ou 15 (RAD15 + A, RAD15 + G) dias após irradiação. componentes estruturais do corpo cavernoso (CC), túnica albugínea do corpo esponjoso (TAC), e urotélio do pênis foram analisados através de métodos estereológicos e imuno-histoquímico. Os resultados mostraram que, no CC, o tecido conjuntivo foi maior nos RAD15 (p <0,04), mas essa mudança foi parcialmente revertido em RAD15 + G (p <0,05) e RAD15 + A (p <0,04). A matriz fibrosa das trabéculas CC estava manchada de colágeno tipo I. Nos RAD15, a intensidade da marcação foi aumentada, enquanto que em RAD15 + G + A e RAD15 a coloração era semelhante à dos controles. Nenhuma alteração de coloração foram observadas nos grupos que foram sacrificados sete dias após a radiação. Cavernosa teor de fibras elásticas na RAD15 foi aumentada (p <0,004), e este foi impedido de RAD15 + A (p <0,004), mas não em RAD15 + G. No TAC, os aminoácidos protegidos (p <0,02) contra o aumento da radiação induzida em fibras elásticas, mas apenas em RAD15. Densidade das células do urotélio e espessura urothellial, foram reduzidos em RAD15 (p <0,004), mas houve efeitos protetores dos dois aminoácidos. Em conclusão, a radiação induzida por alterações nas estruturas penianas tendem a ser mais pronunciado 15 dias após a sessão de radiação. Tanto A e G têm efeitos protetores contra estas alterações, sendo o primeiro um pouco mais eficaz.

Efeitos da suplementação oral com L-arginina e L-glutamina sobre a próstata ventral de ratos submetidos à irradiação

O objetivo deste trabalho foi verificar o possível efeito protetor da L-glutamina e da L-arginina sobre a próstata ventral de ratos quando administradas por gavagem. Procurou-se simular as condições clinicas de pacientes submetidos à radioterapia pélvica tendo como órgão alvo outro órgão pélvico que não a próstata. Foram analisados os efeitos desta irradiação sobre a próstata considerando este órgão como normal. Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos: Controle, animais não submetidos à irradiação (n= 10); Irradiado, submetidos à irradiação abdominal e sem suplementação adicional de aminoácido por 21 dias (n= 10); Irradiado + Lglutamina, submetidos à irradiação abdominal e com suplementação adicional de L- glutamina por 21 dias (n= 10); e Irradiado + L-arginina, submetidos à irradiação abdominal e com suplementação adicional de L- arginina por 21 dias (n= 9). Os grupos foram mantidos em condições padrão de laboratório durante todas as etapas do experimento. Os animais submetidos à irradiação abdominal receberam uma dose única de 1000 cGy no dia 8 da experimentação. A Lglutamina e a L-arginina foram dissolvidas em água destilada e administrada por gavagem através da agulha IC-810. As próstatas foram removidas e processadas para inclusão em parafina. Foram estudados os seguintes parâmetros: estrutura acinar (área dos ácinos e altura do epitélio) e colágeno analisados por métodos morfométricos e peso corporal. O ganho de peso nos grupos suplementados foi significativamente maior se comparado ao grupo irradiado. Houve redução da altura do epitélio no grupo irradiado quando comparado ao controle. A altura do epitélio no grupo suplementado com L-arginina foi significativamente maior do que nos grupos irradiado e suplementado com L-glutamina. Houve diminuição, de aproximadamente 18%, da área dos ácinos no grupo suplementado com L-glutamina. Já no grupo suplementado com Larginina o valor foi similar ao do controle. O efeito da L-glutamina sobre o parênquima prostático foi o de manter proporcionalmente o colágeno, preservando a integridade da matriz extracelular. No grupo suplementado com L-arginina, apesar da discreta redução na distribuição proporcional de colágeno este também manteve índices semelhantes ao do controle. A radiação abdominal promoveu algumas modificações estruturais na próstata ventral de ratos. Essas modificações podem ser parcialmente prevenidas pela suplementação oral com L-glutamina e de L-arginina.

Efetividade das dietas enriquecidas com imunonutrientes na redução de complicações e mortalidade em pacientes críticos: abordagem pela utilização de metanálise

Nutrientes específicos, denominados farmaconutrientes, demonstraram possuir a capacidade de modular a resposta imunológica e inflamatória de animais e seres humanos, em estudos clínicos e laboratoriais. Dentre os substratos conhecidos, os que têm maior relevância e ação imunomoduladora são a arginina, glutamina, ácido graxo n-3 e nucleotídeos. No entanto, revisões sistemáticas e meta-análises buscam consenso em relação aos vários e controversos resultados publicados sobre os possíveis benefícios da imunonutrição em pacientes críticos. Nossos objetivos foram avaliar a efetividade das dietas enriquecidas com Imunonutrientes na redução de complicações e mortalidade nos diferentes tipos de pacientes críticos. O presente estudo é uma revisão sistemática com metanálise onde foram inseridos ensaios clínicos randomizados avaliando o uso de nutrientes imunomoduladores em doente adulto de ambos os sexos, definido como crítico traumatizado, séptico, queimado ou cirúrgico; as dietas utilizadas deveriam conter um ou mais dos imunonutrientes, em qualquer dose, administradas por via enteral comparadas à dieta padrão pela mesma via em pelo menos um dos grupos de comparação. As bases de dados consultadas foram Pubmed e Cinhal, utilizando os termos: Immunonutrition, arginine, glutamine, n-3, nucleotides e criticall illness. De 206 artigos encontrados inicialmente, apenas 35 preencheram os critérios de elegibilidade estabelecidos. Destes 35 ensaios clínicos, 18 foram conduzidos em pacientes cirúrgicos, 6 em pacientes traumatizados, 5 em pacientes queimados, 5 em pacientes críticos em geral e 1 em pacientes sépticos. Para a população geral, não houve redução significativa do risco de morrer indicada pelo RR de 0,84 (IC de 0,68 a 1,05) e os queimados foram mais protegidos de morrer com RR de 0,25 (IC de 0,09 a 0,66); as complicações infecciosas foram reduzidas com RR de 0,56 (IC de 0,42 a 0,73); a incidência de sepse foi reduzida com RR de 0,45 (IC de 0,29 a 0,69), especialmente nos pacientes traumatizados com RR de 0,42 (IC de 0,26 a 0,68); a incidência de abscesso abdominal também foi reduzida com RR de 0,39 (IC de 0,21 a 0,72) e também de bacteremia com RR de 0,46 (IC de 0,31 a 0,66); o tempo de internação hospitalar diminuiu -3,9 dias (IC de -5,0 a -2,8). Para a população de pacientes cirúrgicos: o óbito não apresentou redução significativa do RR de 0,93 (IC de 0,44 a 1,95), as complicações infecciosas foram reduzidas com RR de 0,51 (IC de 0,41 a 0,63), o tempo de internação hospitalar foi reduzido - 3,41 dias (IC de -4,25 a -2,58) e o tempo de internação em UTI -1,72 dias (IC de -2,12 a -1,31). A utilização de dietas com nutrientes imunomoduladores não alterou a mortalidade em doentes críticos ou cirúrgicos. Indivíduos com mais de 60 anos são menos protegidos de morrer pela utilização de dietas com imunomoduladores. As complicações infecciosas são reduzidas em pacientes críticos com a utilização de imunonutrição, em especial a população de pacientes cirúrgicos. Dietas com mais de 10g/l de arginina protegem mais os pacientes críticos da incidência de complicações infecciosas. Pacientes traumatizados são protegidos da incidência de sepse pela utilização da imunonutrição. O tempo de internação hospitalar e o tempo de internação em UTI foram reduzidos em críticos e cirúrgicos com imunonutrição. A execução de ensaios clínicos explanatórios nos diferentes tipos de doentes críticos com um nutriente imunomodulador isolado, seguida de ensaios pragmáticos de acordo com os resultados dos anteriores, é um fato a ser considerado em futuras pesquisas.

Efeito da suplementação dietética com L-glutamina na sepse abdominal induzida em rato

Após o estímulo deflagrador de um trauma ou infecção, a liberação de citocinas na circulação sanguínea desempenha um importante papel efetor e também modulador da resposta imune sistêmica. Essas citocinas podem ser pró-inflamatórias, que estimulam a liberação de diversos tipos celulares e de outras citocinas, como fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-6, IL-8, IL-12 e interferon-gama (INF-); ou citocinas com efeitos antiinflamatórios, que inibem o processo inflamatório, em parte pela redução da produção de diversas citocinas que regulam positivamente a resposta, minimizando o comprometimento orgânico resultante, como IL-4, IL-10, IL-13. A L-glutamina é o aminoácido mais abundante no organismo, com importante papel no metabolismo protéico. Sua ação trófica sobre a mucosa do intestino delgado é bastante conhecida, o que o torna componente essencial para a manutenção estrutural e funcional do intestino. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação dietética com L-glutamina na modulação da resposta inflamatória em animais submetidos a sepse abdominal induzida por ligadura e perfuração cecal. Foram utilizados 24 ratos Wistar machos adultos, com peso inicial entre 200 e 230 g, distribuídos em três grupos, cada um com oito animais, da seguinte forma: grupo I (controle) submetidos a operação simulada (laparotomia e manipulação de alças intestinais); grupo II submetidos a laparotomia, com indução de sepse abdominal; e grupo III receberam suplementação dietética com L-glutamina por sete dias e, após, foram submetidos a indução de sepse abdominal. Foram coletadas amostras sanguíneas de todos os animais antes (tempo 0) e duas e quatro horas (tempos 1 e 2) após a indução da sepse abdominal. Foram verificados o número de leucócitos, a dosagem da concentração plasmática de citocinas pró- e antiinflamatórias (INF-γ, IL-6 e IL-10) e análise microbiológica de líquido peritoneal. A glicemia apresentou aumento significativo em todos os grupos, comparando-os ao início e ao final do experimento (p<0,05). No que concerne à IL-10, observou-se aumento significativo nos animais do grupo III entre os tempos 0 e 2, e entre os tempos 1 e 2 (p=0,0331 e p=0,0155, respectivamente). Não se observou qualquer outra diferença ao serem analisadas as demais citocinas (IFN- e IL-6), em todos os grupos e em todos os momentos analisados. Nossos achados sugerem que a suplementação dietética com L-glutamina em animais submetidos à indução de sepse abdominal com modelo CLP parece potencializar a resposta antiinflamatória, aumentando a concentração plasmática de IL-10, enquanto as concentrações de INF-γ e IL-6 não apresentaram variação significativa.

Efeito radioprotetor da L-Glutamina na parede da bexiga de ratos submetidos à irradiação pélvica

A radioterapia é frequentemente utilizada no tratamento de tumores da próstata, porém durante esse procedimento a bexiga sadia usualmente sofre efeitos colaterais. Através do uso de um modelo animal para irradiação pélvica, avaliamos se a suplementação nutricional com L-glutamina poderia prevenir possíveis danos na parede da bexiga, especialmente em suas camadas mais superficiais. Ratos Wistar adultos machos com idade entre 3 e 4 meses foram separados em grupos de 8 animais: grupo controle que não recebeu a irradiação; grupos somente irradiados que foram mortos 7 (R7) e 15 dias (R15) após a irradiação (dose única de 10 Gy na região pélvico-abdominal); grupos irradiados e suplementados com L-glutamina (0,65g/kg de peso por dia), que foram mortos 7 (RG7) ou 15 após a irradiação. Células e vasos sanguíneos da lâmina própria, bem como o urotélio, foram avaliados com métodos histológicos. No urotélio foram feitas análises da altura e densidade nuclear e na lâmina própria densidade celular, densidade vascular e o número de mastócitos. Os resultados mostraram que em R7, a altura e densidade nuclear do urotélio e a densidade celular da lâmina própria não foram alterados significativamente. Entretanto a densidade dos vasos sanguíneos foi reduzida em 48% (p<0,05) e essa alteração foi evitada pela glutamina (p <0,02). No grupo R15, a densidade celular do epitélio aumentou em 35% (p<0,02). A densidade celular da lâmina própria não apresentou diferença estatística entre os grupos. Os mastócitos na lâmina própria foram reduzidos em R7 e R15. Apesar de ainda reduzidos em RG7 em RG15 houve aumento no número desse tipo celular o que sugere uma ação positiva da glutamina. Células α-actina positivas na lâmina própria formam uma camada suburotelial e foram identificadas como miofibroblastos. A espessura dessa camada aumentou em R7, mas foi semelhante ao controle em RG7, enquanto alterações em R15 e RG15 foram menos evidentes. Esses resultados mostraram que a utilização da L-glutamina antes e após a radioterapia deve ser considerada para uso humano na proteção da bexiga contra os efeitos da radiação.