Mass spectrometry-based protein profiling strategies for biomarker discovery in liver and inflammatory bowel diseases

The study of protein expression profiles for biomarker discovery in serum and in mammalian cell populations needs the continuous improvement and combination of proteins/peptides separation techniques, mass spectrometry, statistical and bioinformatic approaches. In this thesis work two different mass spectrometry-based protein profiling strategies have been developed and applied to liver and inflammatory bowel diseases (IBDs) for the discovery of new biomarkers. The first of them, based on bulk solid-phase extraction combined with matrix-assisted laser desorption/ionization - Time of Flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and chemometric analysis of serum samples, was applied to the study of serum protein expression profiles both in IBDs (Crohn’s disease and ulcerative colitis) and in liver diseases (cirrhosis, hepatocellular carcinoma, viral hepatitis). The approach allowed the enrichment of serum proteins/peptides due to the high interaction surface between analytes and solid phase and the high recovery due to the elution step performed directly on the MALDI-target plate. Furthermore the use of chemometric algorithm for the selection of the variables with higher discriminant power permitted to evaluate patterns of 20-30 proteins involved in the differentiation and classification of serum samples from healthy donors and diseased patients. These proteins profiles permit to discriminate among the pathologies with an optimum classification and prediction abilities. In particular in the study of inflammatory bowel diseases, after the analysis using C18 of 129 serum samples from healthy donors and Crohn’s disease, ulcerative colitis and inflammatory controls patients, a 90.7% of classification ability and a 72.9% prediction ability were obtained. In the study of liver diseases (hepatocellular carcinoma, viral hepatitis and cirrhosis) a 80.6% of prediction ability was achieved using IDA-Cu(II) as extraction procedure. The identification of the selected proteins by MALDITOF/ TOF MS analysis or by their selective enrichment followed by enzymatic digestion and MS/MS analysis may give useful information in order to identify new biomarkers involved in the diseases. The second mass spectrometry-based protein profiling strategy developed was based on a label-free liquid chromatography electrospray ionization quadrupole - time of flight differential analysis approach (LC ESI-QTOF MS), combined with targeted MS/MS analysis of only identified differences. The strategy was used for biomarker discovery in IBDs, and in particular of Crohn’s disease. The enriched serum peptidome and the subcellular fractions of intestinal epithelial cells (IECs) from healthy donors and Crohn’s disease patients were analysed. The combining of the low molecular weight serum proteins enrichment step and the LCMS approach allowed to evaluate a pattern of peptides derived from specific exoprotease activity in the coagulation and complement activation pathways. Among these peptides, particularly interesting was the discovery of clusters of peptides from fibrinopeptide A, Apolipoprotein E and A4, and complement C3 and C4. Further studies need to be performed to evaluate the specificity of these clusters and validate the results, in order to develop a rapid serum diagnostic test. The analysis by label-free LC ESI-QTOF MS differential analysis of the subcellular fractions of IECs from Crohn’s disease patients and healthy donors permitted to find many proteins that could be involved in the inflammation process. Among them heat shock protein 70, tryptase alpha-1 precursor and proteins whose upregulation can be explained by the increased activity of IECs in Crohn’s disease were identified. Follow-up studies for the validation of the results and the in-depth investigation of the inflammation pathways involved in the disease will be performed. Both the developed mass spectrometry-based protein profiling strategies have been proved to be useful tools for the discovery of disease biomarkers that need to be validated in further studies.

Computational investigation of the Plasmodium falciparum fatty acid biosynthetic pathway toward the discovery of novel antimalarials

The structural peculiarities of a protein are related to its biological function. In the fatty acid elongation cycle, one small carrier protein shuttles and delivers the acyl intermediates from one enzyme to the other. The carrier has to recognize several enzymatic counterparts, specifically interact with each of them, and finally transiently deliver the carried substrate to the active site. Carry out such a complex game requires the players to be flexible and efficiently adapt their structure to the interacting protein or substrate. In a drug discovery effort, the structure-function relationships of a target system should be taken into account to optimistically interfere with its biological function. In this doctoral work, the essential role of structural plasticity in key steps of fatty acid biosynthesis in Plasmodium falciparum is investigated by means of molecular simulations. The key steps considered include the delivery of acyl substrates and the structural rearrangements of catalytic pockets upon ligand binding. The ground-level bases for carrier/enzyme recognition and interaction are also put forward. The structural features of the target have driven the selection of proper drug discovery tools, which captured the dynamics of biological processes and could allow the rational design of novel inhibitors. The model may be perspectively used for the identification of novel pathway-based antimalarial compounds.

Bioanalytical applications of multicolour bioluminescence imaging: new tools for drug discovery and development

The subject of this thesis is multicolour bioluminescence analysis and how it can provide new tools for drug discovery and development.The mechanism of color tuning in bioluminescent reactions is not fully understood yet but it is object of intense research and several hypothesis have been generated. In the past decade key residues of the active site of the enzyme or in the surface surrounding the active site have been identified as responsible of different color emission. Anyway since bioluminescence reaction is strictly dependent from the interaction between the enzyme and its substrate D-luciferin, modification of the substrate can lead to a different emission spectrum too. In the recent years firefly luciferase and other luciferases underwent mutagenesis in order to obtain mutants with different emission characteristics. Thanks to these new discoveries in the bioluminescence field multicolour luciferases can be nowadays employed in bioanalysis for assay developments and imaging purposes. The use of multicolor bioluminescent enzymes expanded the potential of a range of application in vitro and in vivo. Multiple analysis and more information can be obtained from the same analytical session saving cost and time. This thesis focuses on several application of multicolour bioluminescence for high-throughput screening and in vivo imaging. Multicolor luciferases can be employed as new tools for drug discovery and developments and some examples are provided in the different chapters. New red codon optimized luciferase have been demonstrated to be improved tools for bioluminescence imaging in small animal and the possibility to combine red and green luciferases for BLI has been achieved even if some aspects of the methodology remain challenging and need further improvement. In vivo Bioluminescence imaging has known a rapid progress since its first application no more than 15 years ago. It is becoming an indispensable tool in pharmacological research. At the same time the development of more sensitive and implemented microscopes and low-light imager for a better visualization and quantification of multicolor signals would boost the research and the discoveries in life sciences in general and in drug discovery and development in particular.

MetaVaccinology: a new vaccine discovery tool

In the last decade, the reverse vaccinology approach shifted the paradigm of vaccine discovery from conventional culture-based methods to high-throughput genome-based approaches for the development of recombinant protein-based vaccines against pathogenic bacteria. Besides reaching its main goal of identifying new vaccine candidates, this new procedure produced also a huge amount of molecular knowledge related to them. In the present work, we explored this knowledge in a species-independent way and we performed a systematic in silico molecular analysis of more than 100 protective antigens, looking at their sequence similarity, domain composition and protein architecture in order to identify possible common molecular features. This meta-analysis revealed that, beside a low sequence similarity, most of the known bacterial protective antigens shared structural/functional Pfam domains as well as specific protein architectures. Based on this, we formulated the hypothesis that the occurrence of these molecular signatures can be predictive of possible protective properties of other proteins in different bacterial species. We tested this hypothesis in Streptococcus agalactiae and identified four new protective antigens. Moreover, in order to provide a second proof of the concept for our approach, we used Staphyloccus aureus as a second pathogen and identified five new protective antigens. This new knowledge-driven selection process, named MetaVaccinology, represents the first in silico vaccine discovery tool based on conserved and predictive molecular and structural features of bacterial protective antigens and not dependent upon the prediction of their sub-cellular localization.

Nuclear structure studies in the xenon and radon region and the discovery of a new radon isotope by Penning trap mass spectrometry

Heutzutage gewähren hochpräzise Massenmessungen mit Penning-Fallen tiefe Einblicke in die fundamentalen Eigenschaften der Kernmaterie. Zu diesem Zweck wird die freie Zyklotronfrequenz eines Ions bestimmt, das in einem starken, homogenen Magnetfeld gespeichert ist. Am ISOLTRAP-Massenspektrometer an ISOLDE / CERN können die Massen von kurzlebigen, radioaktiven Nukliden mit Halbwertszeiten bis zu einigen zehn ms mit einer Unsicherheit in der Größenordnung von 10^-8 bestimmt werden. ISOLTRAP besteht aus einem Radiofrequenz-Quadrupol zum akkumulieren der von ISOLDE gelieferten Ionen, sowie zwei Penning-Fallen zum säubern und zur Massenbestimmung der Ionen. Innerhalb dieser Arbeit wurden die Massen von neutronenreichen Xenon- und Radonisotopen (138-146Xe und 223-229Rn) gemessen. Für elf davon wurde zum ersten Mal die Masse direkt bestimmt; 229Rn wurde im Zuge dieses Experimentes sogar erstmalig beobachtet und seine Halbwertszeit konnte zu ungefähr 12 s bestimmt werden. Da die Masse eines Nuklids alle Wechselwirkungen innerhalb des Kerns widerspiegelt, ist sie einzigartig für jedes Nuklid. Eine dieser Wechselwirkungen, die Wechselwirkung zwischen Protonen und Neutronen, führt zum Beispiel zu Deformationen. Das Ziel dieser Arbeit ist eine Verbindung zwischen kollektiven Effekten, wie Deformationen und Doppeldifferenzen von Bindungsenergien, sogenannten deltaVpn-Werten zu finden. Insbesondere in den hier untersuchten Regionen zeigen deltaVpn-Werte ein sehr ungewöhnliches Verhalten, das sich nicht mit einfachen Argumenten deuten lässt. Eine Erklärung könnte das Auftreten von Oktupoldeformationen in diesen Gebieten sein. Nichtsdestotrotz ist eine quantitative Beschreibung von deltaVpn-Werten, die den Effekt von solchen Deformationen berücksichtigt mit modernen Theorien noch nicht möglich.

Una base dati per il knowledge discovery in genetica medica

L'innovazione delle tecnologie di sequenziamento negli ultimi anni ha reso possibile la catalogazione delle varianti genetiche nei campioni umani, portando nuove scoperte e comprensioni nella ricerca medica, farmaceutica, dell'evoluzione e negli studi sulla popolazione. La quantità di sequenze prodotta è molto cospicua, e per giungere all'identificazione delle varianti sono necessari diversi stadi di elaborazione delle informazioni genetiche in cui, ad ogni passo, vengono generate ulteriori informazioni. Insieme a questa immensa accumulazione di dati, è nata la necessità da parte della comunità scientifica di organizzare i dati in repository, dapprima solo per condividere i risultati delle ricerche, poi per permettere studi statistici direttamente sui dati genetici. Gli studi su larga scala coinvolgono quantità di dati nell'ordine dei petabyte, il cui mantenimento continua a rappresentare una sfida per le infrastrutture. Per la varietà e la quantità di dati prodotti, i database giocano un ruolo di primaria importanza in questa sfida. Modelli e organizzazione dei dati in questo campo possono fare la differenza non soltanto per la scalabilità, ma anche e soprattutto per la predisposizione al data mining. Infatti, la memorizzazione di questi dati in file con formati quasi-standard, la dimensione di questi file, e i requisiti computazionali richiesti, rendono difficile la scrittura di software di analisi efficienti e scoraggiano studi su larga scala e su dati eterogenei. Prima di progettare il database si è perciò studiata l’evoluzione, negli ultimi vent’anni, dei formati quasi-standard per i flat file biologici, contenenti metadati eterogenei e sequenze nucleotidiche vere e proprie, con record privi di relazioni strutturali. Recentemente questa evoluzione è culminata nell’utilizzo dello standard XML, ma i flat file delimitati continuano a essere gli standard più supportati da tools e piattaforme online. È seguita poi un’analisi dell’organizzazione interna dei dati per i database biologici pubblici. Queste basi di dati contengono geni, varianti genetiche, strutture proteiche, ontologie fenotipiche, relazioni tra malattie e geni, relazioni tra farmaci e geni. Tra i database pubblici studiati rientrano OMIM, Entrez, KEGG, UniProt, GO. L'obiettivo principale nello studio e nella modellazione del database genetico è stato quello di strutturare i dati in modo da integrare insieme i dati eterogenei prodotti e rendere computazionalmente possibili i processi di data mining. La scelta di tecnologia Hadoop/MapReduce risulta in questo caso particolarmente incisiva, per la scalabilità garantita e per l’efficienza nelle analisi statistiche più complesse e parallele, come quelle riguardanti le varianti alleliche multi-locus.

Discovery and Pharmacological Characterization of a Novel Small Molecule Antagonist of Integrin α4β1: Focus on Antiallergic Activity

Allergy is a common hypersensitivity disorder that affects 15% to 20% of the population and its prevalence is increasing worldwide. Its severity correlates with the degree of eosinophil infiltration into the conjunctiva, which is mediated by chemokines that stimulate the production of adhesion molecules like intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) on the endothelial cell surface. The α4β1 and α4β7 integrins are expressed in eosinophils and contribute to their activation and infiltration in AC through the binding to VCAM-1 or fibronectin, expressed on vascular endothelial cells. Blockade of α4 integrins might be a therapeutical achievement in allergic eye diseases. DS 70, that show an IC50 in the nanomolar range against α4β1 integrin in Jurkat cells and in the eosinophilic cell line EOL-1. This compound was able to prevent cell adhesion to VCAM-1 and FN in vitro. In a scintillation proximity assay DS70 displaced 125I-FN binding to human α4β1 integrin and, in flow cytometry analysis, it antagonized the binding of a primary antibody to α4β1 integrin expressed on the Jurkat cells surface as well. Furthermore, we analysed also its effects on integrin α4β1 signalling. In an vivo model of allergic conjunctivitis, topical DS70 reduced the clinical aspects of EPR (early phase reaction) and LPR (late phase reaction), by reducing clinical score, eosinophil accumulation, mRNA levels of cytochines and chemochines pro-inflammatory and the conjunctival expression of α4 integrin. In conclusion, DS70 seems a novel antiallergic ocular agent that has significant effects on both early and late phases of ocular allergy.

Discovery di dispositivi embedded e raccolta di dati con bluetooth e bluetooth smart

L'obbiettivo di questa tesi è la produzione del prototipo di un sistema che sia in grado di ottenere dati da un insieme di sensori per poterli poi trasmettere all’utente, in modo che esso sia maggiormente cosciente del mondo che lo circonda. Affronteremo la sfida in uno scenario medico / di soccorso, dove un operatore si avvicinerà ad un gruppo di pazienti con l’intenzione di ottenere i parametri vitali di uno di essi. All'interno del documento saranno descritte le tecnologie sfruttate per la realizzazione del prototipo: Bluetooth e Bluetooth Smart, il sistema operativo Linux in esecuzione su un Raspberry Pi dotato di sensori, il sistema operativo Android in esecuzione su smartphone o tablet e iBeacon. Verranno poi analizzati i requisiti del sistema da realizzare. Infine verrà descritta l'implementazione utilizzata nel prototipo e analizzato il suo comportamento.

Analisi e progettazione di un sistema di link discovery semi-automatico nell'ambito dei Linked Open Data

Lo scopo di questo elaborato è di analizzare e progettare un sistema in grado di supportare la definizione dei dati nel formato utilizzato per definire in modo formale la semantica dei dati, ma soprattutto nella complessa e innovativa attività di link discovery. Una attività molto potente che, tramite gli strumenti e le regole del Web Semantico (chiamato anche Web of Data), permette data una base di conoscenza sorgente ed altre basi di conoscenza esterne e distribuite nel Web, di interconnettere i dati della base di conoscenza sorgente a quelli esterni sulla base di complessi algoritmi di interlinking. Questi algoritmi fanno si che i concetti espressi sulla base di dati sorgente ed esterne vengano interconnessi esprimendo la semantica del collegamento ed in base a dei complessi criteri di confronto definiti nel suddetto algoritmo. Tramite questa attività si è in grado quindi di aumentare notevolmente la conoscenza della base di conoscenza sorgente, se poi tutte le basi di conoscenza presenti nel Web of Data seguissero questo procedimento, la conoscenza definita aumenterebbe fino a livelli che sono limitati solo dalla immensa vastità del Web, dando una potenza di elaborazione dei dati senza eguali. Per mezzo di questo sistema si ha l’ambizioso obiettivo di fornire uno strumento che permetta di aumentare sensibilmente la presenza dei Linked Open Data principalmente sul territorio nazionale ma anche su quello internazionale, a supporto di enti pubblici e privati che tramite questo sistema hanno la possibilità di aprire nuovi scenari di business e di utilizzo dei dati, dando una potenza al dato che attualmente è solo immaginabile.

Discovery copy

Programma per il riconoscimento di copie di programmi in linguaggio C

Tecniche di resource discovery nel grid computing

In questa tesi vengono analizzate le principali tecniche di Resource Discovery in uso nei sistemi di Grid Computing, valutando i principali vantaggi e svantaggi di ogni soluzione. Particolare attenzione verrà riposta sul Resource Discovery ad Agenti, che si propone come architettura capace di risolvere in maniera definitiva i classici problemi di queste reti. All'interno dell'elaborato, inoltre, ogni tecnica presentata verrà arricchita con una sua implementazione pratica: tra queste, ricordiamo MDS, Chord e l'implementazione Kang.

DTN discovery and routing: from space applications to terrestrial networks.

L'argomento di questa tesi è l'architettura di rete Delay-/Disruption-Tolerant Networking (DTN), progettata per operare nelle reti “challenged”, dove la suite di protocolli TCP/IP risulta inefficace a causa di lunghi ritardi di propagazione del segnale, interruzioni e disturbi di canale, ecc. Esempi di reti “challenged” variano dalle reti interplanetarie alle Mobile Ad-Hoc Networks (MANETs). Le principali implementazioni dell'architettura DTN sono DTN2, implementazione di riferimento, e ION, sviluppata da NASA JPL per applicazioni spaziali. Una grande differenza tra reti spaziali e terrestri è che nello spazio i movimenti dei nodi sono deterministici, mentre non lo sono per i nodi mobili terrestri, i quali generalmente non conoscono la topologia della rete. Questo ha portato allo sviluppo di diversi algoritmi di routing: deterministici per le reti spaziali e opportunistici per quelle terrestri. NASA JPL ha recentemente deciso di estendere l'ambito di applicazione di ION per supportare anche scenari non deterministici. Durante la tesi, svolta presso NASA JPL, mi sono occupato di argomenti diversi, tutti finalizzati a questo obiettivo. Inizialmente ho testato la nuova implementazione dell'algoritmo IP Neighbor Discovery (IPND) di ION, corretti i bug e prodotta la documentazione ufficiale. Quindi ho contribuito ad integrare il Contact Graph Routing (CGR) di ION nel simulatore DTN “ONE” utilizzando la Java Native Interface (JNI) come ponte tra il codice Java di ONE e il codice C di ION. In particolare ho adattato tutte le librerie di ION necessarie per far funzionare CGR all'interno dell'ambiente di ONE. Infine, dopo aver analizzato un dataset di tracce reali di nodi mobili, ho contribuito a progettare e a sviluppare OCGR, estensione opportunistica del CGR, quindi ne ho curato l'integrazione in ONE. I risultati preliminari sembrano confermare la validità di OCGR che, una volta messo a punto, può diventare un valido concorrente ai più rinomati algoritmi opportunistici.

Scalable and Seamless Discovery and Selection of Services in Mobile Cloud Computing

Mobile devices are now capable of supporting a wide range of applications, many of which demand an ever increasing computational power. To this end, mobile cloud computing (MCC) has been proposed to address the limited computation power, memory, storage, and energy of such devices. An important challenge in MCC is to guarantee seamless discovery of services. To this end, this thesis proposes an architecture that provides user-transparent and low-latency service discovery, as well as automated service selection. Experimental results on a real cloud computing testbed demonstrated that the proposed work outperforms state of-the-art approaches by achieving extremely low discovery delay.

Servizi di Discovery in IoT: una Soluzione MQTT-based per Gateway Kura

Grazie alla costante evoluzione tecnologica, negli ultimi anni sempre più oggetti di vita quotidiana stanno accedendo ad Internet. Il proliferare dei dispositivi “smart” ha dato il via ad una nuova rivoluzione tecnologica: quella di Internet of Things (IoT), che sta portando nelle mani degli utenti un elevatissimo numero di informazioni in grado di offrire notevoli benefici alla vita di ogni giorno. Per poter accedere ai dati messi a disposizione risulterà necessario realizzare un servizio in grado di consentire la scoperta, l’accesso e l’interazione con i nodi della rete che si occuperanno della gestione delle informazioni. In letteratura sono già disponibili alcuni di questi meccanismi, ma essi presentano dei difetti che verrebbero ancor più accentuati dalle ridotte capacità computazionali dei terminali IoT. In questo progetto di tesi verrà presentato un servizio di discovery per gateway IoT Kura-based, pensato, grazie all’utilizzo del protocollo di messaggistica MQTT, per operare con terminali dalle performance limitate ed in situazioni di scarsa connettività. Il servizio realizzato prevede che degli smartphone Android richiedano a tutti i gateway in una determinata località i parametri per entrare nel loro network. La richiesta verrà inviata mediante un messaggio MQTT pubblicato in un topic location-specific su un broker remoto. I gateway che riceveranno il messaggio, se interessati alle caratteristiche del client, gli risponderanno comunicando i dati di accesso al network in modo che il dispositivo possa auto-configurarsi per accedervi. Ad accesso avvenuto client e gateway comunicheranno in modo diretto attraverso un broker locale. In fase di testing si valuteranno le performance del servizio analizzando i tempi di risposta e l’utilizzo di risorse lato gateway, e l’assorbimento di potenza lato client.