Stabilità e variabilità del cammino in acqua

La camminata, sia in acqua sia a secco, è un esercizio praticato frequentemente in ambito riabilitativo. Lo scopo di questa tesi è di confrontare variabilità e stabilità del cammino dentro e fuori dall’acqua, al fine di comprendere le caratteristiche dei due tipi di cammino. L’analisi si è focalizzata sulla valutazione di misure di stabilità e variabilità che non erano mai state indagate prima per la camminata in acqua: Harmonic Ratio, Plot di Poincarè, moltiplicatori di Floquet, esponenti di Lyapunov, multiscale entropy, recurrence rate, determinism, averaged diagonal line length, maximum diagonal line length e divergenza. Gli indici sono stati calcolati su camminate di 30 e di 90 passi. Da questa analisi possiamo stimare anche quale parametro è già affidabile a 30 passi e non cambia se analizzato a 90 o se un parametro necessita di più passi per risultare affidabile. Inoltre è stata effettuata indagine statistica tramite test di Kruskal-Wallis. Dall'analisi è emerso che la camminata in acqua è più stabile, meno smooth, c’è un maggiore controllo posturale lungo gli assi antero-posteriore e medio-laterale e che il cammino è condotto in maniera meno automatica.

Caratteristiche qualitative delle carni bovine

Lo scopo di questo elaborato di tesi è stato quello di condurre uno studio preliminare volto ad indagare le principali caratteristiche qualitative delle carni bovine in funzione dell’origine e dell’età degli animali. Nel corso della sperimentazione sono stati analizzati 24 campioni di carne bovina ottenuti da animali di origine francese ed italiana di età compresa fra 15 e 23 mesi, acquistati presso la grande distribuzione o acquisiti direttamente dalle aziende produttrici. Da ciascun campione sono state ricavate delle porzioni di 6 mm di spessore impiegate, a loro volta, per la preparazione di sotto-campioni da sottoporre a determinazione di pH, colore, Expressible Moisture (EM %) e sforzo di taglio. Nell’ambito di ciascun parametro, l’insieme dei dati è stato analizzato mediante analisi statistica di tipo descrittivo. Successivamente, calcolata la matrice delle correlazioni fra i parametri oggetto di studio i dati sono stati elaborati mediante analisi multivariata con il metodo delle componenti principali (Principal Component Analysis, PCA) allo scopo di verificare se fosse possibile discriminare la qualità della carne in funzione dell’origine e dell’età degli animali. Quanto emerso evidenzia come non sia possibile discriminare la qualità dei campioni di carne bovina, sia acquistati al dettaglio presso la grande distribuzione che acquisiti direttamente dalle aziende produttrici, sulla base delle informazioni riportate in etichetta circa l’età e l’origine degli animali. Ciò può trovare spiegazione nella molteplicità di fattori intrinseci (specie, razza o tipo genetico, genere, età e peso degli animali alla macellazione) ed estrinseci (fasi pre- e post-macellazione) in grado di svolgere un ruolo rilevante nel determinare la qualità della carne. Pertanto, future ricerche dovranno essere intraprese per individuare quali parametri possano essere considerati più idonei a valorizzare la qualità tecnologica e sensoriale delle carni bovine.

Studio e sviluppo di un metodo per il monitoraggio della posizione dell'esofago durante l'ablazione transcatetere

Lo scopo del presente lavoro di tesi è l’implementazione di un metodo per la detezione automatica dei contorni dell’esofago in immagini ecografiche intracardiache acquisite durante procedure di ablazione transcatetere per il trattamento della fibrillazione atriale. Il progetto si è svolto in collaborazione con il laboratorio di elettrofisiologia, Unità Operativa di Cardiologia, Dipartimento Cardiovascolare, dell’ospedale ‘’ S. Maria delle Croci ’’ di Ravenna, Azienda Unità Sanitaria Locale della Romagna e si inserisce in un progetto di ricerca più ampio in cui sono stati sviluppati due differenti metodi per il tracciamento automatico della parete posteriore dell’atrio sinistro. L’obiettivo è consentire al clinico il monitoraggio della posizione dell’esofago rispetto all’atrio sinistro per ridurre il rischio di lesioni della parete esofagea. L’idea di base dell’algoritmo è di lavorare sull’immagine per linee di scansione orizzontali, valutando la distribuzione dei livelli di intensità di grigio. Una volta individuati i punti appartenenti alle pareti anteriore e posteriore dell’esofago, sono stati utilizzati dei polinomi rispettivamente del quarto e secondo ordine per interpolare i dati. Per assicurarsi che la detezione sia corretta è stato introdotto un check aggiuntivo che consente la correzione del risultato qualora il clinico non sia soddisfatto, basandosi su input manuale di due punti richiesto all’operatore. L’algoritmo è stato testato su 15 immagini, una per ogni paziente, e i contorni ottenuti sono stati confrontati con i tracciamenti manuali effettuati da un cardiologo per valutare la bontà del metodo. Le metriche di performance e l’analisi statistica attestano l’accuratezza del metodo. Infine sono state calcolate delle misure di interesse clinico, quali la distanza tra parete posteriore dell’atrio sinistro e parete anteriore dell’esofago e la larghezza media di quest’ultimo che risulta comparabile con quanto riportato in letteratura.

Analisi dei comportamenti degli utenti per lo sviluppo di un sistema di App Recommendation

Negli ultimi cinque anni lo sviluppo di applicazioni mobile ha visto un grandissimo incremento dovuto pricipalmente all’esplosione della diffusione di smartphone; questo fenomeno ha reso disponibile agli analisti una enorme quantità di dati sulle abitudini degli utenti. L’approccio centralizzato nella distribuzione delle applicazioni da parte dei grandi provider quali Apple, Google e Microsoft ha permesso a migliaia di sviluppatori di tutto il mondo di raggiungere con i loro prodotti gli utenti finali e diffondere l’utilizzo di applicativi installabili; le app infatti sono diventate in poco tempo fondamentali nella vita di tutti i giorni e in alcuni casi hanno sostituito funzioni primarie del telefono cellulare. Obiettivo principale di questo studio sarà inferire pattern comportamentali dall’analisi di una grossa mole di dati riguardanti l’utilizzo dello smartphone e delle app installabili da parte di un gruppo di utenti. Ipotizzando di avere a disposizione tutte le azioni che un determinato bacino di utenza effettua nella selezione delle applicazioni di loro interesse quando accedono al marketplace (luogo digitale da cui è possibile scaricare nuove applicazioni ed installarle) è possibile stimare, ovviamente con un certo margine di errore, dati sensibili dell’utente quali: Sesso, Età, Interessi e così via analizzandoli in relazione ad un modello costruito su dati di un campione di utenti ben noto. Costruiremo così un modello utilizzando dati di utenti ben noti di cui conosciamo i dettagli sensibili e poi, tramite avanzate tecniche di regressione e classificazione saremo in grado di definire se esiste o meno una correlazione tra le azioni effettuate su uno Smartphone e il profilo dell’utente. La seconda parte della tesi sarà incentrata sull'analisi di sistemi di raccomandazioni attualmente operativi e ci concentreremo sullo studio di possibili sviluppi sviluppi futuri di questi sistemi partendo dai risultati sperimentali ottenuti.

Localization and mobility-edges in non-interacting fermionic models with disorder

Nel corso degli ultimi decenni la fisica sperimentale ha raggiunto notevoli traguardi nel campo della manipolazione di sistemi di atomi freddi, riaccendendo l'interesse della ricerca su sistemi a lungo studiati teoricamente, ma fino a poco tempo fa impossibili da realizzare sperimentalmente. Questa riaccesa attenzione ha permesso di sfruttare le moderne capacità di calcolo per studiare sistemi quantistici che ancora risultano di difficile realizzazione. In questo contesto si inserisce il rinnovato interesse per i sistemi quantistici monodimensionali caratterizzati dalla presenza di potenziale disordinato. Questi presentano proprietà di trasporto particolari e sotto particolari condizioni sono oggetto di una transizione di localizzazione. La maggior parte degli studi in questo campo rivolgono la loro attenzione a sistemi di particelle fermioniche interagenti. In questo lavoro di tesi analizziamo, invece, sistemi quantistici fermionici non interagenti, mettendo in luce quanto già noto e proponendo strumenti di analisi derivati dallo studio dei sistemi interagenti. In particolare, proponiamo un'analisi statistica dei livelli energetici e poniamo le basi per futuri studi a riguardo.

Morphological characterization of ZnS thin films for photovoltaic applications

Le celle solari a film sottile sono tra le alternative più promettenti nel campo fotovoltaico. La ricerca di materiali non tossici ed economici per la passivazione delle superfici è di fondamentale importanza. Il presente è uno studio sulla morfologia di film sottili di ZnS. I campioni analizzati sono stati cresciuti tramite DC sputtering a diversa potenza (range 50-150W) per studiare le connessioni tra condizioni di deposizione e proprietà strutturali. Lo studio è stato condotto mediante acquisizione di mappe AFM. E' stata effettuata un'analisi dei buchi (dips) in funzione della potenza di sputtering, per individuare il campione con la minore densità di dips in vista di applicazioni in celle solari a film sottile. I parametri strutturali, quali la rugosità superficiale e la lunghezza di correlazione laterale sono stati determinati con un'analisi statistica delle immagini. La densità e dimensione media dei grani sono state ricavate da una segmentazione delle immagini. Le analisi sono state svolte su due campioni di ZnO per fini comparativi. Tramite EFM sono state ottenute mappe di potenziale di contatto. Tramite KPFM si è valutata la differenza di potenziale tra ZnS e un layer di Al depositato sulla superficie. La sheet resistance è stata misurata con metodo a quattro punte. Dai risultati la potenza di sputtering influenza la struttura superficiale, ma in maniera non lineare. E' stato individuato il campione con la minore rugosità e densità di dips alla potenza di 75 W. Si è concluso che potenze troppo grandi o piccole in fase di deposizione promuovono il fenomeno di clustering dei grani e di aumentano la rugosità e densità di dips. E' emersa una corrispondenza diretta tra morfologia e potenziale di contatto alla superficie. La differenza di potenziale tra Al e ZnS è risultata inferiore al valore noto, ciò può essere dovuto a stati superficiali indotti da ossidi. Il campione risulta totalmente isolante.

Censimento degli israeliti esistenti nel regno alla fine dell'anno 1881

Ministerio di agricoltura industria e commercio. Direzione generale della statistica

Grapholita molesta en condiciones de laboratorio : evaluación de la relación de sexos

Grapholita molesta (Lepidoptera: Olethreutidae) es plaga principal del duraznero en Mendoza. El desarrollo de crías artificiales permite interpretar el comportamiento de dicha plaga y consecuentemente, aplicar estrategias para su control. El objetivo del trabajo fue evaluar distintas relaciones de sexos de la especie mediante la fecundidad, viabilidad y longevidad La cría se desarrolló en una cámara con temperatura, humedad relativa y fotoperíodo controlados. El diseño experimental fue en bloques al azar para eliminar la influencia de la luz dentro de la cámara y el desarrollo generacional. Se realizaron cuatro repeticiones. Los resultados se analizaron mediante el programa Statistica. El análisis de los resultados entre bloque y tratamiento no tuvo diferencias significativas en la incidencia de la luz y en el desarrollo generacional. La fecundidad tuvo diferencias significativas entre los tratamientos. Por el contrario, la viabilidad y la longevidad de ambos sexos no tuvieron diferencias significativas, pero los valores de la primera fueron en todos los tratamientos más altos que el máximo citado por otros autores. La relación de sexos influyó positivamente sobre la fecundidad cuando la proporción de los machos fue mayor o igual que el sexo contrario.

Densidad de adultos de Grapholita Molesta en jaulas : Mendoza (Argentina)

Grapholita molesta es una importante plaga que afecta brotes y frutos del duraznero en Mendoza, Argentina. Algunos autores han citado que Carpocapsa pomonella requiere, en condiciones artificiales, una densidad poblacional de 100 adultos para alcanzar una alta fecundidad y que esta situación se puede extender a la especie en estudio. El objetivo del trabajo fue evaluar distintas densidades poblacionales de la especie mediante la fecundidad, viabilidad y longevidad. La especie se crió en una cámara con condiciones abióticas controladas. El diseño fue en bloques al azar para eliminar la influencia de la luz y el desarrollo generacional. Se realizaron cuatro repeticiones. Los resultados se procesaron mediante el programa Statistica. El análisis de los resultados entre bloques y tratamientos no tuvo diferencias significativas por lo que no hubo variación en la incidencia de la luz y el desarrollo generacional. La viabilidad tuvo diferencias significativas entre los tratamientos mientras que la fecundidad y la longevidad no las presentaron. La densidad poblacional influyó positivamente sobre la viabilidad cuando la cantidad de parejas fue la menor y disminuyó al incrementarse la proporción de las mismas. Es decir, el hacinamiento de los individuos afectó la viabilidad de Grapholita molesta pero no la fecundidad ni la longevidad.

Natural production of Tuber aestivum in central Spain: Pinus spp. versus Quercus spp. brûles

Aim of study: Tuber aestivum is the most widespread edible truffle, with increasing commercial interest. This species can produce carpophores with conifer hosts, in contrast with the inability of Pinus spp. to induce fruiting in other truffle species such as Tuber melanosporum. Therefore the objective is to compare the characteristics and carpophore production of T. aestivum brûlés associated with Pinus spp. versus Quercus spp. Area of study: We studied the natural habitats of T. aestivum in the Alto Tajo Nature Reserve in central Spain. Material and methods: During 5 years, we monitored the production of carpophores and brûlé size of 145 T. aestivum brûlés associated with Pinus nigra subsp. salzmanni and P. sylvestris and Quercus ilex subsp. ballota and Q. faginea hosts. Statistical treatment was performed using the Statistica Program v. 6. Main results: The size of brûlés associated with Pinus was significantly smaller than that of brûlés associated with Quercus. However, carpophore production per brûlé, and especially for brûlés of similar size, was greater when the host plant was a pine. After accounting for brûlé size, the production of brûlés associated with Pinus spp. was 2.23 (95% CI, between 1.35 and 3.69) and 1.61 (95% CI, between 1.02 and 2.54) times greater than the production of brûlés associated with Quercus faginea and Q. ilex subsp. ballota, respectively. Research highlights: The considerable ability of Pinus nigra subsp. salzmanni and P. sylvestris to form effective brûlés and to produce carpophores of Tuber aestivum in natural conditions was clearly demonstrated, and suggest that those species can be of use in the culture of T. aestivum.

Human Trafficking for sexual exploitation in Europe. Towards a true “EU approach”?

La presente tesi analizza il reato di traffico di esseri umani in Europa, con particolare attenzione al fenomeno dello sfruttamento sessuale. La ricerca è stata condotta in parte nell’ambito del progetto “FIDUCIA. New European crimes and trust-based policy” (www.fiduciaproject.eu). La tesi è composta da 5 capitoli. Il primo capitolo introduce il reato di tratta di esseri umani, a livello globale e, successivamente, nello specifico, in Europa. Vengono presentati i fattori determinanti e le origini del fenomeno. Inoltre, ne vengono fornite le definizioni e le principali caratteristiche, in linea con i più importanti documenti internazionali sul tema. Il capitolo si chiude con una panoramica statistica, che affronta anche le criticità della raccolta di dati relativi ai reati. Il secondo capitolo analizza l’approccio correntemente adottato a livello domestico ed europeo contro la tratta. Le misure vengono presentate prima dal punto di vista teorico; successivamente ne vengono forniti esempi concreti, ad esempio convenzioni internazionali, direttive, ma anche progetti di ricerca, collaborazioni internazionali tra autorità ed ONG. Il terzo capitolo si concentra sulla tratta a fini di sfruttamento sessuale. Vengono analizzati il potenziale legame con la prostituzione, e l’approccio europeo. Segue un approfondimento dei modelli legali implementati a livello europeo ed uno studio comparato di cinque paesi membri, rappresentativi dei vari modelli di regolamentazione della prostituzione (Italia, Belgio, Polonia, Germania e Svezia). Il quarto capitolo raccoglie le interviste condotte con diversi esperti che si occupano di contrasto alla tratta: ONG italiane e straniere, referenti nazionali anti-tratta di Italia, Belgio e Germania, FRONTEX, membri del Parlamento Europeo. Nelle conclusioni, vengono proposte prima una valutazione complessiva del quadro attuale, e poi alcune raccomandazioni ai governi nazionali e agli organismi sopranazionali. In particolare, visto l’obiettivo di un contrasto omogeneo e coordinato della tratta (per sfruttamento sessuale specificamente) a livello europeo, si ritiene che un modello regolamentare uniforme della prostituzione negli stati membri possa contribuire a migliorare uniformità ad efficacia dell’approccio europeo alla tratta.

Mortalità e incidenza di tumore in una coorte di lavoratori esposti ad asbesto nel settore della navalmeccanica. Confronti esterni, interni e caso-controllo nested

Obiettivi. Lo scopo di questo studio è di confrontare la mortalità e l’incidenza per tutte le cause, tutti i tumori, tumori specifici e per le cause non neoplastiche, in una coorte dei lavoratori impiegati nel cantiere navale di Monfalcone (GO) tra il 1974 e il 1994, con quella della popolazione generale della regione FVG e d’Italia. L’obiettivo è eseguire tali confronti considerando il livello di esposizione ad amianto, la durata di esposizione (in anni) precedente al 1985, il periodo di prima assunzione, quali principali indicatori di esposizione occupazionale ad asbesto. Obiettivo secondario è quello di contribuire alla conoscenza circa la correlazione tra esposizione ad asbesto e l’incidenza di tumori nelle principali sedi digestive. Metodi. Tramite metodo indiretto sono stati calcolati SIR (periodo 1995-2009) e SMR (periodo 1995-2012) per tumore maligno della pleura, tumore di trachea bronchi e polmone, per tutti i tumori e per malattie non neoplastiche. È stato condotto uno studio caso- controllo nested per la stima degli gli ORs rispettivamente per tumore maligno della pleura e del polmone. Sono stati applicati modelli di Poisson per la stima degli IRRs riguardanti le principali sedi digestive, utilizzando quali variabili esplicative: a) il rischio di esposizione ad asbesto legato alla mansione e b) il numero di anni di esposizione precedenti al 1985. Risultati. Nell’intera coorte (5582 uomini) gli SMR indicavano un eccesso di mortalità per tumore maligno della pleura incrementato rispettivamente di circa 7 volte (SMR= 7,03; IC95% 5,61-8,79) e di poco più di 14 volte (SMR= 14,20; IC95% 11,33-17,75) rispettivamente quando il confronto è stato fatto con la popolazione standard del FVG e dell’Italia. L’aumento della mortalità per tumore maligno della pleura risulta fortemente aumentato in tutte le stratificazioni. Gli SMR per il tumore di trachea, bronchi e polmone sono risultati essere prossimi all'unità quando le analisi sono state eseguite nell’intera coorte, mentre risultano aumentati in modo significativo rispetto alla popolazione generale quando calcolati nei soggetti a rischio medio e assunti presso i cantieri navali di Monfalcone prima del 1974 (SMR= 1,38 95%CI 1,00-1,85) e nei soggetti classificati a rischio medio e assunti nel periodo 1985-1994 (SMR= 4,88 95%CI 1,00-14,25). Analogamente, nell’intera coorte, i SIR per tumore maligno della pleura calcolati nell’intera coorte erano aumentati di oltre 7 volte (SIR= 7,65; IC95% 6,19-9,49), mentre l’incidenza del tumore di trachea bronchi e polmone non vede incrementi rispetto alla popolazione di riferimento. Coloro che hanno avuto una durata di esposizione maggiore di 30 anni prima del 1985 dimostrano un aumento dell’incidenza di tumore di trachea, bronchi e polmone (SIR=1,34 IC95% 1,00-1,77), statisticamente significativo, così come per coloro che son stati classificati a rischio medio di esposizione e assunti precedentemente al 1974 (SIR=1,46 IC95% 1,06-1,95) e per coloro che sono stati classificati ad alto rischio e assunti nel periodo 1985-1994 (SIR=5,68 IC95% 1,17-16,60). Nell’intera coorte si registra un significativo aumento di incidenza di tumore dello stomaco in coloro classificati a alto rischio (SIR= 1,47 IC95% 1,05-2,00), mentre l’incidenza di tumore del pancreas vede un incremento dell’incidenza in coloro classificati a medio rischio di esposizione ad asbesto (SIR= 2,21 IC95% 1,21-3,72). Il sottogruppo le cui informazioni risultavano mancanti mostrano un incremento del SIR, borderline ma non significativo, per tumore del colon-retto (SIR= 1,29 IC95% 0,94-1,73). Emerge un significativo aumento dell’incidenza del tumore dello stomaco in coloro con un periodo di esposizione precedente al 1985 compreso tra 10 e 20 anni (SIR= 1,71 IC95% 1,12-2,49). Anche i SIR per il tumore del pancreas vedono un incremento statisticamente significativo in coloro che hanno una durata di esposizione precedente al 1985 inferiore a 10 anni e maggiore di 30: rispettivamente i SIR sono stati di 2,23 (IC95% 1,07-4,10) e 2,57 (IC95% 1,53-4,07). I risultati relativi ai confronti interni non mostrano significatività statistica. Conclusioni. I risultati indicano che nella coorte degli uomini ex- lavoratori dei cantieri navali di Monfalcone vi era un incremento forte e statisticamente significativo della mortalità e dell’incidenza di tumore maligno della pleura rispetto sia alla popolazione generale del FVG sia a quella dell’Italia. Eccessi di mortalità ed incidenza sono stati rilevati talvolta anche per il tumore di trachea, bronchi e polmone, quando le analisi sono state condotte stratificando la coorte in gruppi omogenei di rischio. Il più elevato eccesso rispetto all’atteso sia della mortalità per tumore maligno della pleura e del tumore del polmone, che dell’incidenza, si osservava nei lavoratori con mansioni a rischio medio, seguito dal gruppo con mansioni a rischio elevato. I Risultati riguardanti l’incidenza dei tumori delle principali sedi digestive ha visto nell’intera coorte un aumento significativo dei SIR per tumore dello stomaco e del pancreas, anche quando condotti per sottogruppi. Tuttavia le stime relative agli outcome diversi dal tumore maligno della pleura e del tumore del polmone devono essere interpretate con cautela. Le associazioni positive riscontrate tramite confronti interni non presentano significatività statistica.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Validation of a new easy score to predict outcome in early stage renal cell carcinoma

Background e scopi dello studio. Il carcinoma renale rappresenta circa il 3% delle neoplasie e la sua incidenza è in aumento nel mondo. Il principale approccio terapeutico alla malattia in stadio precoce è rappresentato dalla chirurgia (nefrectomia parziale o radicale), sebbene circa il 30-40% dei pazienti vada incontro a recidiva di malattia dopo tale trattamento. La probabilità di recidivare può essere stimata per mezzo di alcuni noti modelli prognostici sviluppati integrando sia parametri clinici che anatomo-patologici. Il limite principale all’impiego nella pratica clinica di questi modelli è legata alla loro complessità di calcolo che li rende di difficile fruizione. Inoltre la stratificazione prognostica dei pazienti in questo ambito ha un ruolo rilevante nella pianificazione ed interpretazione dei risultati degli studi di terapia adiuvante dopo il trattamento chirurgico del carcinoma renale in stadio iniziale. Da un' analisi non pre-pianificata condotta nell’ambito di uno studio prospettico e randomizzato multicentrico italiano di recente pubblicazione, è stato sviluppato un nuovo modello predittivo e prognostico (“score”) che utilizza quattro semplici parametri: l’età del paziente, il grading istologico, lo stadio patologico del tumore (pT) e della componente linfonodale (pN). Lo scopo del presente studio era quello di validare esternamente tale score. Pazienti e Metodi. La validazione è stata condotta su due coorti retrospettive italiane (141 e 246 pazienti) e su una prospettica americana (1943 pazienti). Lo score testato prevedeva il confronto tra due gruppi di pazienti, uno a prognosi favorevole (pazienti con almeno due parametri positivi tra i seguenti: età < 60 anni, pT1-T3a, pN0, grading 1-2) e uno a prognosi sfavorevole (pazienti con meno di due fattori positivi). La statistica descrittiva è stata utilizzata per mostrare la distribuzione dei diversi parametri. Le analisi di sopravvivenza [recurrence free survival (RFS) e overall survival (OS)] sono state eseguite il metodo di Kaplan-Meier e le comparazioni tra i vari gruppi di pazienti sono state condotte utilizzando il Mantel-Haenszel log-rank test e il modello di regressione di Cox. Il metodo di Greenwood è stato utilizzato per stimare la varianza e la costruzione degli intervalli di confidenza al 95% (95% CI), la “C-statistic” è stata utilizzata per descrivere l’ accuratezza dello score. Risultati. I risultati della validazione dello score condotta sulle due casistiche retrospettive italiane, seppur non mostrando una differenza statisticamente significativa tra i due gruppi di pazienti (gruppo favorevole versus sfavorevole), sono stati ritenuti incoraggianti e meritevoli di ulteriore validazione sulla casistica prospettica americana. Lo score ha dimostrato di performare bene sia nel determinare la prognosi in termini di RFS [hazard ratio (HR) 1.85, 95% CI 1.57-2.17, p < 0.001] che di OS [HR 2.58, 95% CI 1.98-3.35, p < 0.001]. Inoltre in questa casistica lo score ha realizzato risultati sovrapponibili a quelli dello University of California Los Angeles Integrated Staging System. Conclusioni. Questo nuovo e semplice score ha dimostrato la sua validità in altre casistiche, sia retrospettive che prospettiche, in termini di impatto prognostico su RFS e OS. Ulteriori validazioni su casistiche internazionali sono in corso per confermare i risultati qui presentati e per testare l’eventuale ruolo predittivo di questo nuovo score.

Linfoma renale del gatto:rilievi anatomopatologici, immunofenotipizzazione delle popolazioni linfocitarie ed espressione tissutale dell'antigene virale FeLV gp70.

Riassunto Il linfoma è una delle neoplasie più diffuse nel gatto. Questa neoplasia è stata classificata in base alla localizzazione anatomica nella forma Mediastinica (che interessa il timo e/o i linfonodi mediastinici), Alimentare, Multicentrica (che interessa diversi linfonodi e/o la milza e/o il fegato, Extranodale (che coinvolge i reni, SNC o la cute). Le cellule neoplastiche sono caratterizzate da diverse sottopopolazioni, che sono definite tramite immunofenotipizzazione ottenuta mediante tecniche immunoistochimiche (IHC), così che possano essere classificate come cellule B o T o non B/non T. I gatti infetti dal virus della leucemia felina (FeLV, Gammaretrovirus) presentano elevata incidenza di linfomi rispetto ai gatti non infetti. I meccanismi proposti di sviluppo neoplastico sono mutagenesi inserzionali o stimolazione persistente delle cellule immunitarie dell’ospite da parte di antigeni virali, i quali possono promuovere la trasformazione in senso maligno dei linfociti. Lo scopo di questo lavoro è stato esaminare i rilievi patologici, l’espressione di FeLV e l’immonofenotipo (B, T, nonB/nonT) nei reni felini affetti da linfoma. Abbiamo effettuato colorazione Ematossilina- Eosina ed Immunoistochimica per FeLV gp70, CD3 e CD79. Nello studio sono stati inclusi i tessuti di 49 gatti presentati all’Unità Operativa di Anatomia Patologica e Patologia Generale del Dipartimento di Scienze Medico Veterinarie dell’Università degli studi di Parma. Il 39% dei casi (19/49) sono caratterizzati dalla presenza di lesioni linfomatose a livello renale. Questa popolazione è costituita dal 52,6% 3 (10/19) maschi e dal 47,4% (9/19) femmine. L’età è compresa tra 8 mesi e 17 anni ed in particolare 26,6% (5/19) sono giovani (0-2 anni), 47,4% (9/19) sono adulti (2-10 anni) e 26,3% (5/19) sono anziani (>10 anni). Per quanto riguarda la classificazione anatomica la forma renale appare primitiva in 5 casi (25%), in 8 casi (42%) appare secondaria a linfomi multicentrici, in 3 casi (15,7%) a linfomi mediastinici e in altri 3 casi (15,7%) a linfomi gastrici e intestinali. Per quanto riguarda l’immunofenotipizzazione sono risultati CD3 positivi il 73,7% (14/19) e CD3 negativi il 27,3% (5/19); CD79 alpha positivi il 26,3% (5/19) e CD79 alpha negativi il 73,7% (14/19); l’espressione della proteina gp70 è stata individuata nel 78,9% (15/19) delle neoplasie renali, mentre il 21,1% (4/19) non presentava espressione della proteina. Nei 4 anni presi in considerazione nello studio si evince un’elevata incidenza della localizzazione anatomica renale sul totale di linfomi osservati. Non si è notata correlazione statistica tra linfomi renali, età e sesso dei soggetti presi in esame ma vi è un’elevata percentuale di animali adulti ed anziani affetti dalla patologia. Nella valutazione fenotipica dell’infiltrato neoplastico si è osservata l’elevata espressione di CD3, caratterizzando i linfociti come appartenenti alla sottopopolazione T. Inoltre si è evidenziato come un elevato numero di cellule neoplastiche esprimano gp70; ciò permette di affermare che i linfociti neoplastici sono infettati dal virus FeLV, il quale inoltre è in attiva replicazione. I marker CD3 e gp70 sono risultati fortemente correlati statisticamente; si può affermare perciò che l’espansione clonale dei linfociti T è correlata alla presenza e replicazione del virus.