Inferring Population Genetic Structure in Widely and Continuously Distributed Carnivores: The Stone Marten (Martes foina) as a Case Study

The stone marten is a widely distributed mustelid in the Palaearctic region that exhibits variable habitat preferences in different parts of its range. The species is a Holocene immigrant from southwest Asia which, according to fossil remains, followed the expansion of the Neolithic farming cultures into Europe and possibly colonized the Iberian Peninsula during the Early Neolithic (ca. 7,000 years BP). However, the population genetic structure and historical biogeography of this generalist carnivore remains essentially unknown. In this study we have combined mitochondrial DNA (mtDNA) sequencing (621 bp) and microsatellite genotyping (23 polymorphic markers) to infer the population genetic structure of the stone marten within the Iberian Peninsula. The mtDNA data revealed low haplotype and nucleotide diversities and a lack of phylogeographic structure, most likely due to a recent colonization of the Iberian Peninsula by a few mtDNA lineages during the Early Neolithic. The microsatellite data set was analysed with a) spatial and non-spatial Bayesian individual-based clustering (IBC) approaches (STRUCTURE, TESS, BAPS and GENELAND), and b) multivariate methods [discriminant analysis of principal components (DAPC) and spatial principal component analysis (sPCA)]. Additionally, because isolation by distance (IBD) is a common spatial genetic pattern in mobile and continuously distributed species and it may represent a challenge to the performance of the above methods, the microsatellite data set was tested for its presence. Overall, the genetic structure of the stone marten in the Iberian Peninsula was characterized by a NE-SW spatial pattern of IBD, and this may explain the observed disagreement between clustering solutions obtained by the different IBC methods. However, there was significant indication for contemporary genetic structuring, albeit weak, into at least three different subpopulations. The detected subdivision could be attributed to the influence of the rivers Ebro, Tagus and Guadiana, suggesting that main watercourses in the Iberian Peninsula may act as semi-permeable barriers to gene flow in stone martens. To our knowledge, this is the first phylogeographic and population genetic study of the species at a broad regional scale. We also wanted to make the case for the importance and benefits of using and comparing multiple different clustering and multivariate methods in spatial genetic analyses of mobile and continuously distributed species.

Pan-biogeografia dos ungulados viventes (Mammalia: Cetartiodactyla e Perissodactyla) da região Neotropical, da Zona de Transição Sul-americana e região Andina: aspectos históricos e conservacionistas

Os ungulados viventes (Cetartiodactyla e Perissodactyla), nas regiões estudadas, são representados por 11 gêneros e 24 espécies. O presente estudo propõe reconhecer os padrões de distribuição destas espécies, a partir da aplicação do método pan-biogeográfico de análise de traços. Este método auxilia no entendimento a priori dos padrões congruentes de distribuição e numa compreensão de padrões e processos de diferenciação geográfica no tempo e no espaço, reconstruindo a biogeografia de táxons. Em relação a aspectos conservacionistas, o método foi aplicado na identificação de áreas prioritárias para conservação. A aplicação do método consiste basicamente na marcação das localidades de ocorrência dos diferentes táxons em mapas, sendo estas localidades conectadas por intermédio de linhas seguindo um critério de mínima distância, resultando nos chamados traços individuais que foram plotados nos mapas de biomas da América Central e do Sul do programa ArcView GIS 3.2. A superposição destes traços individuais define um traço generalizado, sugerindo uma história comum, ou seja, a preexistência de uma biota ancestral subsequentemente fragmentada por eventos vicariantes. A interseção de dois ou mais traços generalizados corresponde a um nó biogeográfico, que representa áreas compostas e complexas, nas quais se agrupam distintas histórias biogeográficas. Para a análise pan-biogeográfica foi utilizado o software ArcView GIS 3.2 e a extensão Trazos 2004. A partir da superposição dos 24 traços individuais, foram reconhecidos cinco traços generalizados (TGs): TG1, Mesoamericano/Chocó, composto por Mazama pandora, M. temama e Tapirus bairdii; TG2, Andes do Norte (Mazama rufina, Pudu mephistophiles e Tapirus pinchaque); TG 3, Andes Centrais (Hippocamelus antisensis, Lama guanicoe, Mazama chunyi e Vicugna vicugna) ; TG4, Patagônia chilena (Hippocamelus bisulcus e Pudu puda).; TG5, Chaco/Centro oeste do Brasil (Blastocerus dichotomus, Catagonus wagneri e Ozotocerus bezoarticus); e um nó biogeográfico em Antioquia no noroeste da Colômbia. As espécies Mazama americana, M.bricenii, M.goazoubira, M.nana, Tapirus terrestris, Tayassu pecari e T. tajacu não participaram de nenhum dos traços generalizados. Os padrões de distribuição formados a partir dos traços generalizados indicam que os ungulados viventes sofreram uma fragmentação e diferenciação no Pleistoceno, relacionadas a eventos históricos ocorridos na região Neotropical, na Zona de Transição Sul-americana e na região Andina, explicados pelos movimentos ocorridos nas Zonas de Falhas Tectônicas da América Central e do Sul, por vulcanismo e pelas mudanças climáticas. A formação do platô Altiplano-Puna revelou ser uma barreira geográfica, tanto em tempos pretéritos como em tempos atuais, para a maioria da biota sul-americana, com exceção dos camelídeos, que habitam estas áreas da Argentina, do oeste da Bolívia e sudoeste do Peru. O nó biogeográfico confirmou a presença de componentes bióticos de diferentes origens, constituindo uma área com grande diversidade biológica e endêmica, sugerindo assim uma unidade de conservação no noroeste da América do Sul.

Pan-biogeografia dos gêneros Didelphis, Philander, Metachirus, Chironectes e Lutreolina (Didelphimorphia: Didelphidae)

A ordem Didelphimorphia, de marsupiais americanos, apresenta 19 gêneros e 96 espécies, todos membros da família Didelphidae, que é dividida em duas subfamílias, Caluromyinae e Didelphinae. A subfamília Didelphinae contém (não apenas) as tribos Didelphini e Metachirini. A tribo Didelphini compreende 15 espécies de quatro gêneros: Chironectes (1 espécie), Lutreolina (1), Didelphis (6) e Philander (7) e a tribo Metachirini é monotípica, com apenas uma espécie do gênero Metachirus. Estes cinco gêneros encontram-se distribuídos amplamente pelas Américas, desde o sul do Canadá até a região central da Argentina. O objetivo deste estudo foi buscar identificar e explicar, através de análise pan-biogeográfica, os padrões de distribuição das espécies destes cinco gêneros. Para tal, foi feito um levantamento em banco de dados, coleções científicas e artigos científicos para a obtenção de dados sobre as localidades de registro de cada espécie. Estas foram então marcadas em mapas e a partir destes, as localidades de ocorrência foram conectadas com linhas de menor distância para formação dos traços individuais. Pela sobreposição dos traços individuais chegou-se aos traços generalizados e do encontro destes, aos nós biogeográficos. Os pontos de ocorrência foram também plotados em mapas de biomas para análise. Encontramos três traços generalizados e dois nós biogeográficos, um no centro da Bolívia na província biogeográfica de Puna e outro na Argentina, na província de Misiones. Quatro espécies não participaram de nenhum dos traços generalizados, provavelmente devido à sua distribuição mais restrita (Philander deltae, P. andersoni, P. olrogi e P. mcilhennyi). Chironectes minimus e Metachirus nudicaudatus tiveram seus traços coincidentes com dois traços generalizados, o que está de acordo com suas divisões de subespécies. Identificamos os diferentes padrões existentes para o norte da América do Sul (Venezuela) já apontado por diversos autores, porém apenas quando analisadas as subespécies em separado. Alguns limites para a distribuição das espécies puderam ser identificados, como por exemplo o istmo de Tehuantepec, no México, para Chironectes minimus e Metachirus nudicaudatus e o limite da região neotropical para P. opossum e D. marsupialis. O limite de distribuição sul de Philander opossum e P. frenatus é provavelmente o rio Paraguai, que deve servir de barreira para o contato entre as duas espécies. A descaracterização dos ambientes naturais pelo desmatamento vem alterando os padrões naturais de distribuição das espécies, com o registro de espécies de áreas abertas em biomas de mata. Lutreolina crassicaudata apresenta distribuição disjunta, ocupando duas áreas de vegetação aberta, uma no noroeste e outra no centro e sudeste da América do Sul, padrão provavelmente gerado pelos períodos de retração e expansão de áreas de savana do Mioceno superior ao Holoceno, levando à captura destes enclaves de vegetação aberta, com seu isolamento por áreas de floresta. Os nós e traços generalizados aqui identificados coincidiram com os encontrados por outros autores. Apesar da pan-biogeografia poder ser usada para propor áreas de proteção ambiental, nos locais em que encontramos os nós biogeográficos já existem unidades de conservação, não havendo assim necessidade de propor novas áreas no caso desses marsupiais. Ainda existe uma grande necessidade de um melhor conhecimento da distribuição e taxonomia das espécies estudadas, o que promoveria um melhor entendimento dos padrões biogeográficos existentes

Biodiversity of estuarine fish faunas in West Africa

In West Africa (between Ivory Coast and Sénégal), estuarine environments vary from lagoons to high discharge rivers to inverse hypersaline estuaries. This results in a high diversity of estuarine fish species, with an important turnover and a core of ubiquitous species. The species richness of a given estuary depends on the combination of hydrological factors (marine or freshwater dominance) and biogeography (continental biogeographic regions). The catch rate is higher in lagoons and inverse estuaries than in normal estuaries, which can be explained by the predominance of small juveniles in the latter. Clupeids are the most abundant fishes all over the region, but different systems have different dominant species. Assessing the functioning of West-African estuaries provides useful comparisons to Asian estuarine systems.

Revisão do Ramo Gondwânico da família Mawsoniidae (Sarcopterygii: Actinistia: Coelacanthiformes)

Representados aualmente por apenas duas espécies: Latimeria chalumnae e L. menadoensis, os celacantos (Infraordem Actinistia) já foi muito mais numeroso, prolífico desde os tempos de seu surgimento no Devoniano Inferior. Dentro de Actinistia a família Mawsoniidae se destaca por abranger as maiores espécies do grupo, algumas atingindo até três metros de comprimento. A entrada de Mawsoniidae no continente Gondwana se deu durante o Jurássico superior, período o qual é atribuído a espécie Parnaibaia maranhoensis da bacia do Parnaíba (Maranhão). No cretáceo a família se ramificou em dois outros gêneros Mawsonia (com conhecidas ocorrências brasileiras e africanas) e Axelrodichthys (gênero brasileiro com alguns indícios de presença na África). Este trabalho teve por objetivo realizar uma redescrição e comparação de seis espécies do ramo gondwânico da família Mawsoniidae: Parnaibaia maranhoensis, Axelrodichthys araripensis, Mawsonia gigas, M. minor, M. lavocati e M. brasiliensis. Os espécimes estão depositados em oito instituições: três nacionais e cinco internacionais. Após uma criteriosa descrição anatômica dos exemplares caracteres foram selecionados para a realização de uma análise filogenética restrita ao grupo. Os resultados das observações anatômicas revelaram diversas estruturas ainda não descritas na literatura, incluindo o primeiro elemento medial do esqueleto apendicular de Mawsoniidae a ser observado, além de diversas diferenças e afinidades entre as seis espécies. P. maranhoensis apresentou um conjunto de caracteres plesiomórfico que foram interpretados como sendo o resultado de um evento de neotenia, algo inédito na literatura de celacantos. Todas as espécies do gênero Mawsonia apresentaram características diagnósticas que validam sua separação em espécies distintas. A análise filogenética resultou em duas árvores igualmente parcimoniosas. Ambas concordam com a posição de Parnaibaia na base do grupo. Mas diferem com relação à posição de A. araripensis e as espécies do gênero Mawsonia. Conclui-se que Parnaibaia é o gênero mais plesiomórfico do grupo, estando na base do ramo gondwânico da família. Axelrodichthys representa a ligação deste com as demais espécies do gênero.

Termocronologia (U-Th)He e reativação da margem continental do sudeste do Brasil: seção Serra da Mantiqueira - Gráben da Guanabara

A evolução da margem continental do sudeste do Brasil tem sido discutida por diversos autores desde meados do século passado até os dias atuais, especialmente no contexto da origem e evolução dos escarpamentos e das bacias tafrogênicas. Buscou-se contribuir com novos dados sobre a evolução da área a partir da aplicação da termocronologia de baixa temperatura (U-Th)/He em apatita, que oferece uma sensibilidade significativa para registrar movimentações tectônicas na crosta superior. Foi possível obter idades em 107 cristais de apatita de 18 amostras do embasamento coletadas no perfil com orientação NW-SE, numa seção entre a Serra da Mantiqueira e o Gráben da Guanabara. As idades corrigidas variam entre 250,1 8,7 Ma e 43,5 1,9 Ma (2 σ) e as não corrigidas entre 174,13 3,03 Ma e 27,07 0,60 Ma (1 σ). O Neocretáceo, o Eocretáceo e o Paleoceno são os principais registros no conjunto de dados, em ordem de importância. No Neocretáceo, o intervalo entre 83,6 e 72,1 Ma (Campaniano) representa o maior destaque nos registros termocronológicos, embora os outros registros (Maastrichtiano e Santoniano) também estejam presentes e sejam importantes. As idades do Neocretáceo destacam a importância dos eventos tectonomagmáticos e soerguimento regional na história térmica dessa área, inclusive com idades (~86 Ma) atribuídas ao contexto de soerguimento da Serra do Mar. As idades do Eocretáceo indicam o registro de eventos térmicos mais antigos, vinculados à evolução pré-rifte. Já os dados do Paleoceno estariam associados ao evento de reativação responsável pela implantação do sistema de riftes continentais (~65 Ma) e as idades do Eoceno, restritas à borda de falha da bacia de Resende (49,7 Ma e 43,5 Ma), à reativação do sistema de riftes nessa área. A dispersão de idades foi interpretada como efeito dos danos de radiação já que muitos grãos apresentam correlação entre idade e concentração de urânio (eU). Os padrões de tempo-temperatura (t-T), definidos a partir dos modelos HeFTy calibrados para o modelo de difusão que considera os efeitos de danos de radiação nos cristais, registraram eventos de resfriamento rápido, os quais mostram correlação direta com episódios de reativação e soerguimento na margem continental e com registros nas bacias continentais e marginais. O padrão de aumento das idades com a elevação, assim como da costa em direção ao interior é observado, mas mostra-se alterado pela ocorrência de idades mais jovens associadas à complexa evolução dessa margem continental com desnivelamentos de blocos vinculados à tectônica pós-rift, numa situação que ressalta a influência dos episódios de reativação. As estimativas de denudação total variam entre 1,2 e 2,8 km. As taxas de erosão variam entre 15,2 e 35,3 m/Ma. A evolução da área indica não apenas a influência de um evento específico mas, possivelmente, uma combinação de episódios que se alternaram e/ou atuaram em conjunto em determinados períodos. Os eventos de reativação mais antigos, combinados com os mais recentes, exibem os seus remanescentes na paisagem (serras da Mantiqueira e do Mar e os grábens e bacias sedimentares) e assumem papel fundamental na evolução da área. Os registros de tais episódios podem ser observados nas histórias térmicas das rochas e nos depósitos correlativos nas bacias sedimentares marginais e intracontinentais.

落叶松属的分子进化与生物地理学

　　松科植物的核基因组十分庞大，基因常形成复杂的基因家族，核rDNA ITS 区在基因组内和基因组间存在广泛的长度和序列变异，但染色体数目和核型却高度保守，几乎均为二倍体(2n＝24)，与被子植物频繁的多倍化和高度均一的ITS区形成鲜明对比;叶绿体、线粒体和核基因组分别为父系、母系及双亲遗传，这种独特的遗传体系组合为系统发育重建研究提供了便利条件。因此，松科植物不仅是阐明基因树/物种树这一理论问题的理想试材，而且是基因和基因组进化及核rDNA致同进化机制研究的好材料。此外，松科植物的进化历史悠久，很多类群经历了多次重大的地质历史事件，并呈各种间断分布格局，其生物地理学问题受到广泛关注。本文对落叶松属所有物种(L. lyallii除外)和大部分变种的叶绿体基因组trnT-trnF区、低拷贝核4CL基因家族 (4-香豆酸辅酶A连接酶基因)及多拷贝核rDNA ITS区进行了序列分析，重建了该属的系统发育并揭示了其地理分布格局的形成过程，同时基于克隆和基因谱系分析，探讨了核4CL和rDNA ITS这两个基因家族的进化式样及规律。 　　1. 叶绿体trnT-trnF区和核rDNA ITS区的研究结果表明：落叶松属的种间遗传分化程度很低，北美的种类构成一个单系分支，并为欧亚种类的姐妹群。短苞鳞的欧亚落叶松组和长苞鳞的欧亚红杉组之间的分化较早，接近欧亚和北美种类间的分化时间。换句话说，苞鳞长短的分化在落叶松属中至少发生过两次，其中一次在落叶松属分化的初期，另一次在北美的种类中。结合化石、地史及气候资料，我们推测：落叶松属的共同祖先通过白令陆桥扩散，并形成欧亚和北美两支,然后在不同的板块上独立进化。落叶松组的泛北极分布是冰期后的回迁形成的，而红杉组的物种在第三纪全球气温降低时向南迁移，进而形成东亚－北美间断分布，特别是欧亚红杉组的祖先曾伴随青藏高原的隆升而发生辐射分化。 　　2. 在落叶松属4CL基因家族的研究中共获得44个差异的克隆，除华北落叶松外，其它种类均含2-4个成员。系统发育分析表明： 4CL基因频繁发生重复/丢失，并导致谱系拣选。该基因在落叶松属的共同祖先中发生一次重复，形成4clA和4clB，4clA再次发生基因重复形成4clA1和4clA2。重复产生的这两对并系基因拷贝在进化速率上呈显著差异，其中一个拷贝的进化速率明显加快，可能与进化制约的减弱或功能分化有关。结合其它核基因的研究结果，我们推测频繁的基因重复/丢失可能是形成和维持松科植物庞大核基因组的重要机制之一。 　　3. 对落叶松属101个nrDNA ITS克隆进行了序列及分子进化分析，发现极少数克隆存在较大的长度及（或）序列变异，并可能为假基因或重组体，其它克隆间的序列分化水平较低。因而，落叶松属核rDNA的致同进化速率比松科中两个古老的属（松属和云杉属）快。该致同进化速率的加快可能与落叶松属年轻的进化历史及染色体上较少的rDNA位点数目有关。由于一些特异克隆含嵌合序列及极高的序列变异，推测它们可能来源于物种进化过程中染色体重排形成的小位点(minor loci)或为孤独基因(orphons)。此外，我们发现nrDNA ITS克隆的分布式样与落叶松属的分化及地理分布格局的形成有密切关系：在欧亚红杉组中，克隆常按分类群（物种或变种）形成单系分支，表明这些类群的分化曾伴随着强烈的nrDNA ITS奠基者效应;相反，在欧亚落叶松组中，所有物种的克隆均混杂在一起，说明这些物种的分化时间较晚或在冰期后回迁的过程中曾发生频繁的种间基因交流。

分子系统学分析平台的建立和应用

分子系统学建立在实验和计算的基础之上。DNA快速测序技术的普及为分子系统学家提供了大量数据，而序列分析技术则是探索数据发现知识的重要工具。在基因组时代，随着大量模式生物完整基因组序列的获得，分子系统学正面临着前所未有的机遇和挑战。一方面，生命之树计划有助于确定新的模式生物和开展相应的基因组计划;另一方面，模式生物的基因组计划有助于阐明它们之间的进化关系和基因组的进化模式。更为重要的是，分子系统学序列分析技术已经发展成为探索与整合基因组数据的强有力工具，从而在生命科学中发挥重要作用。事实上，分子系统学和基因组学的相互渗透正在形成一门崭新的交叉学科——系统发育基因组学。 为了奠定分子系统学研究中信息管理和数据分析工作的坚实基础，我们建立了分子系统发育分析平台。该平台为研究人员提供专业数据库服务和数据分析技术支持，以及相关的网络资源。 分子系统发育分析平台包括了3个专业数据库。第一个是DNA凭证标本数据库。该数据库中的记录包括了7项字段：英文科名、中文科名、物种拉丁名、采集人、采集号、采集地和采集时间。用户可以通过设定单个或多个字段的取值进行检索。截止2004年6月1日，该数据库共包括3491条标本记录。第二个是引物数据库。PCR引物是分子系统学实验的重要条件之一。该数据库中的记录包括3项字段：引物名称、序列内容和退火温度。用户可以通过设定单个或多个字段的取值进行检索。截止2004年6月1日，该数据库共包括170条用于扩增植物细胞核、叶绿体和线粒体基因组DNA序列的引物记录。第三个是生物计算数据库。该数据库为研究人员提供传输和保存序列分析数据和结果文件的服务。 为了确保数据库的安全性和使用性，我们开发了数据库的接口和检索工具，以及系统管理员和用户资格认证程序。通过前者，使用者可以进行数据的上传、下载、管理和检索等操作。而后者则是对不同使用者身份和权限进行设定。管理员的权限高于用户，主要负责本系统的日常维护和管理工作，以及对新增管理员和用户进行资格认证。 分析技术支持旨在帮助用户快速掌握常用的系统发育分析方法，进行有效的数据分析，从复杂的统计学算法和计算机程序中解放出来，将精力集中于计算结果的生物学解释。在该部分中，我们首先简要介绍了常用的分析方法，并且针对分子系统学中的不同问题提供了相应的解决方案。这些问题包括：系统发育重建、替代速率和分歧时间的估计、祖先分布区的重建、性状进化假说的检验、以及密码子水平适应性进化的检测。我们特别强调了似然比检验和贝叶斯推测作为方法论上的重要进展在分子系统学中所发挥的关键作用。本部分还包括大量常用的分子系统学程序或软件包及其快速使用说明和命令模块。下载安装之后，用户即可按照说明使用命令模块进行数据分析。 此外，该平台还提供了一些常用的网络资源地址，如生物信息中心、分子进化和系统发育实验室、专业期刊和相关数据库等。 最后还给出了4个应用实例，即针对特定分子系统学问题的解决方案和初步的分析结果。 第一个例子说明系统发育重建方法的应用。为了确定杨梅科的系统学位置，对6种DNA序列和叶绿体trnL-F区内的间隔性状进行了分析。单个分析表明这6种序列之间在系统学信息上存在显著差异。叶绿体基因组序列的合并分析强烈支持杨梅科和（木麻黄科，（桦木科，核果桦科））的姐妹群关系，而间隔性状的存在能够充分提高其分辨率和支持率。 第二个例子说明如何推测历史生物地理学过程。我们对壳斗目8科25属植物叶绿体基因组的trnL-F、matK、rbcL和atpB的合并序列进行了最大简约分析，得到唯一的最大简约树。基于该系统树和25属植物的地理分布数据，采用扩散－替代分析方法重建了系统树每个节点上的祖先分布区，推测了壳斗目的分布历史。结果表明，壳斗目的历史生物地理学过程由3次替代事件和20次扩散事件组成。其中最重要的替代事件是由于冈瓦纳大陆和劳亚大陆分离所导致的南青冈科及其姐妹群之间的分化。另外，在壳斗科和核心高等金缕梅类中多次发生从欧亚大陆到北美洲、甚至南美洲的平行扩散事件。 第三个例子说明如何估计分歧时间。我们仍然使用扩散－替代分析中所用的最大简约树作为分析的依据，并根据等级制似然比检验确定的最优替代模型对该系统树的支长进行了最大似然优化。似然比检验表明，该系统树不服从分子钟假说。我们以冈瓦纳大陆和劳亚大陆分离的地质事件和5个属的最早化石记录作为标定点，采用罚分似然法在没有分子钟的条件下估计了壳斗目的科间分歧时间。结果表明，绝大多数科间分歧事件都发生在白垩纪。 第四个例子说明如何检测密码子水平的适应性进化。分支间可变选择压力模型的似然比检验表明SARS冠状病毒的S基因在跨种传播过程中发生了正选择。

山东山旺中新世植物重要类群演化生物学与古气候定量重建的研究

　　早在20世纪三十年代，前人发现山旺中新世具有丰富的植物化石，枝叶、果实、花保存完好。1940年我国植物学家胡先骗与美国加州大学钱耐发表研究专著《中国山东山旺中新世植物群》，报道了30科61属84种植物，为最早系统地进行山旺植物研究的奠基之作，至今仍然具有很高的科学价值和国际影响。1946年布朗发表论文涉及山旺部分属种修订工作。1951年斯行健发表文章：评胡先骗与钱耐著“山东中新统植物群”， 对部分属种鉴定提出异议。1978年植物所与南古所老一辈科学家又作了大量补充与修订，完成合著《中国新生代植物》，该书对山旺植物群进行了系统整理，总计43科87属125种植物，奠定了 山旺植物群的基本面貌。此后，山旺植物群陆续有新的类群添加。目前所知山旺植物群主要以温带落叶植物为主混生了部分亚热带常绿和落叶阔叶植物。该植物群不仅种类繁多，数量丰富，而且保存完整，是我国新生代植物群中研究程度最好的代表。 尽管山旺研究已经取得如此丰富的成果，但是在Hu&Chaney (1940)研究山旺植物群之后的长达60年里( 1940-1999)，关于山旺叶、果实与花的研究仅局限于外部的形态描述，缺乏对其进行细胞形态结构和角质层等结构植物学的实验分析研究，从而大大制约了对该植物群性质的理解和类群演化生物学的深入的研究。 近年来我们通过与国际国内同行的广泛合作，运用国际古植物学研究的新技术、新方法，如叶结构分析、角质层分析、细胞形态结构分析等，在光学显微镜与电子显微镜不同层次的观察上，将植物体外部形态学与内部细胞结构研究相结合，开展对山旺植物群的类群研究，取得了重要进展。我们首次成功提取了山旺植物“阿斯羌属”(As tronium)的角质层，并观察到气孔器结构，为该类群的正确修订提供了确凿的生物学证据，建立了化石新属钱耐属(Wang andManchester，2000)。山旺中新世地层中过去报道存在大量的“阿斯羌”花化石，为五个萼片宿存的辐射对称的花，果实球形，一枚，项生。这种生殖结构也普遍见于欧洲大陆的中新世地层和北美大陆美国的始新世地层中。欧洲人Heer在1859年提出它属于分布于东亚的旋花科的飞蛾藤属(Porana)植物; Weyland在1937年认为它应当是热带龙脑香科非洲马达加斯加岛屿特有分布的Mono tes属植物;美国人MacGinitie在1953年认为它属于分布于南美的漆树科的阿斯羌属(Astronium)植物，其确切系统位置众说纷纭。在中国新生代植物一书中，采用了美国人MacGinitie在1953年的观点，称之为阿斯羌花。斯行健先生认为是旋花科的飞蛾藤属植物。 我们调查了密苏里北京植物园标本馆馆藏的南美和非洲标本，以及哈佛大学标本馆的馆藏东亚标本，对上述科属现存植物的花结构进行了全面的详细研究。发现5个萼片宿存的辐射对称的花见于多个不同的科属类群，是一种趋同演化性状，而萼片脉纹与表皮细胞气孔器排列、果实形态与数目等特征在上述不同类群中极易区分。因而逐一排除了属于上述现存类群的可能性。我们研究的山旺与北美的化石标本显示的果实个体发育过程与现存植物苦木科苦木属(Picrasma)的果实发育相似，果实发育早期为5枚分离，后期3-4枚退化，仅1-2枚，通常为1枚球形果实留存，花瓣脱落，萼片宿存。但是，它们二者在果实形态与萼片表皮结构上，仍存在很大差异。现在认为它属于一个绝灭的植物类群，化石的系统位置尚无法放入现存的科属系统，可能接近于苦木科。因此，建立了一个化石新属钱耐属(Chaneya)。目前，该属包含二个种，一个分布于北美始新世地层，另一个分布于东亚中新世地层，欧洲的材料由于缺乏深入研究，尚无法确定归属。钱耐属在北半球第三纪地层中呈东亚北美间断分布。钱耐属的研究，不仅为探讨东亚与北美植物区系的联系和植物类群的分化历史提供了重要的证据(Wang and Manchester，2000)，更为深入探讨山旺化石植物重要类群的结构与演化生物学研究提供了成功的范例。 山旺的榉属(Zelkova)是山旺植物群的一个常见分子。榉属是欧亚大陆分布的植物，现存6种，在欧亚大陆第三纪地层中发现了大量的榉属化石，包括果实与叶连生的枝条。在北美大陆虽然有榉属化石报道，但是由于缺乏果实，仅靠叶的特征难以令人信服，榉属是否存在于北美仍有争议( Manchester，1989;Manchester，个人通讯)。近年基于我们在山旺组发现和采集到大量的榉属离散叶片以及联生有果实和叶的生殖枝条的深入研究，获得了化石叶结构、表皮细胞、表皮毛、气孔器、核果的大量结构生物学信息。通过与奥地利维也纳大学的 Ferguson教授合作，建立了欧亚现存榉属6个种的生物学形态与结构信息参照系，古今对比结果清楚表明山旺榉的叶缘齿式结构及表皮特征组合最接近我国南部分布的Z. schneideriana，而不是Hu and Chaney (1940)建议的广布于东亚的Z serrata，也明显不同于欧亚大陆共有、分布于西亚伊朗和东欧高加索地区的Z. carpinifolia。常见于欧洲第三纪的翁格榉(Z. ungeri)在形态学更接近Z.carpinifolia。因此，山旺榉明显不同于翁格榉，有其独立的种级特征，应建立东亚中新世榉属的一新种一山旺榉(Z shanwangensis sp. nov.)。榉属在欧亚大陆上的种级分化可能至少在中中新世即已出现。 我们1995年报道了山旺中新世地层发现中国特有植物杜仲化石，并利用先进的电子显微镜设备，找到了确凿无疑的原位化石杜仲特殊胶丝结构直接证据。《美国植物学报》1997年发表文章评论这是目前我国唯一可靠的、保存有精美的胶丝细胞结构的杜仲化石。近年我们迸一步采用古今结合的方法，运用自创的“特有种气候分析法”，对中国重要特有植物杜仲开展了多学科综合研究，利用现存杜仲种子春季萌发需要特定温度的生理学研究结果，结合自然分布区的温度分布，定量恢复了山旺中新世古春季温度数值;该项研究工作的论文列入著名国际SCI刊物《美国植物学报》2003年1月第一期首篇文章。美国植物学报评审人评价：这是应用现代植物实验数据解决地质时期古气候学问题的一个极好例子，是经典之说“现代是（认知）过去的钥匙”的例证，更是当前古植物学研究的一个范例。该文作出的重要贡献体现在如下几个方面：1、提供了现代植物生理生态的实验数据;2、提供了古植物学研究需要的解剖学证据（胶丝）;3、更正了古生物地理方面的一个假说（杜仲何时在中国出现）; 4、提出了一个解答古气候学问题的新方法。 最后一点实际上也是最重要的一点。” 油杉属的研究显示该属现代有三个种，生活在东亚中国，越南和老挝。它曾经在北半球广泛分布，以球果、种鳞、具翅的种子、木材等形式保存在新生代第三纪地层中，如已经有报道的北美大陆美国俄勒冈渐新世和中新世，欧洲中部中新世，亚洲日本中新世和上新世，俄罗斯远东渐新世到中新世地层。本次山旺中中新世与美国俄勒冈渐新世Rujada flora发现的油杉，接近现存油杉属的属型种油杉。北美中新世和亚洲日本中新世和上新世报道了接近于现存种铁坚油杉的化石。这些证据反映了东亚与北美第三纪植物区系的联系远比今天密切，油杉在北美中新世末期后、在欧洲早更新世之后和在东亚日本上新世结束，在上述地区消失。油杉今天仅孑遗分布于东亚中国秦岭以南、雅砻江以东，长江以南及台湾、海南岛和越南、老挝等亚热带至热带北缘的低山、丘陵山区。山旺油杉的球果化石具有现存油杉和铁坚油杉复合种的特征，可能代表了兼具中国两种油杉共同特征的一个早期类型，由此也表明油杉和铁坚油杉的物种分化在中国有可能是1500万年以来发生的新近事件。同时，油杉球果（松科）的首次发现，解决了山东山旺中中新世化石产地有无裸子植物这个长达半个世纪的争论(Hu andChaney，1940：斯行健，1951)，进一步确证了山旺中中新世气候为亚热带山地气候类型。

稻族的分子系统学研究

稻族（Oryzeae）是禾本科中包含多种经济植物的重要类群，现有大约12个属，广布于全球的热带和温带地区。虽然有证据表明稻族是一个单系类群，但稻族的分类处理和属间系统发育关系以及稻族的生物地理学等方面仍存在许多悬而未决的问题。本研究利用了7个DNA片段，包括2个叶绿体基因片段（trnL和matK）、1个线粒体基因片段（nad1）和4个分布在不同染色体上的核基因片段（Adh1、Adh2、GPA1和Waxy）以及形态性状（87个）重建了稻族的系统发育关系，并在此基础上利用6个DNA片段（trnL、matK、nad1、Adh1、Adh2和GPA1）探讨了稻属基部类群的系统发育关系。同时在系统发育研究的基础上，进一步探讨了稻族物种间的分歧时间及生物地理学问题。主要结果如下： 1.稻族的系统学 多基因和形态性状的分析表明：1）稻族是单系类群可分为两个主要分支，相当于传统的两个亚族，第一个亚族（Zizaniinae）包括稻属﹑假稻属和Porteresia，而第二个亚族（Oryzinae）包括其余8个属。两性花是稻族的原始状态，而单性花多次起源，共起源了3次，因此单性花和两性花的区别不宜作为划分亚族的依据;2）Zizania 与分布在南美的单型属Rhynchoryza关系最近;3）一些单型属（Hydrochloa、Porteresia和Prosphytochloa）的确立得不到分子证据的支持，特别是Hydrochloa，形态证据分析的结果明确不支持建立该单型属;4）形态分析结果支持Zizania 4个种聚为一支，而东亚的一个种（Zizania latifolia）为该属基部类群。 2.稻属基部类群的系统发育关系 多基因系统发育分析表明：1）稻属是一个单系类群;2）所有数据都支持稻属10种染色体组类型各自为单系，包括稻属中最后确定的染色体组类型HK（Oryza schlechteri和Porteresia coarctata）;3）F染色体组与HK和HJ中的H染色体组关系最近，类似于E染色体组与异源四倍体的CD染色体组中的D染色体组关系最近; 4）双亲遗传的核基因和母系遗传的线粒体和叶绿体基因的对比分析表明，HJ染色体组两个物种的母系来源是H，而HK染色体组两个物种母系来源是K。三个染色体组相比较，H分化较早，J次之，K分化最晚;5）在系统发育研究基础上，本研究认为稻属4个复合体的划分是可信的，原来未划分到任何一个复合体中的两个种O. brachyantha和O. schlechteri以及新近归入稻属的Oryza coarctata都应归入O. ridleyi复合体。 3.稻族各谱系的分化时间及其生物地理学意义 利用分子钟及其改进方法对稻族各谱系的起源和分化时间进行了估测，并在此基础上探讨了形成各类群地理分布式样的可能原因。结果表明，稻族在始新世（Eocene）晚期（3640万年前）起源于东南亚随后分为两大支。稻属基部类群G染色体组物种与稻属其他物种在1200万年前分开;稻属中A/B/C/E染色体组类群在700万年前开始分化。 在稻族的第一大支Oryzinae亚族中，稻属和假稻属1400万年前分开后，通过远程扩散及随后的漫长的历史过程形成了目前的分布格局。稻属从东南亚起源并逐渐扩散到非洲、澳洲及美洲;而假稻属则从非洲出发扩散到全球的热带和亚热带地区。这两个属的演化历史非常相似，都是全球广泛分布且起源时间较晚。 在稻族第二大支Zizaniinae亚族中，Zizania是稻族中唯一欧亚-北美间断分布属，与其分布在南美的姊妹群Rhynchoryza在2554万年前分开，这一支可能是先从南美扩散到东亚，然后再从东亚扩散到北美;Zizaniopsis和Luziola两属在南美洲和北美洲都有分布，其分歧时间为2180万年前，这两属具有类似的进化历史，即通过上新世（Pliocene）末期隆起的巴拿马陆桥形成现在的分布格局;Chikusichola与Potamophila/Prosphytochloa这一支从中新世（Miocene）早期（2270万年前）开始分化，由于Chikusichola（分布在东南亚）、Potamophila（澳大利亚）和Prosphytochloa（非洲）相距很远，这3个属的扩散必然与跨洋远距离扩散有关。

黄杉属的分子系统发育与生物地理学

松科植物的叶绿体和线粒体基因分别为父系和母系遗传，二者的联合分析为系统发育重建，特别是揭示网状进化过程提供了便利条件。此外，松科中的多个属（如黄杉属、铁杉属等）呈洲际间断分布，是研究生物地理学问题的良好试材。 本文选择来自于叶绿体和线粒体基因组的5个DNA片段，通过序列分析对黄杉属的所有8个种进行了系统发育重建;同时结合已有的对黄杉属的各方面研究，讨论了该属典型的东亚-北美间断分布式样的形成过程。主要结果如下： (1) 叶绿体DNA片段trnfM-trnS、rpl20和trnP的序列分析 无论叶绿体基因两两组合分析还是3个叶绿体片段的联合分析均强烈支持东亚的6种黄杉属植物聚为一支（支持率>96%），其中日本黄杉位于最基部，其他分布于中国的5个种聚在一起。 (2) 线粒体基因nad5和cox1的序列分析 线粒体基因序列的进化速率较慢，信息位点相对较少，因此分辨率较低。本文中线粒体DNA序列在黄杉属的东亚物种间几乎没有分辨率，但是仍以>60%的Bootstrap支持率将该属分为东亚与北美两个姐妹支。 (3) 5个DNA片段的联合分析 5个细胞质DNA片段(trnfM-trnS, rpl20, trnP, nad5, cox1)的联合数据矩阵长4351 bp，其中含变异位点129个（3.0%），信息位点109个（2.5%）。利用最大简约法进行的系统发育分析表明：黄杉属分成北美和东亚两支，与地理分布相吻合，并分别得到了66%和100%的支持;中国的5个物种形成一个单系分支，该分支与日本黄杉为姐妹群关系。 根据上述叶绿体和线粒体DNA片段的序列分析结果，并结合前人的研究资料，我们认为黄杉属通过白令陆桥扩散后，在北美和东亚独立进化，但该属的起源地尚需要进一步研究。

雪松属的分子系统发育与生物地理学

南北纬四十度之间的山区在冰期时为很多植物提供了避难所，因而受到生物地理学研究者的广泛关注。地中海地区和青藏高原（东南部）均是全球生物多样性热点地区，很多生物类群间断分布于这两个地区，研究这种间断分布格局的形成过程具有重要理论意义。雪松属（Cedrus）含有四个关系密切的种，间断分布于地中海地区和喜马拉雅西部。在本研究中，我们从父性遗传的叶绿体和母性遗传的线粒体基因组中选取了八个DNA片段，通过序列分析重建雪松属所有物种的系统发育关系，并探讨该属生物地理格局的形成过程。主要研究结果如下： 所有分析的DNA片段中均未发现种内变异。5个叶绿体片段的合并分析、3个线粒体片段的合并分析以及所有8个细胞质DNA片段的联合分析均只得到一棵最简约树，而且不同分析得到的树图结构高度一致。雪松属分为喜马拉雅（C. deodara）和地中海两支;在地中海雪松支系中，北非雪松（C. atlantica）构成一个亚支，地中海东部的黎巴嫩雪松（C. libani）和塞浦路斯雪松（C. brevifolia）形成另一亚支，两个亚支间为姐妹群关系，并已发生较大的遗传分化。该结果与细胞和生化等研究结果一致。 雪松属的可靠化石发现于哈萨克斯坦西部的渐新世地层、欧洲西南部的中新世地层、欧洲东南部的上新世地层以及撒哈拉的早更新世地层，这种化石分布暗示雪松属可能是在欧亚大陆的高纬度地区起源的。自第三纪开始，全球由广泛的高温气候演变为具有大面积陆地冰盖的寒冷气候，这种气候变化促进了生物群的演替和分化。我们对雪松属的系统发育研究表明：该属植物可能在欧亚大陆高纬度地区起源后，因气候变冷而南迁，并通过隔离分化形成环地中海－喜马拉雅间断分布格局。结合青藏高原和地中海地区的气候和地质历史，我们推测雪松属在中新世以后才分布到喜马拉雅地区，并很可能在第三纪末才迁移到北非。

云杉属的分子系统学与生物地理学研究

云杉属植物是非常重要的森林树种，广泛分布于北半球的寒温带、温带高山和亚高山地带。该属为松科中仅次于松属和冷杉属的第三大属，约有 28-56 种。自云杉属建立以来，其属于松科没有任何疑议。然而，由于云杉属物种间频繁杂交、形态趋同和取样困难，尽管已经有基于形态学、细胞学、化学成份、叶绿体 DNA RFLP 等方面的研究，该属的属下分类仍然存在诸多争议。本文利用父系遗传的叶绿体基因和母系遗传的线粒体基因序列重建了云杉属的系统发育关系，探讨了云杉属生物地理格局的形成过程。在此基础上，我们研究了低拷贝核 CAD 基因在云杉属的进化式样。另外，我们还对裸子植物线粒体基因 rps3 的内含子分布和进化进行了初步研究。 1． 云杉属的系统发育和生物地理学研究 我们选择了 Farjon (1990) 确定的 34 个种中的 33 种 (另一个种在 Flora of China 未得到承认)，共 103 个个体，对这些个体的叶绿体 DNA 片段 trnC-trnD 和 trnT-trnF 以及线粒体基因 nad5 的第一个内含子进行了序列测定。在两个叶绿体基因片段联合分析构建的系统发育树上，北美西部的 P. breweriana 和 P. sitchensis 位于最基部。其余的物种分为三支：第一支由北美的两个物种组成;第二支包括分布于喜马拉雅-横断山区及其周围地区的八个种、台湾的 P. morrisonicola、西亚的 P. orientalis、日本的两个种及北美的 P. chihuahuana;第三支中，北美的 P. pungens 位于基部，亚洲东北部的种 (除 P. maximowiczii 和 P. torano 外)、P. retroflexa 和欧洲的 P. abies 构成一个单系群，并与北美的 P. mariana 和 P. rubens 及来自巴尔干半岛的 P. omorika 形成姐妹支。所有样品的 nad5 第一个内含子序列可分为 A、B、C、D 和 E 5 种单倍型，北美的物种拥有前 4 种，而且 A、B 和 C 单倍型为北美所特有;欧亚的物种仅含 D 和 E 两种单倍型。 上述结果结合 MacClade 和 DIVA 分析及化石证据，我们推断云杉属起源于北美，至少两次经白令陆桥扩散至亚洲，然后从亚洲扩散至欧洲。亚洲东北部的绝大多数物种和欧洲云杉 P. abies 的种间遗传变异非常低，而且线粒体单倍型均为 D，可能来源于一次近期的辐射分化。云杉属的现代分布中心之一喜马拉雅-横断山区的物种可能不是一次起源，日本的物种同样如此，这可能与第三纪气候变冷和第四纪冰川导致的物种迁移有关。此外，我们发现目前用于云杉属分类的一些形态性状（如叶扁平、菱形等）在系统发育树上位于不同的位置，说明这些性状可能不是一次起源或是祖征在不同支系中的保留，用于云杉属的系统划分须慎重。 2． 云杉属 CAD 基因的进化研究 裸子植物的多倍体特别少，且以基因组庞大而著称。被子植物中的很多单拷贝基因在裸子植物中以低拷贝或多拷贝基因家族的方式存在。CAD 基因在木质素单体合成的最后一步起作用，在松属中只发现了一种 CAD 基因拷贝，在欧洲云杉中却发现了三种拷贝，而且 Southern 杂交和子代分离鉴定结果表明这三种拷贝至少位于两个位点上。然而，对云杉属三个物种 (包括欧洲云杉) 构建的遗传图谱却都只发现了一个 CAD 基因位点。由于云杉属 CAD 基因的数目和分布存在很大争议，我们根据构建的叶绿体基因树，选择了不同支上的 20 个物种、29 个样品研究该基因的进化式样。结果表明：云杉属不同物种中 CAD 基因的拷贝数为 1-4 种，多数为 2-3 种。系统发育分析发现有些物种的所有 CAD 基因拷贝聚成一支，另有一些物种的 CAD 基因拷贝位于不同位置。此外，我们对 GenBank 中云杉属三个物种 CAD 基因的 EST 序列分析后发现：EST 序列的差异主要发生在 3’-UTR 区，表现为序列长短的不同，这有可能是进行体外反转录时引物结合于不同的位置所致。因此，结合前人研究（包括遗传图谱分析），我们推测 CAD 基因在云杉属内发生了多次重复，重复拷贝很可能呈串联排列。 3. 裸子植物线粒体基因 rps3 的进化研究 线粒体基因内含子的获得/丢失已经被广泛应用于系统发育研究。rps3 为分布最广的线粒体核糖体蛋白基因，一般含一个内含子，前人研究显示其在裸子植物中多了一个第二类内含子 rps3i2，并将这个内含子作为区分裸子植物和其它植物类群的标志之一。然而，该研究只选择了苏铁和银杏作为裸子植物的代表，取样代表性不足。在本研究中，我们对裸子植物每个科至少选择一个物种作为代表，通过 DNA 序列和部分物种的 RT-PCR 分析，探讨 rps3 基因在裸子植物中的进化。结果表明 rps3 基因内含子的分布与裸子植物系统发育关系相吻合：Conifer II、松科的落叶松属和黄杉属及百岁兰科不仅不含 rps3i2，而且丢失了第一个内含子;金钱松属缺失第二个内含子。我们推断在 Conifer II 的祖先和百岁兰科中分别一次性丢失了两个内含子;在松科中则发生了两次单独的丢失事件，一次是在落叶松属和黄杉属的祖先中丢失了两个内含子，一次是在金钱松属中丢失了第二个内含子。另外，在 Ephedra 中没有扩增出 rps3 基因，Gnetum 中具有第二个内含子，倪藤科的 rps3i2 似乎支持松科与倪藤纲的关系更近。对 rps3i2 的进一步分析发现，其序列结构与松科的系统发育关系非常吻合。根据上述结果和 mRNA 编辑位点分析，我们认为 Conifer II等类群中的两个rps3内含子丢失可能是反转录酶介导的 cDNA 反转录造成的。Psuedolarix 的内含子丢失也可能为相同机制，但因缺乏材料而未能进一步研究。

长花马先蒿的居群遗传变异与生物地理学

青藏高原地区是我国植物物种多样性和特有性最高的地区，且作为东亚植物区系的一个现代分化中心受世人瞩目。长花马先蒿是青藏高原高山草甸的广布种，其地理分布格局的形成与高原的隆升和气候变迁有着密切关系。因此，对长花马先蒿进行谱系生物地理学研究，有助于探讨青藏高原地区物种快速分化的机制和群体建立过程。 本研究对长花马先蒿11个居群、188个个体的叶绿体DNA trnT-trnF区进行了序列分析，发现该片段的长度变异范围为1441-1472bp。对位排列后的矩阵（含外类群）长1534bp，内类群中含33个碱基替换和 17 个插入/缺失,可分为20种单倍型。11个地理居群的总核苷酸多态性（π）为0.00468，单倍型多态性（Hd）为0.853，居群间的遗传变异（FST）高达88.2％，说明长花马先蒿具有很高的遗传多样性，且居群间发生了强烈遗传分化。 系统发育和遗传多样性分析发现长花马先蒿的20种叶绿体单倍型可归于四个地理单元——川西高海拔地区、川北地区、云南德钦地区及川藏地区。进一步分析发现：4个地理单元间存在着显著的遗传分化, 说明长花马先蒿具有明显的谱系地理分布格局。其中川西高海拔地区的四种主导单倍型构成了系统发育树最基部的一支，而以川西地区为中心、向南扩展至云南的两个居群所包含的几种单倍型均属于比较进化的类型。单倍型的网络关系(Network) 显示出西藏、青海、云南及四川北部的一些单倍型间遗传差异很小，亲缘关系很近。上述结果表明：长花马先蒿群体在冰期后的重新扩张过程主要表现为由南往北的递进式扩散，第四纪冰期气候的反复波动导致了该物种居群随生境变化而不断扩张或收缩,形成了现今的分布格局。初步推测川西地区很可能曾是长花马先蒿在第四纪冰期时的重要避难所，瓶颈效应和奠基者效应对其遗传多样性分布格局有重要影响。