Sequence and function of lysosomal and digestive cathepsin D-like proteinases of Musca domestica midgut

Musca domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetic properties like cathepsin D. Three cDNAs coding for preprocathepsin D-like proteinases (ppCAD 1, ppCAD 2, ppCAD 3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The coded protein sequences included the signal peptide, propeptide and mature enzyme that has all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin D. Nevertheless, ppCAD 2 and ppCAD 3 lack the characteristic proline loop and glycosylation sites. A comparison among the sequences of cathepsin D-like enzymes from some vertebrates and those found in M. domestica and in the genomes of Aedes aegypti, Drosophila melanogaster, Tribolium castaneum, and Bombyx mori showed that only flies have enzymes lacking the proline loop (as defined by the motif: DxPxPx(G/A)P), thus resembling vertebrate pepsin. ppCAD 3 should correspond to the digestive cathepsin D-like proteinase (CAD) found in enzyme assays because: (1) it seems to be the most expressed CAD, based on the frequency of ESTs found. (2) The mRNA for CAD 3 is expressed only in the anterior and proximal middle midgut. (3) Recombinant procathepsin D-like proteinase (pCAD 3), after auto-activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (4) Immunoblots of proteins from different tissues revealed with anti-pCAD 3 serum were positive only in samples of anterior and middle midgut tissue and contents. (5) CAD 3 is localized with immunogold inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midguit cells. The data support the view that on adapting to deal with a bacteria-rich food in an acid midgut region, M. domestica digestive CAD resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin D, paralleling what happened with vertebrates. The lack of the proline loop may be somehow associated with the extracellular role of both pepsin and digestive CAD 3. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

The Aedes aegypti larval transcriptome: a comparative perspective with emphasis on trypsins and the domain structure of peritrophins

The genome sequence of Aedes aegypti was recently reported. A significant amount of Expressed Sequence Tags (ESTs) were sequenced to aid in the gene prediction process. In the present work we describe an integrated analysis of the genomic and EST data, focusing on genes with preferential expression in larvae (LG), adults (AG) and in both stages (SG). A total of 913 genes (5.4% of the transcript complement) are LG, including ion transporters and cuticle proteins that are important for ion homeostasis and defense. From a starting set of 245 genes encoding the trypsin domain, we identified 66 putative LG, AG, and SG trypsins by manual curation. Phylogenetic analyses showed that AG trypsins are divergent from their larval counterparts (LG), grouping with blood-induced trypsins from Anopheles gambiae and Simulium vittatum. These results support the hypothesis that blood-feeding arose only once, in the ancestral Culicomorpha. Peritrophins are proteins that interlock chitin fibrils to form the peritrophic membrane (PM) that compartmentalizes the food in the midgut. These proteins are recognized by having chitin-binding domains with 6 conserved Cys and may also present mucin-like domains (regions expected to be highly O-glycosylated). PM may be formed by a ring of cells (type 2, seen in Ae. aegypti larvae and Drosophila melanogaster) or by most midgut cells (type 1, found in Ae. aegypti adult and Tribolium castaneum). LG and D. melanogaster peritrophins have more complex domain structures than AG and T. castaneum peritrophins. Furthermore, mucin-like domains of peritrophins from T. castaneum (feeding on rough food) are lengthier than those of adult Ae. aegypti (blood-feeding). This suggests, for the first time, that type 1 and type 2 PM may have variable molecular architectures determined by different peritrophins and/or ancillary proteins, which may be partly modulated by diet.

Monitoramento do impacto de dejetos industriais em amostras de água do Rio Caí através do teste SMART em Dorsophila melanogaster

O presente estudo teve como objetivos (i) avaliar a validade do emprego do teste SMART, em Drosophila melanogaster, como indicador da contaminação de amostras de água superficial associada a misturas complexas, (ii) detectar a atividade tóxico-genética de dejetos industriais, lançados no rio Caí, empregando o cruzamento aprimorado. Dentro desta perspectiva, pretendeu também (iii) comparar os dados obtidos para as amostras sob influência de despejos industriais com aqueles previamente observados para amostras sob influência de dejetos de origem urbana, provenientes das cidades de Montenegro e São Sebastião do Caí (Silva., 1999). Na tentativa de avaliar a genotoxicidade, associada ao curso final do rio Caí, foram selecionados os seguintes pontos de coleta de despejos industriais: Km 18,6 - situado na foz do arroio Bom Jardim, próximo à área de disposição do efluente final líquido e da drenagem das áreas de disposição dos resíduos sólidos do complexo industrial – e Km 13,6 - no canal da bacia de acumulação e segurança 7 do pólo industrial Neste ensaio genético, cada amostra industrial foi administrada às larvas de terceiro estágio em duas diluições (25% e 50%), bem como na sua forma crua (100%) - sendo avaliados um total de 40 indivíduos por amostra por concentração, totalizando a análise de 11.712.000 células por amostra. Foram utilizados dois controles negativos, o controle de campo – representado pela nascente de um riacho localizada em uma área conservada com fraca ação antrópica e próxima aos pontos do rio – assim como o diluente água destilada. Uma vez que as freqüências das diferentes categorias de manchas não foram significantemente superiores àquelas observadas nos controles negativos (água destilada), os pontos Km 18,6 e Km 13,6 foram caracterizados como destituídos de ação genotóxica nos três meses de coleta : março, junho e setembro. Estes achados sugerem que, nas condições experimentais empregadas, os dejetos de origem industrial não foram capazes de induzir lesões do tipo mutação gênica, cromossômica, assim como eventos relacionados com recombinação mitótica. Por outro lado, a comparação dos dados obtidos no presente estudo com os observados por Silva (1999) para dejetos urbanos, revelou a validade do emprego do teste SMART como uma ferramenta para detecção de contaminação ambiental. De fato, as amostras urbanas referentes aos meses de março (Km 52, 78 e 80) e setembro (Km 52) – coletadas concomitantemente com as de origem industrial – foram diagnosticadas como indutoras de aneuploidias e/ou de grandes deleções cromossômicas. As potências genotóxicas médias estimadas mostraram que o Km 80 foi o local com o maior grau de genotoxicidade – seguido pelos Km 78 e 52 – que apresentaram potências semelhantes Considerando os resultados obtidos, em cinco pontos situados ao longo do curso final do rio Caí, conclui-se que os prejuízos causados pelos dejetos urbanos podem ser tão ou mais nocivos que os impostos pelos de origem industrial – especialmente em função de seu grande volume de lançamento.

Estudo do comportamento meiótico de espécies do grupo Willistoni de Drosophila

Considerando a importância do comportamento meiótico e da recombinação para regular os níveis de variabilidade genética, realizamos o primeiro estudo sobre a meiose masculina e feminina de seis membros do grupo da Drosophila willistoni, um dos mais representativos da família Drosophilidae na região Neotropical. Como ponto de partida, foi necessário padronizar condições técnicas para tal, adaptando protocolos pré-existentes e estabelecidos por outros autores para espécies procedentes do Hemisfério Norte, como a cosmopolita Drosophila melanogaster e a D. ananassae. A qualidade dos preparados e a resolução por nós encontradas para as espécies do grupo willistoni, foi muito superior às obtidas para D. melanogaster, sendo comparável com a excelência das figuras meióticas propiciadas pela D. ananassae. Apesar do baixo número de células em divisão (cerca de 45% dos machos, em média) detectadas, conseguimos caracterizar as fases da divisão meiótica em primórdios das gônadas de larvas macho de D. willistoni e o padrão de sinapse do par sexual e dos autossomos. Inicialmente, foi realizada a análise de duas diferentes populações, cuja prole apresenta sinais de instabilidade genética (como hipermutabilidade e atrofia gonadal), sob condições de cultivo em temperaturas fisiológica e restritiva. Em machos de ambas as linhagens (exceto em uma delas, onde observou-se um indivíduo aneuplóide XO), e nos machos da primeira geração de cruzamento entre as duas populações, não foram observadas irregularidades meióticas nem aberrações cromossômicas, tanto sob temperatura fisiológica, quanto restritiva. Análise posterior da população híbrida, mantida em laboratório, entretanto, permitiu a detecção de quebras, de pontes anafásicas, e de figuras compatíveis com quiasmas no segundo par cromossômico No braço esquerdo do cromossomo II (o chamado IIL) nesta população híbrida, segregam três inversões, a IILF (sub-terminal) e as inversões IILD+E, (na região mediana). Analisando paralelamente as configurações dos cromossomos politênicos interfásicos das glândulas salivares larvais e os meióticos dos primórdios das gônadas de cada larva macho individualmente, observou-se que sempre que ocorreram pontes anafásicas, os indivíduos eram heterozigotos para pelo menos a inversão IILF, e que as quebras detectadas no segundo cromossomo ocorreram na região subterminal de um dos braços. Estes achados fazem supor que nestes machos, estaria havendo recombinação dentro da alça de inversão formada em heterozigotos para a inversão IILF, o que necessita ser testado através de dados genéticos, em estudos futuros. Em machos de uma população natural desta espécie, também observou-se figuras compatíveis com quiasmas na parte terminal do mesmo braço esquerdo do segundo cromossomo, onde segrega a inversão IILH. Já a meiose de machos de uma população de cada uma das espécies crípticas D. paulistorum, D. tropicalis, D. equinoxialis, D. insularis e da não críptica D. nebulosa, mostrou-se regular, não sendo encontradas evidências de não-disjunções, quebras e pontes anafásicas, como em D. willistoni, apesar de todas elas apresentarem polimorfismo cromossômico para inversões paracêntricas (embora menor). O estudo futuro de novas populações deverá esclarecer se a D. willistoni suporta ou não, maiores níveis de recombinação em machos do que as outras espécies, e se estes achados podem ser interpretados como uma estratégia da D. willistoni (considerada como ancestral às outras) para manter altos níveis de polimorfismo, sem perdas gaméticas importantes, nem comprometimento da estabilidade de seu sistema genético A meiose de fêmeas de Drosophila willistoni e de D. paulistorum também foi caracterizada em linhagens igualmente polimórficas, de ambas as espécies. A detecção citológica de recombinação, entretanto, não foi possível, devido à peculiaridade dos cromossomos de oócitos, de assumirem a forma de cariossomo, altamente compactada justo nas fases de prófase I.

O elemento transponível hobo e suas seqüências relacionadas no genoma de Drosophila simulans

O elemento transponível hobo pode estar presente sob três formas no genoma de Drosophila simulans: como cópias autônomas completas (ou canônicas), como cópias defectivas internamente deletadas e como seqüências relacionadas a hobo (ou “relics”). Algumas evidências indicam que cópias completas e internamente deletadas são aquisições recentes desse genoma, enquanto os “relics” são componentes antigos, normalmente degenerados, defectivos e até recentemente considerados imóveis. O estudo desse tipo de seqüências pode ajudar a desvendar algumas questões sobre sua origem, dinâmica e seu papel na história evolutiva da família hobo. No presente trabalho, buscamos contribuir ao entendimento de algumas dessas questões estudando a dinâmica de uma família particular de seqüências relacionadas a hobo de D. simulans. Primeiramente, isolamos uma seqüência “relic” hobo envolvida no surgimento de uma mutação white de novo em uma linhagem hipermutável de D. simulans. Esta seqüência, denominada hobov-a, apresenta divergência típica de elemento “relic” em relação ao elemento canônico, é defectiva como outras já descritas, porém, mobilizável, pois apresentando estruturas essenciais para mobilização bem conservadas. Além disso, apresenta alta similaridade estrutural e de seqüência com um elemento “relic” de Drosophila sechellia, mas parece estar ausente do genoma de Drosophila melanogaster. A análise populacional de hobov-a revela que estes elementos são bem conservados entre diferentes populações de D. simulans. Apresentam, ainda, polimorfismo de sítios de inserção e variabilidade no número de cópias, o que nos dá fortes indícios de atividade atual ou recente desses elementos no genoma dessas populações. Pela similaridade compartilhada com elementos MITEs em muitas de suas características estruturais e funcionais, sugerimos, apontando algumas evidências, que elementos hobov-a podem ser ou uma nova família de MITEs de Drosophila ou, mais provavelmente, estariam se encaminhando para esse destino, utilizando o elemento canônico como fonte para sua mobilização.

Microarray analysis of cytochrome P450 mediated insecticide resistance in Drosophila

Insecticide resistance in laboratory selected Drosophila strains has been associated with upregulation of a range of different cytochrome P450s, however in recent field isolates of D. melanogaster resistance to DDT and other compounds is conferred by one P450 gene, Cyp6g1. Using microarray analysis of all Drosophila P450 genes, here we show that different P450 genes such as Cyp12d1 and Cyp6a8 can also be selected using DDT in the laboratory. We also show, however, that a homolog of Cyp6g1 is over-expressed in a field resistant strain of D. simulans. In order to determine why Cyp6g1 is so widely selected in the field we examine the pattern of cross-resistance of both resistant strains and transgenic flies over-expressing Cyp6g1 alone. We show that all three DDT selected P450s can confer resistance to the neonicotinoid imidacloprid but that Cyp6a8 confers no cross-resistance to malathion. Transgenic flies over-expressing Cyp6g1 also show cross-resistance to other neonicotinoids such as acetamiprid and nitenpyram. We suggest that the broad level of cross-resistance shown by Cyp6g1 may have facilitated its selection as a resistance gene in natural Drosophila populations. (C) 2003 Elsevier B.V. Ltd. All rights reserved.

The evolutionary dynamics of the Helena retrotransposon revealed by sequenced Drosophila genomes

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Characterization of two full-sized P elements from Drosophila sturtevanti and Drosophila prosaltans

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Testing transposable elements as genetic drive mechanisms using Drosophila P element constructs as a model system

The use of transposable elements (TEs) as genetic drive mechanisms was explored using Drosophila melanogaster as a model system. Alternative strategies, employing autonomous and nonautonomous P element constructs were compared for their efficiency in driving the ry(+) allele into populations homozygous for a ry(-) allele at the genomic rosy locus. Transformed flies were introduced at 1%, 5%, and 10% starting frequencies to establish a series of populations that were monitored over the course of 40 generations, using both phenotypic and molecular assays. The transposon-borne ry(+) marker allele spread rapidly in almost all populations when introduced at 5% and 10% seed frequencies, but 1% introductions frequently failed to become established. A similar initial rapid increase in frequency of the ry(+) transposon occurred in several control populations lacking a source of transposase. Constructs carrying ry(+) markers also increased to moderate frequencies in the absence of selection on the marker. The results of Southern and in situ hybridization studies indicated a strong inverse relationship between the degree of conservation of construct integrity and transposition frequency. These finding have relevance to possible future applications of transposons as genetic drive mechanisms.

Ancestral polymorphism and recent invasion of transposable elements in Drosophila species

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

The copia retrotransposon and horizontal transfer in Drosophila willistoni

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

msechBari, a new MITE-like element in Drosophila sechellia related to the Bari transposon

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Canonical P elements are transcriptionally active in the saltans group of Drosophila

Up to now, investigations of expression and regulation of P transposable element have been almost exclusively carried out with the Drosophila melanogaster canonical P element. Analyzing eight species of the saltans group, we detected transposase mRNA in germline tissues of D. saltans and D. prosaltans and repressor mRNA in somatic tissues of D. saltans and D. sturtevanti. Sequencing analysis suggested that these transcripts might belong to the canonical subfamily and that they can be transpositionally active only in D. saltans. dN and dS values of Adh and the P element suggested that the sequences found in D. saltans and D. prosaltans might have been present in the ancestor of the saltans subgroup and that the sequence found in D. sturtevanti might have been horizontally transferred from D. saltans.

Análise da ocorrência de transposição em regiões reguladoras dos genes da família Cyp em espécies de Drosophila

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Genomic regions harboring insecticide resistance-associated Cyp genes are enriched by transposable element fragments carrying putative transcription factor binding sites in two sibling Drosophila species

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)