930 resultados para Apoptosis
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Ionizing radiation is known to initiate apoptosis in mammalian cells by causing the transformation of cytochrome c into a peroxidase, which results in the specific peroxidation of the mitochondrial phospholipid cardiolipin. Here we report the design and synthesis of 8 imidazole fatty acid derivatives that bind to the cyt c:CL complex and inhibit the peroxidase activity required for the initiation of apoptosis. We postulate that imidazole acts as a sixth ligand to the haem iron and stops the interaction with H2O2. Two mitochondrially directed analogues (3-hydroxypropyl)triphenylphosphonium esters) of 12-imidazole-stearic acid and 12-imidazole-oleic acid not only were demonstrated to be peroxidase inhibitors in vitro, but were also extraordinarily effective in protecting mice from lethal doses (9 Gy) of ionization radiation. We studied the structure activity relationship to a group of triphenyl phosphonium derivatives containing imidazole at different positions on the fatty acid chain, and observed that the C8-imidazole stearate analogue had marginally better activity than the others. But overall, the structure activity result were remarkable flat with all compounds prepared having rather similar inhibitory strength. We also synthesized carnitine mono and di-esters of 12-imidazole fatty acids but full biological data is not yet available for these compounds.
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Endonuclease G (EndoG) is a well conserved mitochondrial nuclease with dual lethal and vital roles in the cell. It non-specifically cleaves endogenous DNA following apoptosis induction, but is also active in non-apoptotic cells for mitochondrial DNA (mtDNA) replication and may also be important for replication, repair and recombination of genomic DNA. The aim of our study was to examine whether EndoG exerts similar activities on exogenous DNA substrates such as plasmid DNA (pDNA) and viral DNA vectors, considering their importance in gene therapy applications. The effects of EndoG knockdown on pDNA stability and levels of encoded reporter gene expression were evaluated in the cervical carcinoma HeLa cells. Transfection of pDNA vectors encoding short-hairpin RNAs (shRNAs) reduced levels of EndoG mRNA and nuclease activity in HeLa cells. In physiological circumstances, EndoG knockdown did not have an effect on the stability of pDNA or the levels of encoded transgene expression as measured over a four day time-course. However, when endogenous expression of EndoG was induced by an extrinsic stimulus (a cationic liposome transfection reagent), targeting of EndoG by shRNA improved the perceived stability and transgene expression of pDNA vectors. Therefore, EndoG is not a mediator of exogenous DNA clearance, but in non-physiological circumstances it may non-specifically cleave intracellular DNA regardless of its origin. To investigate possible effects of EndoG on viral DNA vectors, we constructed and evaluated AdsiEndoG, a first generation adenovirus (Ad5 E1) vector encoding a shRNA directed against EndoG mRNA, along with appropriate Ad5 E1 controls. Infection of HeLa cells with AdsiEndoG at a multiplicity of infection (MOI) of 10 p.f.u./cell resulted in an early cell proliferation defect, absent from cells infected at equivalent MOI with control Ad5 E1 vectors. Replication of Ad5 E1 DNA was detected for all vectors, but AdsiEndoG DNA accumulated to levels that were 50 fold higher than initially, four days after infection, compared to 14 fold for the next highest control Ad5 E1 vector. Deregulation of the cell cycle by EndoG depletion, which is characterized by an accumulation of cells in the G2/M transition, is the most likely reason for the observed cell proliferation defect. The enhanced replication of AdsiEndoG is consistent with this conclusion, as Ad5 E1 DNA replication is intimately related to cell cycling and prolongation or delay in G2/M greatly enhances this process. Furthermore, infection of HeLa with AdsiEndoG at MOI of 50 p.f.u./cell resulted in an almost complete disappearance of viable, adherent tumour cells from culture, whereas almost a third of the cells were still adherent after infection with control Ad5 E1 vectors, relative to the non-infected control. Therefore, targeting of EndoG by RNAi is a viable strategy for improving the oncolytic properties of first generation adenovirus vectors. In addition, AdsiEndoG-mediated knockdown of EndoG reduced homologous recombination between pDNA substrates in HeLa cells. The effect was modest but, nevertheless demonstrated that the proposed role of EndoG in homologous recombination of cellular DNA also extends to exogenous DNA substrates.
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Tesis (Maestra en Ciencias con Orientacin en Morfologa) UANL
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Tesis ( Doctorado en Medicina) UANL
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Drak2 est un membre de la famille des protines associes la mort et cest une srine/thronine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne prsentent aucune dfectuosit apparente en apoptose induite par activation, aprs stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation rduit, compares aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre tude, lanalyse dhybridation in situ a rvl que lexpression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie dune expression plus focale dans les divers organes pendant la priode prinatale et lge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la mdullaire surrnale, lestomac, la peau et les testicules. Nous avons cr des souris transgniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularit et leur poids splniques taient infrieurs compar aux souris de type sauvage. Aprs activation TCR, la rponse prolifrative des cellules T Tg Drak2 tait normale, mme si leur production dinterleukine (IL)-2 et IL-4 mais non dinterfron-r tait augmente. Les cellules T Tg Drak2 actives ont dmontr une apoptose significativement accrue en prsence dIL-2 exogne. Au niveau molculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifest une augmentation moins leve des facteurs anti-apoptotiques durant lactivation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnrables aux attaques subsquentes dIL-2. Lapoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a t associe un nombre rduit de cellules T ayant le phnotype des cellules mmoires (CD62Llo) et avec des ractions secondaires rprimes des cellules T dans lhypersensibilit de type diffr. Ces rsultats dmontrent que Drak2 sexprime dans le compartiment des cellules T mais nest pas spcifique aux cellules T; et aussi quil joue des rles dterminants dans lapoptose des cellules T et dans le dveloppement des cellules mmoires T. En outre, nous avons recherch le rle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabte. LARNm et la protine Drak2 ont t rapidement induits dans les cellules beta de llot aprs stimulation exogne par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est prsente de faon endogne dans le diabte, quil soit de type 1 ou de type 2. La rgulation positive de Drak2 a t accompagne dune apoptose accrue des cellules beta. Lapoptose des cellules beta provoque par les stimuli en question a t inhibe par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a men lapoptose aggrave des cellules beta dclenche par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les lots a compromis laugmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expriences in vivo ont dmontr que les souris Tg Drak2 taient sujettes au diabte de type 1 dans un modle de diabte provoqu par de petites doses multiples de streptozotocine et quelles taient aussi sujettes au diabte de type 2 dans un modle dobsit induite par la dite. Nos donnes montrent que Drak2 est dfavorable la survie des cellules beta. Nous avons aussi tudi la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouv que Drak2 purifie pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entran laugmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que labaissement de Drak2 dans ces cellules a rduit la phosphorylation. Ces recherches mcanistes ont prouv que p70S6 kinase tait vritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette tude a dcouvert les fonctions importantes de Drak2 dans lhomostasie des cellules T et le diabte. Nous avons prouv que p70S6 kinase tait un substrat de Drak2. Nos rsultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 lintrieur des systmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rles de Drak2 dans le dveloppement des cellules mmoires T et la survie des cellules beta pourraient tre explores pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabte.
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MicroARN (miARN) ont rcemment merg comme un acteur central du gne rseau de rgulation impliqus dans la prise du destin cellulaire. L'apoptose, un actif processus, par lequel des cellules dclenchent leur auto-destruction en rponse un signal, peut tre contrl par les miARN. Il a galement t impliqu dans une varit de maladies humaines, comme les maladies du cur, et a t pens comme une cible pour le traitement de la maladie. Tanshinone IIA (TIIA), un monomre de phenanthrenequinones utilis pour traiter maladies cardiovasculaires, est connu pour exercer des effets cardioprotecteurs de l'infarctus du myocarde en ciblant l'apoptose par le renforcement de Bcl-2 expression. Pour explorer les liens potentiels entre le miARN et l'action anti-apoptotique de TIIA, nous tudi l'implication possible des miARN. Nous avons constat que l'expression de tous les trois membres de la famille miR-34, miR-34a, miR-34b et miR-34c ont t fortement rgule la hausse aprs l'exposition soit la doxorubicine, un agent endommageant l'ADN ou de pro-oxydant H2O2 pendant 24 heures. Cette rgulation la hausse caus significativement la mort cellulaire par apoptose, comme dtermin par fragmentation de l'ADN, et les effets ont t renverss par les ARNs antisens de ces miARN. Le prtraitement des cellules avec TIIA avant l'incubation avec la doxorubicine ou H2O2 a empch surexpression de miR-34 et a rduit des apoptose. Nous avons ensuite tabli BCL2L2, API5 et TCL1, en plus de BCL2, comme les gnes nouveaux cibles pour miR-34. Nous avons galement lucid que la rpression des ces gnes par MiR-34 explique l'effet proapoptotique dans les cardiomyocytes. Ce que la rgulation positive de ces gnes par TIIA realise par la rpression de l'expression de miR-34 est probable le mcanisme molculaire de son effet bnfique contre ischmique lsions cardiaques.
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Thse numrise par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
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La toxine stable la chaleur de type b (STb) est une des toxines produites par les souches Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) implique dans le dveloppement de la diarrhe. Une tude antrieure par Goncalves et al. (2009) a dmontr que les cellules ayant internalis la toxine STb dmontraient une morphologie qui rappelle lapoptose. Le changement du potentiel membranaire observ par Goncalves et al. (2009) nous a incit vrifier la capacit de la toxine STb induire lapoptose des cellules HRT-18 et IEC-18 par la voie intrinsque. Les cellules HRT-18 et IEC-18 ont t traites avec de la toxine purifie pour une dure de 24 heures puis ells ont t rcoltes et examines pour des caratristiques de lapoptose. Lactivation des caspases-9 et -3, mais pas de la caspase-8, a t observe dans les deux lignes cellulaires laide des substrats fluorescents spcifiques pour chaque caspase. LADN extrait des cellules HRT-18 et IEC-18 a rvl une fragmentation lorsque migr sur gel dagarose. La condensation et la fragmentation des noyaux ont t observes en microscopie fluorescence suite une coloration de lADN au Hoechst 33342. Les indices apoptotiques des cellules HRT-18 et IEC-18 traites avec des quantits croissantes de STb montrent une dose-rponse pour les deux lignes. Lactivation de la caspase-9 est une indication que la voie intrinsque de lapoptose est active dans les cellules HRT-18 et IEC-18. Labsence de lactivation de la caspase-8 dmontre que la voie extrinsque nest pas implique dans la mort cellulaire mdie par STb.
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Introduction : La nphrotoxicit est une complication majeure de la gentamicine, qui est largement utilise dans le traitement des infections bactriennes, en particulier celles provoques par des bactries Gram-ngatif. La gentamicine induit l'apoptose tubulaire, mais les mcanismes molculaires impliqus demeurent mal compris. Dans ltude prsente, nous avons examin le rle des espces ractives de l'oxygne (ROS) , des proteins Bax, Bmf et Caspase-12 (Csp-12) dans le mcanisme daction de la gentamicine sur l'apoptose des tubules proximaux rnaux (RPT) et les dommages rnaux induits par ce mdicament chez la souris. Mthode: Des souris adultes (ges 18-19 semaines) mles non-Tg et des souris transgniques (CAT-Tg) qui surexpriment la catalase spcifiquement dans leurs cellules des RPT ont t traites par injections intra-pritonales de gentamicine (20 mg/kg/jour) pour 5 jours conscutifs, puis euthanasis. Les reins ont t examins et analyss par histologie, immunohistochimie pour presansance de la stress oxidative, expression des proteins Bax, Bmf et Csp-12 et essai TUNEL pour tudier de lapoptose . Nous avons aussi examin l'effet de la gentamicine sur gnration des ROS et lapoptose dans les cellules RPTC immortalises de rat (IRPTC) in vitro. Rsultats: In vivo, chez les souris non-Tg, la gentamicine induit une tubulopathie et l'apoptose des RPT , stimule la production de ROS et induit une augmentation de Bax et Bmf dtecte par immunohistochimie et augmont activit du caspase-12. Ces changements sont attnus chez les souris Cat-Tg. In vitro, la gentamicine induit lapoptos des cellulles. Le co-traitement avec la catalase normalise ces effets dans les IRPTC. Conclusion : Ces donnes dmontrent que l'apoptose des RPTC induite par la gentamicine seffectue, au moins en partie, par l'intermdiaire de la gnration des ROS.
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The work is an attempt to understand the role of 5-HT, 5-HT1A and 5-HT2C receptors in the regulation of liver cell proliferation using in vivo and in vitro models. The work also focuses on the brain serotonergic changes associated with hapatocyte proliferation and apoptosis to delineate its regulatory function. The investigation of mechanisms involving different models of hepatocyte proliferation contributes to our knowledge about serotonergic regulation of cell growth, apoptosis and carcinogenesis of liver. The study reveals that the alteration of the 5-HT1A and 5-HT2C receptor function and gene expression in the brain stem, cerebral cortex and hypothalamus play an important role in the sympathetic regulation of cell proliferation, neoplastic transformation and apoptosis. The functional balance between 5-HT1A and 5-HT2C receptor plays an important role in regulating hepatocyte proliferation, neoplastic transformation and hepatic apoptosis. The regulatory role of 5-HT1A and 5-HT2C receptor during neoplastic transformation and apoptosis could lead to possible therapeutic intervention in the treatment of cancers and have immense clinical importance.
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Parkinsons disease is a chronic progressive neurodegenerative disorder characterized by the selective loss of dopaminergic neurons in the SNpc resulting in severe motor impairments. Serotonergic system plays an important regulatory role in the pathophysiology of PD in rats, the evaluation of which provides valuable insight on the underlying mechanisms of motor, cognitive and memory deficits in PD. We observed a decrease in 5-HT content in the brain regions of 6-OHDA infused rat compared to control. The decreased 5-HT content resulted in a decrease of total 5-HT, 5-HT2A receptors and 5-HTT function and an increase of 5-HT2C receptor function. 5-HT receptor subtypes - 5-HT2A and 5-HT2C receptors have differential regulatory role on the modulation of DA neurotransmission in different brain regions during PD. Our observation of impaired serotonergic neurotransmission in SNpc, corpus striatum, cerebral cortex, hippocampus, cerebellum and brain stem demonstrate that although PD primarily results from neurodegeneration in the SNpc, the associated neurochemical changes in other areas of the brain significantly contributes to the different motor and non motor symptoms of PD. The antioxidant enzymes SOD, CAT and GPx showed significant down regulation which indicates increased oxidative damage resulting in neurodegeneration. We also observed an increase in the level of lipid peroxidation. Reduced expression of anti-apoptotic Akt and enhanced expression of NF-B resulting from oxidative stress caused an activation of caspase-8 thus leading the cells to neurodegeneration by apoptosis. BMC administration in combination with 5-HT and GABA to PD rats showed reversal of the impaired serotonergic neurotransmission and oxidative stress mediated apoptosis. The transplanted BMC expressed NeuN confirming that 5-HT and GABA induced the differentiation and proliferation of BMC to neurons in the SNpc along with an increase in DA content and an enhanced expression of TH. Neurotrophic factors BDNF and GDNF rendered neuroprotective effects accompanied by improvement in behavioural deficits indicating a significant reversal of altered dopaminergic and serotonergic neurotransmission in PD. The restorative and neuroprotective effects of BMC in combination with 5-HT and GABA are of immense therapeutic significance in the clinical management of PD.
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El cncer gstrico es una de las enfermedades neoplsicas de ms alta incidencia y mortalidad a nivel mundial: es el segundo tipo de cncer ms frecuente en el mundo y la primera causa mundial de mortalidad por esta enfermedad. Por su parte, la apoptosis es un proceso importante de muerte celular programada que se presenta durante la embriognesis, la regulacin del sistema inmune y el mantenimiento de la homeostasis tisular. La evasin de la apoptosis por diferentes mecanismos es uno de los aspectos moleculares ms importantes en el desarrollo de cncer. En este artculo se presenta una revisin exhaustiva de la evidencia del papel de la apoptosis va Fas/FasL en el desarrollo de la carcinognesis gstrica, inclusive desde etapas tempranas, como la aparicin de lesiones preneoplsicas. Finalmente, se evidencia que el desarrollo de ms estudios permitira esclarecer mejor el papel de la va Fas/FasL en la carcinognesis gstrica, en sus diferentes estadios.
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La sepsis es un evento inflamatorio generalizado del organismo inducido por un dao causado generalmente por un agente infeccioso. El patgeno ms frecuentemente asociado con esta entidad es el Staphylococcus aureus, responsable de la induccin de apoptosis en clulas endoteliales debida a la produccin de ceramida. Se ha descrito el efecto protector de la protena C activada (PCA) en sepsis y su relacin con la disminucin de la apoptosis de las clulas endoteliales. En este trabajo se analiz la activacin de las quinasas AKT, ASK1, SAPK/JNK y p38 en un modelo de apoptosis endotelial usando las tcnicas de Western Blotting y ELISA. Las clulas endoteliales (EA.hy926), se trataron con C2-ceramida (130M) en presencia de inhibidores qumicos de cada una de estas quinasas y PCA. La supervivencia de las clulas en presencia de inhibidores qumicos y PCA fue evaluada por medio de ensayos de activacin de las caspasas 3, 7 y 9, que verificaban la muerte celular por apoptosis. Los resultados evidencian que la ceramida reduce la activacin de AKT y aumenta la activacin de las quinasas ASK, SAPK/JNK y p38, en tanto que PCA ejerce el efecto contrario. Adicionalmente se encontr que la tiorredoxina incrementa la activacin/fosforilacin de AKT, mientras que la quinasa p38 induce la defosforilacin de AKT.
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Ribonucleases are promising agents for use in anticancer therapy. Among the different ribonucleases described to be cytotoxic, a paradigmatic example is onconase which manifests cytotoxic and cytostatic effects, presents synergism with several kinds of anticancer drugs and is currently in phase II/III of its clinical trial as an anticancer drug against different types of cancer. The mechanism of cytotoxicity of PE5, a variant of human pancreatic ribonuclease carrying a nuclear localization signal, has been investigated and compared to that of onconase. Methods: Cytotoxicity was measured by the MTT method and by the tripan blue exclusion assay. Apoptosis was assessed by flow cytometry, caspase enzymatic detection and confocal microscopy. Cell cycle phase analysis was performed by flow cytometry. The expression of different proteins was analyzed by western blot.n Results: We show that the cytotoxicity of PE5 is produced through apoptosis, that it does not require the proapoptotic activity of p53 and is not prevented by the multiple drug resistance phenotype. We also show that PE5 and onconase induce cell death at the same extent although the latter is also able to arrest the cell growth. We have compared the cytotoxic effects of both ribonucleases in the NCI/ADR-RES cell line by measuring their effects on the cell cycle, on the activation of different caspases and on the expression of different apoptosis- and cell cycle-related proteins. PE5 increases the number of cells in S and G2/M cell cycle phases, which is accompanied by the increased expression of cyclin E and p21WAF1/CIP1 together with the underphosphorylation of p46 forms of JNK. Citotoxicity of onconase in this cell line does not alter the cell cycle phase distribution and it is accompanied by a decreased expression of XIAP. Conclusions: We conclude that PE5 kills the cells through apoptosis associated with the p21WAF1/CIP1 induction and the inactivation of JNK. This mechanism is significantly different from that found for onconase
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En aquesta tesi s'han estudiat les propietats antitumorals d'una variant de la ribonucleasa pancretica humana anomenada PE5 que incorpora un senyal de localitzaci nuclear. Aquest estudi mostra que PE5 indueix l'apoptosi de les cllules tractades i que aquesta mort s independent de l'activitat de p53. A ms, l'efecte citotxic no es veu afectat per un fenotip de resistncia a mltiples drogues. Les dades tamb mostren que l'activitat citotxica de PE5 s selectiva per a cllules tumorals in vitro i que la capacitat citotxica de les dues ribonucleases s semblant. S'ha estudiat l'efecte d'aquestes dues ribonucleases sobre el cicle cellular, l'activaci de diferents caspases i l'expressi de protenes relacionades amb l'apoptosi i el cicle cellular. Els resultats indiquen que PE5 i l'onconasa maten les cllules a travs de mecanismes diferents. A ms, PE5 per no l'onconasa, redueix l'acumulaci de glicoprotena-P en dues lnies cellulars resistents a mltiples drogues.
