Évaluation de la fréquence des micronoyaux et du potentiel clastogène et/ou aneugène du benzo-a-pyrène suite à une exposition in vitro des lymphocytes humains

Le benzo-a-pyrène (BaP) est un cancérogène reconnu pour l'homme, contaminant présent dans notre environnement. Il cause des dommages à l'ADN que nous avons mesurés dans les lymphocytes exposés à de faibles concentrations de BaP, provenant de 20 jeunes volontaires non fumeurs et en santé. Suite à l’exposition, la fréquence des micronoyaux (MN) augmente significativement et décrit une courbe dose-réponse non linéaire, suggérant le déclenchement du processus de détoxification et la réparation de l’ADN. Des différences entre les individus et entre les sexes sont présentes dans la réponse génotoxique produite par le BaP. Le test des aberrations chromosomiques montre que le pourcentage de chromosomes cassés augmente significativement dans les cellules exposées au BaP. Combinés avec l'augmentation de la fréquence des MN, nos résultats confirment l'effet clastogène du BaP déjà rapporté dans la littérature. L’hybridation in situ en fluorescence (FISH) des MN avec une sonde pancentromérique est aussi utilisée pour établir leur mécanisme de formation. La FISH révèle que la majorité des MN formés après une exposition au BaP contient un centromère et plus, ce qui est significativement différent de la condition non exposée. Plus précisément, dans nos conditions expérimentales, les MN induits par le BaP contiennent surtout trois centromères et plus, indiquant également la présence d'un effet aneugène. L'effet clastogène du BaP est relié à son rôle d'initiateur dans la cancérogenèse, alors que l'effet aneugène le relierait à l'étape de progression. Ces résultats sont importants puisque l'exposition aux composés de la classe du BaP est de longue durée (cigarette, air pollué).

Étude du mécanisme par lequel la thérapie à l'IL7 induit l'expansion homéostatique des lymphocytes T CD4+

Dans les cas de lymphopénie, les lymphocytes T résiduels prolifèrent exagérément dans un phénomène appelé «expansion homéostatique périphérique» (HPE), qui est efficace pour la régénération des T CD8+, mais inefficace pour les T CD4+. L’interleukine-7 (IL7) est une cytokine homéostatique utilisée afin d’augmenter les comptes lymphocytaires T des patients lymphopéniques. Toutefois, la raison de l’expansion préférentielle des lymphocytes T CD8+ par l’IL7 demeure toujours inconnue. Nous montrons que cette expansion est due au fait que l’IL7 induit une prolifération efficace des T CD8+ périphériques (CD8+PERI) ainsi que des émigrants thymiques CD8+ (CD8+RTEs). Par contre, l’effet prolifératif de l’IL7 est restreint presqu’uniquement aux CD4+RTEs même si les CD4+PERI survivent mieux que les CD4+RTEs. De plus faibles doses d’IL7 sont nécessaires aux CD4+RTEs afin de phosphoryler STAT5 ou de proliférer comparativement aux CD4+PERI et nous démontrons que les contacts TCR/CMHII sont nécessaires à la prolifération induite par l’IL7 des CD4+RTEs en périphérie. De fait, augmenter au Flt3 ligand le nombre de cellules dendritiques périphériques d’une souris donneuse, avant de transférer ses TPERI dans des souris receveuses traitées à l’IL7 induit une prolifération significative des CD4+PERI. Nos résultats indiquent donc que l’abondance des contacts TCR/CMHII reçus dans le thymus semble contrôler la sensibilité à l’IL7 des CD4+RTEs. Finalement, l’observation que les CD8+PERI et CD8+RTEs prolifèrent pareillement pendant la thérapie à l’IL7, alors que la prolifération des T CD4+ est largement restreinte aux RTEs expliquerait pourquoi, dans les cas de lymphopénie, la régénération des T CD4+ est aussi dépendante de la thymopoïèse.

Étude des fonctions immunomodulatrices des lymphocytes T « Doubles-Négatifs »

La réaction du greffon contre l’hôte (GvH) est responsable d’un grand taux de morbidité et de mortalité chez les patients recevant des greffes de cellules souches (GCSH) allogéniques. Dans ce contexte, les cellules T régulatrices sont largement étudiées et semblent avoir un grand potentiel d’utilisation dans le domaine de la thérapie cellulaire de la GvH. Parmi les populations cellulaires T régulatrices, les lymphocytes T CD4-CD8- TCRαβ+ « Doubles-Négatifs » (DN), qui ne représentent que 1-3% des lymphocytes T, ont été décrits. Ces cellules ont des propriétés inhibitrices de la réponse immunitaire qui s’avèrent spécifiques aux antigènes auxquels elles ont préalablement été exposées. La répression de la réponse immunitaire par les cellules T DN régulatrices semble être un mécanisme important impliqué dans l’induction de la tolérance aux allo-antigènes. De plus, ces cellules confèrent une tolérance immunitaire dans des modèles de greffes allogéniques et xénogéniques. En effet, ces cellules ont la capacité d’inhiber la réaction contre un allo-antigène auquel elles ont été exposées, sans inhiber la réaction contre un allo-antigène inconnu. Les cellules T DN ont été isolées et caractérisées chez l’homme où elles ont la capacité d’interagir avec des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) par un contact cellulaire, comme chez la souris. Cependant, leur capacité immunomodulatrice reste inconnue chez l’humain. Notre objectif consistait donc principalement à étudier le rôle et le mécanisme d’action des cellules T DN régulatrices humaines in vitro, en étudiant leur capacité à inhiber une réaction lymphocytaire mixte (MLR). Nous avons montré que les cellules T DN stimulées par un allo-antigène donné inhibent des cellules syngéniques effectrices dirigées contre ce même alloantigène mais n’inhibent pas des cellules syngéniques effectrices dirigées contre un autre alloantigène, démontrant ainsi la spécificité aux antigènes de ces cellules. De plus, les T DN non stimulées par un allo-antigène n’ont pas de rôle inhibiteur. Cependant, durant cette inhibition, nous n’observons pas de modulation de l’expression des marqueurs d’activation et d’induction de l’apoptose. Afin d’étudier le mécanisme d’action des cellules T DN, nous avons mesuré l’expression intracellulaire de la granzyme B. Les résultats démontrent que les cellules T DN stimulées expriment un niveau significativement plus élevé de granzyme B que les cellules T DN non-stimulées par l’allo-antigène. Ceci suggère que l’immunosuppression induite par les cellules T DN stimulées pourrait passer par la voie granzyme B. Le mécanisme utilisé par ces cellules reste à être confirmé par nos futures expériences.

Étude de la fonction et de la régulation homéostatique des lymphocytes T extrathymiques

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude d'une population de lymphocytes T associée à la résistance au diabète auto-immun

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.

Étude des cellules dendritiques chez les patients qui ont subi une greffe de cellules souches allogéniques

La vigueur de la réponse immunitaire générée par les cellules dendritiques (DC) a positionné ces cellules comme médiatrices centrales dans l’activation des lymphocytes T. La vulnérabilité des cellules cancéreuses de leucémie myéloïde chronique (LMC) à l’intervention immunitaire résulte apparemment de la capacité des cellules leucémiques de se différencier en DC. Ces DC ont alors la capacité de présenter des peptides provenant des cellules souches leucémiques aux lymphocytes T. Dans ce travail, nous démontrons que la plupart des patients atteints d’une LMC présentent un déficit important en DC au niveau du sang et de la moelle osseuse avant la greffe de cellules souches allogéniques. Les faibles niveaux de DC circulantes résultent en grande partie d’une perte de la diversité au niveau des cellules progénitrices CD34+ leucémiques au niveau de la moelle osseuse. Ces cellules progénitrices CD34+ présentent d’ailleurs une capacité réduite à se différencier en DC in vitro. Nous avons trouvé qu’un décompte faible de DC avant une greffe allogénique était associé à une diminution significative de la survie et une augmentation considérable du risque de développer une des complications mortelles. Puisque la reconstitution des DC suite à la greffe est absente, notre étude appuie aussi la thèse que ce sont les cellules DC pré greffe qui sont primordiales dans l'effet du greffon contre leucémie (GVL). Dans ce contexte, notre étude suggère que le compte des DC avant la greffe allogénique pourrait servir de marqueur pronostique pour identifier les patients LMC à risque de développer certaines complications suite à une greffe allogénique.

L'expression de la protéine de l'hémochromatose HFE est modulée par les lymphocytes T activés et inhibe la présentation antigénique par MHC I

La présentation antigénique par le complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) I est un processus ubiquitaire permettant la présentation de protéines endogènes qui reflètent l'état de la cellule à la surface cellulaire aux lymphocytes T CD8+ dans le contexte de la surveillance et la réponse immunitaires. Ainsi, l'expression des molécules du MHC I classiques est induite en réponse aux stimuli inflammatoires afin de favoriser la reconnaissance immunitaire et l'élimination des pathogènes. HFE est une molécule du MHC Ib non-classique qui sert de régulateur négatif de l'absorption du fer. HFE est associé au développement de l'hémochromatose héréditaire (HH), maladie associée au métabolisme du fer mais souvent accompagnée de défauts immunitaires. Ainsi, nous avons en premier lieu étudié l'impact de HFE sur la présentation antigénique par MHC I, afin d'expliquer en partie les défauts immunitaires liés à l'HH associée à HFEC282Y. Puis, compte tenu de l'impact de l'inflammation sur l'expression des molécules du MHC I classiques, nous avons étudié la régulation de l'expression de HFE en réponse aux stimuli inflammatoires induits par les cellules du sang périphérique mononucléées (PBMC). Nous avons mis au point un système d’expression antigénique dans lequel nous contrôlons l’expression de MHC I, de HFE et d’un antigène pour lequel nous avons généré des lymphocytes T CD8+ spécifiques. Nos résultats démontrent que la forme sauvage de HFE (HFEWT), contrairement à sa forme mutée (HFEC282Y), inhibe la reconnaissance de complexes MHC I/peptide (pMHC). Nous avons également démontré que l'inhibition de la reconnaissance est maintenue, indépendamment des niveaux d'expression de MHC I à la surface, d'une compétition pour la β2-microglobuline, de la capacité de HFE d'interagir avec le récepteur de la transferrine, de l'origine de l'antigène ou de l'affinité de celui-ci. Par ailleurs, nous avons identifié les domaines α1-2 de HFEWT comme étant responsables de l'inhibition de la reconnaissance antigénique. Par contre, la reconnaissance de peptides chargés de manière externe sur les molécules du MHC I présentes à la surface n'a démontré aucune inhibition en présence de HFEWT, suggérant que HFEWT pourrait affecter la reconnaissance en interférant avec le processus d'apprêtement antigénique intracellulaire. À l’inverse, nous avons souhaité déterminer si les lymphocytes T activés pouvaient influencer les niveaux d'expression de HFE. En termes de régulation de l'expression de HFE, nous avons établi que HFE est exprimé dans les tissus sains chez l'humain et induit chez les lignées de cancers du colon, du sein, du poumon, du rein et du mélanome. Par ailleurs, en co-cultivant des lymphocytes T activés avec ces lignées tumorales, nous avons démontré que l'expression de HFE est fortement inhibée dans toutes ces lignées tumorales lorsqu'exposées à des lymphocytes T activés. Finalement, la modulation de l'expression de HFE est indépendante du contact cellulaire et semble médiée en partie par le GM-CSF, l'IFN-γ et le TNF. En somme, ces résultats suggèrent que les lymphocytes T de l'hôte modulent l'expression de HFE dans le microenvironnement inflammatoire, ce qui pourrait promouvoir la reconnaissance des antigènes présentés sur les molécules du MHC I présentées aux lymphocytes T CD8+ antigène-spécifiques. De plus, ces études soulèvent la possibilité d'un nouveau rôle physiologique de HFEWT dans la voie de présentation antigénique par MHC I, qui pourrait moduler l'immunogénicité des antigènes et la réponse immunitaire cellulaire chez l'hôte.

Étude de l’expression de la molécule d’adhérence CD146 dans les lymphocytes T

Les tumeurs solides sont infiltrées par des cellules immunes (TIIC) dont la nature, la fonction et la composition varient d’un patient à l'autre. Ces cellules inflammatoires influencent l'invasion tumorale en contrôlant la croissance et le potentiel métastatique d’une tumeur. Ainsi, il est proposé d’utiliser cette infiltration comme outil diagnostic et pronostic de routine. Certaines cellules sont bien connues pour jouer un rôle important dans le contrôle de la progression tumorale, comme c’est le cas des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ alors que d’autres possèdent un rôle contradictoire. Étant donné la dépendance des tumeurs sur l’équilibre entre ces différentes cellules, il est important d’identifier les fonctions précises des cellules immunes au sein de la tumeur. De nombreuses études sont réalisées afin d’identifier des marqueurs descriptifs du phénotype et la fonction des cellules immunes dans la tumeur. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- Identifier la méthode de désagrégation des tissus tumoraux altérant le moins la biologie des TIIC pour leur caractérisation. 2- Caractériser l’expression de la molécule d’adhérence CD146 dans les TIIC et en identifier l’origine. L’identification de marqueurs pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des TIIC a été réalisée, entre autres, par la détection de protéines exprimées par la cellule. Dans la première partie de ce projet, nous avons démontré que les méthodes utilisées pour désagréger les tissus tumoraux dans le but d’isoler les TIIC induisent des changements dans la biologie de ces cellules ce qui peut fausser les conclusions qui en dérivent. Nous avons donc comparé l'impact de trois méthodes de désagrégation : une dissociation mécanique utilisant la MédimachineTM et deux digestions enzymatiques utilisant une collagénase de type I seule ou combinée à de la collagénase de type IV et de la DNase I de type II. Nous nous sommes intéressés à l'effet de ces méthodes sur des paramètres tels que la viabilité cellulaire, l’altération des protéines de surface et la capacité des cellules à proliférer. Nous avons démontré que ces méthodes affectent la viabilité des cellules de manière comparable, alors que la détection de certaines protéines de surface et la capacité de proliférer est réduite/inhibée par les traitements enzymatiques. Nous concluons qu’une méthode mécanique utilisant la MédimachineTM est mieux adaptée à la caractérisation des TIIC afin de conserver leurs propriétés. Dans la deuxième partie de notre projet, nous avons adapté cette méthode à la caractérisation des TIIC. Nous avons porté une attention particulière à la molécule d’adhérence CD146 dont l’implication dans la migration des cellules immunes à travers l’endothélium vers les sites d’inflammation est de plus en plus étudiée dans les maladies autoimmunes. Nous avons mis en évidence une augmentation des proportions de cellules immunes exprimant CD146 dans les tumeurs comparativement au sang de patients de cancers. Cette expression est induite par les cellules tumorales tout en étant accrue par la nécrose de celles-ci. Nous démontrons que ces cellules sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ présentant un profil immunosuppressif. En conclusion, nos résultats suggèrent que CD146 participe à la mise en place du contexte immunitaire dans la tumeur et augmente la capacité de migration des lymphocytes T CD4+. L’induction par les cellules tumorales de cette molécule d’adhérence dans les cellules suppressives pourrait contribuer aux mécanismes immunorégulateurs mis en place par la tumeur. CD146 pourrait être un marqueur d’intérêt pour l’identification des cellules immunosuppressives et pour le développement de nouvelles thérapies.

Rôle de la tolérance centrale et périphérique des lymphocytes T autoréactifs dans deux nouveaux modèles murins double transgéniques

Les maladies autoimmunes sont des affections chroniques, le plus souvent invalidantes, qui touchent plus de 5% de la population dans les pays développés. L’autoimmunité résulte de la rupture des mécanismes de tolérance du système immunitaire vis-à-vis des autoantigènes exprimés par les tissus de l’organisme, entraînant la destruction d’un ou de plusieurs organes-cibles par les lymphocytes T et/ou B. L’hépatite autoimmune et le diabète autoimmun se caractérisent par la destruction sélective des hépatocytes et des cellules beta pancréatiques, respectivement. De plus en plus d’arguments suggèrent une implication des lymphocytes T CD8+ dans le déclenchement, la progression et la régulation des réponses associées à plusieurs maladies autoimmunes. Dans ce projet, nous avons suivi l’évolution de clones de lymphocytes T CD8+ spécifiques à un antigène particulier dont le site d’expression différait. Pour ce faire, nous avons développé deux nouveaux modèles murins double transgéniques par croisement entre une lignée de souris exprimant un TCR transgénique spécifique à la nucléoprotéine (NP) du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), et une souris exprimant cette NP-LCMV : 1) uniquement dans les hépatocytes (modèle d’hépatite autoimmune), ou 2) simultanément dans le thymus et le pancréas (modèle de diabète autoimmun). L’avidité fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP chez les souris TCR transgéniques était inversement proportionnelle au niveau d’expression du TCR. Le répertoire lymphocytaire dans le thymus, la rate, les ganglions et le sang périphérique a été caractérisé pour chacune des lignées de souris double transgéniques, de même que la capacité fonctionnelle et le phénotype (marqueurs d’activation/mémoire) des lymphocytes T CD8+ autoréactifs. Chacun des deux nouveaux modèles présentés dans cette étude ont montré que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP sont aptes à briser la tolérance centrale et périphérique et à provoquer une réaction d’autoimmunité spontanée. Dans le modèle d’hépatite autoimmune, où l’expression de l’autoantigène était restreinte au foie, la surexpression du TCR transgénique a entraîné une délétion thymique quasi-totale des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP prévenant le développement d’une hépatite spontanée. alors qu’un niveau de TCR comparable à celui d’une souris de type sauvage a permis une sélection positive des lymphocytes autoréactifs qui se sont accumulés dans le foie où ils se sont activés pour provoquer une hépatite autoimmune spontanée. Dans le modèle de diabète autoimmun, où l’autoantigène était exprimé dans le pancréas et le thymus, les souris des deux lignées double transgéniques ont montré une délétion thymique partielle, peu importe le niveau d’expression du TCR. Seuls les mâles adultes développaient un diabète spontané et une partie de leurs lymphocytes T CD8+ exprimaient une combinaison particulière de marqueurs d’activation/mémoire (CD44, CD122, PD-1). Cette population lymphocytaire était absente chez les souris femelles et les mâles sains. L’étude de la tolérance des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans nos deux nouveaux modèles murins double transgéniques a permis d’identifier des mécanismes alternatifs possiblement impliqués dans la tolérance et l’activation, et de mieux comprendre le rôle des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans le processus autoimmun menant à l’hépatite autoimmune et au diabète autoimmun. Ces découvertes seront utiles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les lymphocytes T CD8+ autoréactifs.

Étude de la différenciation des lymphocytes T CD8+ effecteurs et mémoires : rôle de la cellule présentatrice d’antigène et de la voie de signalisation Notch

Lors d’une infection par un pathogène, des lymphocytes T CD8+ naïfs (LTn) spécifiques de l’antigène sont activés, prolifèrent et se différencient en LT effecteurs (LTe). Les LTe produisent différentes cytokines et acquièrent une activité cytotoxique menant à l’élimination du pathogène. Seulement 5 à 10 % des LTe survivront et se différencieront en LT mémoires (LTm), qui sont capables de répondre plus rapidement lors d’une seconde infection par le même pathogène, contribuant au succès de la vaccination. Toutefois, la compréhension de l’ensemble des mécanismes régulant le développement des LTe et des LTm demeure incomplète. Afin de mieux comprendre les signaux requis pour la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immune, nous avons posé deux hypothèses. Nous avons d’abord proposé que différentes cellules présentatrices d’antigène (CPA) fournissent différents signaux au moment de la reconnaissance antigénique influençant ainsi le devenir des LT CD8+. Vu leur potentiel d’utilisation en immunothérapie, nous avons comparé la capacité d’activation des LT CD8+ par les lymphocytes B activés via le CD40 (CD40-B) et les cellules dendritiques (CD). Nous avons montré que l’immunisation avec des CD40-B induit une réponse effectrice mais, contrairement à l’immunisation avec des CD, pratiquement aucun LTm n’est généré. Les LTe générés sont fonctionnels puisqu’ils sécrètent des cytokines, ont une activité cytotoxique et contrôlent une infection avec Listeria monocytogenes (Lm). Nous proposons qu’une sécrétion plus faible de cytokines par les CD40 B ainsi qu’une interaction plus courte et moins intime avec les LT CD8+ comparativement aux CD contribuent au défaut de différenciation des LTm observé lors de la vaccination avec les CD40-B. Ensuite, nous posé l’hypothèse que, parmi les signaux fournis par les CPA au moment de la reconnaissance antigénique, la voie de signalisation Notch influence le développement des LTe, mais aussi des LTm CD8+ en instaurant un programme génétique particulier. D’abord, grâce à un système in vitro, le rôle de la signalisation Notch dans les moments précoces suivant l’activation du LT CD8+ a été étudié. Ce système nous a permis de démontrer que la voie de signalisation Notch régule directement l’expression de la molécule PD-1. Ensuite, grâce à des souris où il y a délétion des récepteurs Notch1 et Notch2 seulement chez les LT CD8+ matures, un rôle de la voie de signalisation Notch dans la réponse immune des LT CD8+ a été démontré. Nos résultats démontrent que suite à une infection avec Lm ou à une immunisation avec des CD, la signalisation Notch favorise le développement de LTe, exprimant fortement KLRG1 et faiblement CD127, destinés à mourir par apoptose. Toutefois, la signalisation Notch n’a pas influencé la génération de LTm. De façon très intéressante, l’expression des récepteurs Notch influence la production d’IFN- en fonction du contexte d’activation. En effet, suite à une infection avec Lm, l’absence des récepteurs Notch n’affecte pas la production d’IFN- par les LTe, alors qu’elle est diminuée suite à une immunisation avec des CD suggérant un rôle dépendant du contexte pour la voie de signalisation Notch. Nos résultats permettent une meilleure compréhension des signaux fournis par les différentes CPA et de la voie de signalisation Notch, donc des mécanismes moléculaires régulant la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immunitaire, ce qui pourrait ultimement permettre d’améliorer les stratégies de vaccination.

Impact du stress sur la survie des lymphocytes T CD8+ mémoires dans le contexte des missions spatiales.

La mémoire immunitaire permet à l’organisme de se souvenir de tous les agents pathogènes rencontrés afin de pouvoir monter une réponse immunitaire plus rapide et plus efficace en cas de réinfection. Après la phase de contraction de la réponse primaire, les lymphocytes T CD8 mémoires survivent grâce à la présence de cytokines telle que l’interleukine 15 (IL-15). Ces cellules permettent aussi au système immunitaire de contrôler les virus latents n’ayant pas été totalement éliminés de l’hôte. Les situations de stress chronique affectent le système immunitaire provoquant la réactivation des virus latents. Des titres viraux élevés de virus de la famille Herspeviridea ont été observés chez les astronautes à leur retour de mission, suggérant que les hormones libérées en situation de stress auraient un impact négatif sur les lymphocytes T CD8+ mémoires. Un modèle de stress chronique in vitro chez la souris a été élaboré en ajoutant de la corticostérone à des lymphocytes T CD8+ mémoires. Il a ainsi été démontré que l’hormone de stress avait un effet pro-apoptotique sur ces cellules et que cet effet était partiellement inhibé par l’IL-15. Des cibles moléculaires ont aussi été identifiées afin de suivre la fonction immunitaire mémoire lors des vols spatiaux à l’aide du cytomètre en flux Microflow1, une nouvelle plateforme portative de diagnostic biomédical. Les résultats des tests en laboratoire puis dans la Station Spatiale Internationale (SSI) démontrent qu’il sera possible de suivre la fonction immunitaire mémoire et les marqueurs de stress en temps réel lors des vols spatiaux.

Rôle des cellules dendritiques dans la modulation de la réponse immunitaire de l'hôte contre Streptococcus suis

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et agent zoonotique responsable de méningites et de septicémies. À ce jour, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis sont peu connus; et il en est de même pour les stratégies utilisées par S. suis afin de déjouer cette réponse. L’augmentation de l’incidence et de la sévérité des cas humains souligne le besoin d’une meilleure compréhension des interactions entre S. suis et le système immunitaire afin de générer une réponse immunitaire efficace contre ce pathogène. Les cellules dendritiques (DCs) sont de puissantes cellules présentatrices d’antigènes qui stimulent les lymphocytes T et B, assurant la liaison entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’objectif principal de ce projet était d’évaluer le rôle joué par différents facteurs de virulence de S. suis sur la modulation de la fonction des DCs et de la réponse T-dépendante. Nous avons examiné l’effet des facteurs clés pour la virulence de S. suis, dont la capsule polysaccharidique (CPS), les modifications de la paroi cellulaire (D-alanylation de l’acide lipotéichoïque et N-déacétylation du peptidoglycane) et la toxine suilysine, sur l’activation et la maturation de DCs murines dérivées de la moelle osseuse (bmDCs). Suite à l’infection par S. suis, les bmDCs sont activées et subissent un processus de maturation caractérisé par l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation et la production de cytokines pro-inflammatoires. La CPS est le principal facteur interférant avec la production de cytokines, même si les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine peuvent également moduler la production de certaines cytokines. Enfin, la CPS, les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine interfèrent avec la déposition du complément à la surface des bactéries et, en conséquence, avec le « killing » dépendant du complément. Les résultats ont été confirmés à l’aide de bmDCs porcines. Nous avons aussi voulu identifier les récepteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance de S. suis par les DCs. Nous avons démontré que la production de cytokines et l’expression des molécules de co-stimulation par les DCs sont fortement dépendantes de la signalisation par MyD88, suggérant que les DCs reconnaissent S. suis et deviennent activées majoritairement via la signalisation par les récepteurs de type Toll (TLRs). En effet, on remarque une diminution de la production de plusieurs cytokines ainsi que de l’expression de certaines molécules de co-stimulation chez les DCs TLR2-/- ou TLR2-/- et TLR9-/- double négatives. Finalement, le récepteur NOD2 semblait jouer un rôle partiel dans l’activation des DCs suite à une infection par S. suis.Enfin, nous avons évalué les conséquences de la modulation des fonctions des DCs sur le développement de la réponse T-dépendante. Les splénocytes totaux produisent plusieurs cytokines en réponse à S. suis. Des analyses in vivo et ex vivo ont permis d’observer l’implication des cellules T CD4+ et le développement d’une réponse de type « T helper » 1 (TH1) bien que la quantité de cytokines TH1 produites lors de l’infection in vivo par S. suis demeure assez basse. La CPS de S. suis interfère avec la production de plusieurs cytokines par les cellules T in vitro. Expérimentalement, l’infection induite par S. suis résulte en de faibles niveaux de production d’anticorps anti-S. suis, mais aussi d’anticorps dirigés contre l’ovalbumine utilisée comme antigène rapporteur. Cette interférence est corrélée avec la sévérité des signes cliniques, suggérant que S. suis interfère avec le développement d’une réponse immunitaire adaptative appropriée qui serait requise pour contrôler la progression de l’infection. Les résultats de cette étude mèneront à une meilleure compréhension de la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis.

Étude de la migration des populations de lymphocytes B du sang de patients infectés par le virus d’immunodéficience humaine (VIH)

La dérégulation du compartiment de cellules B est une conséquence importante de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1). On observe notamment une diminution des nombres de lymphocytes B sanguins ainsi qu’une variation des fréquences relatives des différentes populations de lymphocytes B chez les individus infectés par rapport aux contrôles sains. Notre laboratoire a précédemment démontré l’implication des cellules dendritiques dans la dérégulation des lymphocytes B via la roduction excessive de BLyS/BAFF, un stimulateur des cellules B. De plus, lors l’études menées chez la souris transgénique présentant une maladie semblable au SIDA, et chez la souris BLyS/BAFF transgénique, l’infection au VIH-1 fut associée à une expansion de la zone marginale (MZ) de la rate. De façon intéressante, nous observons chez les contrôleurs élites une diminution de la population B ‘mature’ de la MZ. Il s’agit du seul changement important chez les contrôleurs élites et reflète possiblement un recrutement de ces cellules vers la périphérie ainsi qu’une implication dans des mécanismes de contrôle de l’infection. Pour tenter d’expliquer et de mieux comprendre ces variations dans les fréquences des populations B, nous avons analysé les axes chimiotactiques CXCL13-CXCR5, CXCL12-CXCR4/CXCR7, CCL20-CCR6 et CCL25-CCR9. L’étude longitudinale de cohortes de patients avec différents types de progression clinique ou de contrôle de l’infection démontre une modulation des niveaux plasmatiques de la majorité des chimiokines analysées chez les progresseurs rapides et classiques. Au contraire, les contrôleurs élites conservent des niveaux normaux de chimiokines, démontrant leur capacité à maintenir l’homéostasie. La migration des populations de cellules B semble être modulée selon la progression ou le contrôle de l’infection. Les contrôleurs élites présentent une diminution de la population B ‘mature’ de la MZ et une augmentation de la fréquence d’expression du récepteur CXCR7 associé à la MZ chez la souris, suggérant un rôle important des cellules de la MZ dans le contrôle de l’infection au VIH-1. De façon générale, les résultats dans cette étude viennent enrichir nos connaissances du compartiment de cellules B dans le contexte de l’infection au VIH-1 et pourront contribuer à élaborer des stratégies préventives et thérapeutiques contre ce virus.

Caractérisation des lymphocytes T CD4+CD8+ dans le contexte de la sclérose en plaques

Une petite population de lymphocytes T exprimant les deux corécepteurs CD4 et CD8 et appelée double positive (DP), a été détectée dans le sang périphérique de donneurs sains et de patients atteints de diverses pathologies dont la sclérose en plaques (SEP). Nous avons émis l’hypothèse qu’il s’agissait de lymphocytes T hautement activés pouvant contribuer à l’inflammation chronique présente dans la SEP. Nous avons comparé les cellules T DP obtenues du sang de donneurs sains et de patients atteints de la SEP et non traités. La fréquence des cellules DP était similaire chez les patients et les donneurs sains. La proportion de lymphocytes T DP qui exprimaient les chaines du récepteur de l’interleukine-15 (IL-15) était plus élevée que pour les autres populations lymphocytaires. Des mesures d’induction de la phosphorylation du STAT5 (signal transducer and activator of transcription) ont démontré que les cellules DP ont répondu à des doses plus faibles et pour de plus longues périodes à l’IL-15 comparativement aux autres lymphocytes T. Le pourcentage de lymphocytes T DP ayant la capacité de produire l’interféron-gamma et des enzymes lytiques était élevé chez les témoins sains mais ces niveaux étaient significativement réduits chez les patients atteints de la SEP. La caractérisation phénotypique de cellules DP a suggéré que ces cellules ont des propriétés similaires aux lymphocytes T activés. Bien qu’il ne s’agisse que d’une caractérisation partielle, il semble que les lymphocytes T DP perdent une partie de leurs propriétés chez les patients atteints de la SEP.