Beneficial effects of Ginkgo biloba extract on insulin signaling cascade, dyslipidemia, and body adiposity of diet-induced obese rats

Ginkgo biloba extract (GbE) has been indicated as an efficient medicine for the treatment of diabetes mellitus type 2. It remains unclear if its effects are due to an improvement of the insulin signaling cascade, especially in obese subjects. The aim of the present study was to evaluate the effect of GbE on insulin tolerance, food intake, body adiposity, lipid profile, fasting insulin, and muscle levels of insulin receptor substrate 1 (IRS-1), protein tyrosine phosphatase 1B (PTP-1B), and protein kinase B (Akt), as well as Akt phosphorylation, in diet-induced obese rats. Rats were fed with a high-fat diet (HFD) or a normal fat diet (NFD) for 8 weeks. After that, the HFD group was divided into two groups: rats gavaged with a saline vehicle (HFD+V), and rats gavaged with 500 mg/kg of GbE diluted in the saline vehicle (HFD+Gb). NFD rats were gavaged with the saline vehicle only. At the end of the treatment, the rats were anesthetized, insulin was injected into the portal vein, and after 90s, the gastrocnemius muscle was removed. The quantification of IRS-1, Akt, and Akt phosphorylation was performed using Western blotting. Serum levels of fasting insulin and glucose, triacylglycerols and total cholesterol, and LDL and HDL fractions were measured. An insulin tolerance test was also performed. Ingestion of a hyperlipidic diet promoted loss of insulin sensitivity and also resulted in a significant increase in body adiposity, plasma triacylglycerol, and glucose levels. In addition, GbE treatment significantly reduced food intake and body adiposity while it protected against hyperglycemia and dyslipidemia in diet-induced obesity rats. It also enhanced insulin sensitivity in comparison to HFD+V rats, while it restored insulin-induced Akt phosphorylation, increased IRS-1, and reduced PTP-1B levels in gastrocnemius muscle. The present findings suggest that G. biloba might be efficient in preventing and treating obesity-induced insulin signaling impairment.

Rat visceral yolk sac cells: viability and expression of cell markers during maternal diabetes

The function of the visceral yolk sac (VYS) is critical for embryo organogenesis until final fetal development in rats, and can be affected by conditions such as diabetes. In view of the importance of diabetes during pregnancy for maternal and neonatal health, the objective of this study was to assess fetal weight, VYS cell markers, and viability in female Wistar rats (200-250 g) with induced diabetes (alloxan, 37 mg/kg) on the 8th gestational day (gd 8). At gd 15, rats from control (n=5) and diabetic (n=5) groups were anesthetized and laparotomized to remove the uterine horns for weighing of fetuses and collecting the VYS. Flow cytometry was used for characterizing VYS cells, and for determining mitochondrial activity, cell proliferation, DNA ploidy, cell cycle phases, and caspase-3 activity. Fetal weight was reduced in the diabetic group. Expression of the cell markers CD34, VEGFR1, CD115, CD117, CD14, CCR2, CD90, CD44, STRO-1, OCT3/4, and Nanog was detected in VYS cells in both groups. In the diabetic group, significantly decreased expression of CD34 (P<0.05), CCR2 (P<0.001), and OCT3/4 (P<0.01), and significantly increased expression of CD90 (P<0.05), CD117 (P<0.01), and CD14 (P<0.05) were observed. VYS cells with inactive mitochondria, activated caspase-3, and low proliferation were present in the rats with diabetes. Severe hyperglycemia caused by maternal diabetes had negative effects on pregnancy, VYS cell viability, and the expression of cell markers.

Combined treatment with caffeic and ferulic acid from Baccharis uncinella C. DC. (Asteraceae) protects against metabolic syndrome in mice

Fractionation of the EtOH extract from aerial parts of Baccharis uncinella C. DC. (Asteraceae) led to isolation of caffeic and ferulic acids, which were identified from spectroscopic and spectrometric evidence. These compounds exhibit antioxidant and anti-inflammatory properties and have been shown to be effective in the prevention/treatment of metabolic syndrome. This study investigated whether the combined treatment of caffeic and ferulic acids exhibits a more significant beneficial effect in a mouse model with metabolic syndrome. The combination treatment with caffeic and ferulic acids was tested for 60 days in C57 mice kept on a high-fat (40%) diet. The data obtained indicated that treatment with caffeic and ferulic acids prevented gain in body weight induced by the high-fat diet and improved hyperglycemia, hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia. The expression of a number of metabolically relevant genes was affected in the liver of these animals, showing that caffeic and ferulic acid treatment results in increased cholesterol uptake and reduced hepatic triglyceride synthesis in the liver, which is a likely explanation for the prevention of hepatic steatosis. In conclusion, the combined treatment of caffeic and ferulic acids displayed major positive effects towards prevention of multiple aspects of the metabolic syndrome and liver steatosis in an obese mouse model.

Effects of different concentrations of passion fruit peel (Passiflora edulis) on the glicemic control in diabetic rat

Diabetes mellitus, an endocrine disorder, is the major cause of morbidity in developing countries, and it is considered the fourth leading cause of death worldwide. The conventional therapy for diabetes is insulin treatment. The peel of the Passion fruit is rich in fiber and prevents the absorption of carbohydrates, and thus can control and reduce the blood sugar rate. The objective of this study was to analyze the effect of the passion fruit peel flour on the glicemia of diabetic rats, as well as to study the probable action mechanisms. Wistar rats were used in the experiment and were offered the flours of the passion fruit peel in three concentrations: 5, 10, and 15%, and a casein diet as control. The most significant effect on the reduction of the glicemic rate was obtained with the 5% diet. The best values of hepatic glycogen were found in the 5 and 10% diets. The results of this study suggest that the 5% passion fruit flour diet was the one that provided the best reduction of blood glucose levels (59%) and the higher increase of the hepatic glycogen level (71%). The conversion of blood glucose into hepatic glycogen was considered the probable action mechanism involved.

Inhibition of renal glucose reabsorption as a novel treatment for diabetes patients

The importance of the kidney in glucose homeostasis has been recognized for many years. Recent observations indicating a greater role of renal glucose metabolism in various physiologic and pathologic conditions have rekindled the interest in renal glucose handling as a potential target for the treatment of diabetes. The enormous capacity of the proximal tubular cells to reabsorb the filtered glucose load entirely, utilizing the sodium-glucose co-transporter system (primarily SGLT-2), became the focus of attention. Original studies conducted in experimental animals with the nonspecific SGLT inhibitor phlorizin showed that hyperglycemia after pancreatectomy decreased as a result of forced glycosuria. Subsequently, several compounds with more selective SGLT-2 inhibition properties (“second-generation”) were developed. Some agents made it into pre-clinical and clinical trials and a few have already been approved for commercial use in the treatment of type 2 diabetes. In general, a 6-month period of therapy with SGLT-2 inhibitors is followed by a mean urinary glucose excretion rate of ~80 g/day accompanied by a decline in fasting and postprandial glucose with average decreases in HgA1C ~1.0%. Concomitant body weight loss and a mild but consistent drop in blood pressure also have been reported. In contrast, transient polyuria, thirst with dehydration and occasional hypotension have been described early in the treatment. In addition, a significant increase in the occurrence of uro-genital infections, particularly in women has been documented with the use of SGLT-2 inhibitors. Conclusion: Although long-term cardiovascular, renal and bone/mineral effects are unknown SGLT-2 inhibitors, if used with caution and in the proper patient provide a unique insulin-independent therapeutic option in the management of obese type 2 diabetes patients.

The role of extracellular matrix macromolecules in cancer and diabetic macroangiopathy – with special reference to decorin and hyaluronan

The central role of extracellular matrix (ECM) macromolecules in diseases such as cancer and atherosclerotic vascular diseases including diabetic macroangiopathy is indisputable. Decorin and hyaluronan (HA) represent vital ECM macromolecules in the microenvironment of cells and are centrally involved in human cancer and cardiovascular biology. In cancer, decorin is considered to play a tumor suppressive role. However, there is some discrepancy whether malignant cells express it. Regarding HA, its contribution to the development of atherosclerotic vascular diseases has been well established. Nevertheless, the precise role of HA in arterial narrowing associated with diabetes is not known. The present study focused on two vital ECM macromolecules, namely decorin and HA. First, decorin expression was studied in human tumorigenesis. Furthermore, the effect of adenovirus-mediated decorin transduction on selected cancer cell lines was investigated. The results invariably showed that cancer cells completely lacked decorin expression. The study also demonstrated that transducing cancer cells with decorin adenoviral vector markedly inhibited their malignant behavior. In line with this, a strong induction of decorin expression in normal human embryonic stem cells (hESCs), but not in abnormal hESCs was observed during their differentiation. Secondly, the significance of HA in the development of diabetic macroangiopathy in response to hyperglycemia was evaluated. Results showed that the synthesis of HA by vascular smooth muscle cells was significantly increased in response to high glucose concentration. This increase was associated with the diminished ability of the cells to contract collagen-rich matrix suggesting that HA participates in the disturbed vascular remodeling of diabetic patients. The results of this study support endeavours to develop novel ECM macromolecule -based therapies targeting cancer and cardiovascular diseases.

Effects of intracerebroventricular bombesin administration on local cerebral glucose utilization in the restrained and unrestrained rat

Intracerebroventricular (ICV) administration of bombesin (BN) induces a syndrome characterized by stereotypic locomotion and grooming, hyperactivity and sleep elimination, hyperglycemia and hypothermia, hyperhemodynamics, feeding inhibition, and gastrointestinal function changes. Mammalian BN-like peptides (MBNs), e.g. gastrin-releasing peptide (GRP), Neuromedin C (NMC), and Neuromedin B (NMB), have been detected in the central nervous system. Radio-labeled BN binds to specific sites in discrete cerebral regions. Two specific BN receptor subtypes (GRP receptor and NMB receptor) have been identified in numerous brain regions. The quantitative 2-[14C]deoxyglucose ([14C]20G) autoradiographic method was used to map local cerebral glucose utilization (LCGU) in the rat brain following ICV injection of BN (vehicle, BN O.1Jlg, O.5Jlg). At each dose, experiments were conducted in freely moving or restrained conditions to determine whether alterations in cerebral function were the result of BN central administration, or were the result of BN-induced motor stereotypy. The anteroventral thalamic nucleus (AV) (p=O.029), especially its ventrolateral portion (AVVL) (p

Le récepteur B1 des kinines : cible thérapeutique pour le choc septique dans le diabète.

Les décès attribués à un choc septique à la suite d’une infection sévère augmentent chez les diabétiques et surviennent assez fréquemment dans les unités de soins intensifs. Le diabète sucré et le choc septique augmentent la production d’espèces réactives oxygénées et de cytokines pro-inflammatoires, lesquelles activent le facteur de transcription nucléaire Kappa B conduisant à l’induction du récepteur B1 (RB1) des kinines. Le diabète induit par la streptozotocine (STZ) augmente l’expression du RB1 dans divers tissus périphériques, le cerveau et la moelle épinière. Les lipopolysaccharides bactériens (LPS), souvent utilisés pour induire le choc septique, induisent aussi le RB1. L’objectif de ce travail vise à démontrer la contribution du RB1 des kinines dans l’exacerbation du choc septique pendant le diabète. Des rats Sprague-Dawley (225-250 gr) traités à la STZ (65 mg/kg, i.p.) ou le véhicule ont reçu quatre jours plus tard les LPS (2 mg/kg, i.v.) ou le véhicule en présence ou pas d’un antagoniste du RB1 (SSR240612, 10 mg/kg) administré par gavage. La température corporelle a été mesurée pendant 24h après le traitement. Le SSR240612 a aussi été administré à 9h AM et 9h PM et les rats sacrifiés à 9h AM le jour suivant après un jeûne de 16 h. Les effets de ces traitements ont été mesurés sur les taux plasmatiques d’insuline et de glucose, l’œdème et la perméabilité vasculaire (dans divers tissus avec la technique du Bleu d’Evans) ainsi que sur l’expression du RB1 (PCR en temps réel) dans le cœur et le rein. L’augmentation de la température corporelle après traitement au LPS chez les rats traités ou pas à la STZ a été bloquée par le SSR240612. L’antagoniste a normalisé l’hyperglycémie et amélioré la déficience en insuline chez les rats STZ. Le SSR240612 a inhibé l’œdème et réduit la perméabilité vasculaire dans les tissus des rats diabétiques traités ou pas avec les LPS. La surexpression du RB1 chez les rats traités au STZ et/ou LPS était renversée par le SSR240612. Cet antagoniste a prévenu la mortalité causée par les LPS et LPS plus STZ. Les effets anti-pyrétique, anti-inflammatoire et anti-diabétique du SSR240612 suggèrent que le RB1 puisse représenter une cible thérapeutique valable pour le traitement de la co-morbidité associée au choc septique dans le diabète.

Rôle du système rénine-angiotensine intrarénal dans l’hypertension et les dommages rénaux chez les souris transgéniques diabétiques

Plusieurs expériences et études cliniques ont démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) peut induire l’hypertension, un facteur de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires et rénales. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique substrat du RAS. Cependant, il n’a pas encore été démontré si l’activation du RAS intrarénal peut à elle seule induire des dommages rénaux, indépendamment de l’hypertension systémique, et ainsi jouer un rôle prépondérant dans la progression de la néphropathie diabétique. Afin d’explorer le rôle du RAS intrarénal dans les dommages rénaux, un diabète a été induit par l’injection de streptozotocin chez des souris transgéniques (Tg) surexprimant l’Agt de rat dans les cellules des tubules proximaux du rein (RPTC). Les souris Tg diabétiques ont été traitées soit avec des inhibiteurs du RAS (perindopril et losartan), de l’insuline ou une combinaison des deux pour 4 semaines avant d’être euthanasiées. Pour une autre étude, des souris Tg non-diabétiques ont été traitées soit avec des inhibiteurs du RAS, l’hydralazine (vasodilatateur) ou l’apocynine (inhibiteur de la NADPH oxydase) pour une période de 8 semaines avant l’euthanasie. Des souris non-Tg ont été utilisées comme contrôles. Des cellules immortalisées de tubule proximal de rat (IRPTC) transfectées de manière stable avec un plasmide contenant l’Agt ou un plasmide contrôle ont été employées comme modèle in vitro. Nos résultats ont démontré que les souris Tg présentaient une augmentation significative de la pression systolique, l’albuminurie, l’apoptose des RPTC et l’expression de gènes pro-apoptotiques par rapport aux souris non-Tg. Les mêmes changements ont été observés chez les souris Tg diabétiques par rapport aux souris non-Tg diabétiques. L’insuline et/ou les inhibiteurs du RAS ont permis d’atténuer ces changements, sauf l’hypertension qui n’était réduite que par les inhibiteurs du RAS. Chez les IRPTC transfectées avec l’Agt in vitro, les hautes concentrations de glucose augmentent l’apoptose et l’activité de la caspase-3 par rapport aux cellules contrôles et l’insuline et/ou les inhibiteurs du RAS empêchent ces augmentations. En plus des changements physiologiques, les RPTC des souris Tg présentent aussi une augmentation significative de la production des espèces réactive de l’oxygène (ROS) et de l’activité de la NADPH oxydase, ainsi qu’une augmentation de l’expression du facteur de croissance transformant-beta 1 (TGF-β1), de l’inhibiteur activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1), des protéines de la matrice extracellulaire, du collagène de type IV et de la sousunité p47 de la NADPH oxydase. Le traitement des souris Tg avec l’apocynine et le perindopril a permis d’améliorer tous ces changements, sauf l’hypertension qui n’était pas corrigée par l’apocynine. D’autre part, l’hydralazine a prévenu l’hypertension, sans modifier l’albuminurie, l’apoptose des RPTC ou l’expression des gènes pro-apoptotiques. Ces résultats montrent bien que l’activation du RAS intrarénal et l’hyperglycémie agissent de concert pour induire l’albuminurie et l’apoptose des RPTC, indépendamment de l’hypertension systémique. La génération des ROS via l’activation de la NADPH oxydase induit en partie l’action du RAS intrarénal sur l’apoptose des RPTC, la fibrose tubulo-interstitielle et l’albuminurie chez les souris Tg. D’autre part, une expérience en cours a tenté d’encore mieux délimiter les effets de l’activation du RAS intrarénal, tout en éliminant la néphrotoxicité du STZ. Pour cette étude, les souris Tg surexprimant l’Agt de rat dans leurs RPTC ont été croisées aux souris Ins2Akita, un modèle spontané de diabète de type I, afin de générer des souris Akita-rAgt-Tg. Les résultats préliminaires indiquent que le RAS intrarénal est activé dans les souris Akita et que la combinaison avec l’hyperglycémie induit du stress du réticulum endoplasmique (ER) dans les RPTC in vivo. Le stress du ER contribue à l’apoptose des RPTC observée dans le diabète, à tout le moins dans le modèle Akita. Le traitement avec des inhibiteurs du RAS permet d’atténuer certains des dommanges rénaux observés dans les souris Akita-rAgt-Tg.

Activités antidiabétiques et neuroprotectrices du jus de bleuet biostransformé

Le bleuet démontre un potentiel thérapeutique dans le traitement du cancer et des maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces effets bénéfiques sont attribuables aux composés phénoliques abondants dans le bleuet, tels que les anthocyanines et les flavonoïdes. La biotransformation du jus de bleuet avec les bactéries Serratia vaccinii augmente sa teneur en composés phénoliques et son activité anti-oxydante, et modifie ses activités physiologiques. L’objectif de la présente étude est d’évaluer l’activité neuroprotectrice et le potentiel antidiabétique du jus de bleuet biostranformé (BJ). Le BJ est étudié dans différents tests dont : 1) La protection des neurones (N2a) contre le stress oxydatif (SO) induit par le peroxyde d’hydrogène; 2) La stimulation de la prise de glucose par les cellules musculaires (C2C12) et adipeuses (3T3-L1); 3) L’activité anti-hyperglycémique chez les souris obèses diabétiques KKAy. En effet, tandis que le jus de bleuet normal n’a aucun effet, le BJ augmente l’activité des enzymes anti-oxydantes, comme la catalase et la SOD (Superoxide Dimutase) et protège les neurones contre les changements de la signalisation des MAPKs et contre la toxicité induite par le peroxyde d’hydrogène. Le BJ augmente aussi la prise de glucose de 48% dans les cellules C2C12 et de 142% dans les cellules 3T3-L1. Cette augmentation n’est pas expliquée par une augmentation du calcium cytosolique mais plutôt par une stimulation de la phosphorylation de l’AMPK. De plus, le BJ inhibe l’adipogenèse chez les 3T3-L1. Le BJ diminue également l’hyperglycémie chez les souris obèses diabétiques KKAy et protège les jeunes souris pré-diabétiques contre le développement de l’obésité et du diabète. L’activité anti-hyperglycémique du BJ pourrait impliquer les adipokines puisque le BJ augmente le niveau d’adiponectine chez les souris diabétiques. Le BJ représente ainsi une approche prometteuse pour le traitement du diabète et les maladies neurodégénératives et une source de nouveaux agents thérapeutiques contre ces maladies.

Modulation de la voie de signalisation de Gαq par l’hyperglycémie : mécanisme moléculaire

Les complications vasculaires telles que l’augmentation de la contractilité et la prolifération cellulaire sont les complications les plus communes observées dans le diabète et l’hyperglycémie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gαq joue un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire et l’altération de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observées dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. Il a été observé que les taux et l’activité des protéines kinase C (PKC) et du diacylglycérol (DAG) sont augmentés dans ces conditions. Cependant, aucune étude n’a démontré l’implication de Gαq/11 et des PLCβ, molécules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs études révèlent que l’augmentation des taux et de l’activité des PKC et du DAG induite par l’hyperglycémie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribuée à l’augmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que l’angiotensine II et l’endothéline-1, augmentés dans les conditions de diabète/d’hyperglycémie, peuvent contribuer à l’augmentation du stress oxydatif observée. Le travail présenté dans cette thèse avait pour but d’examiner les effets de l’hyperglycémie sur les niveaux d’expression protéique de Gαq/11 et de ses molécules associées, ainsi que d’étudier le mécanisme moléculaire par lequel l’hyperglycémie module la voie de signalisation de Gαq dans les CMLV. Dans la première étude, nous avons examiné si l’hyperglycémie pouvait moduler l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ1 et PLCβ2. Le prétraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 en comparaison avec les CMLV témoins. Le traitement avec des antagonistes aux récepteurs AT1 de l’Ang II, et ETA/ETB de l’ET-1, atténue la hausse de Gαq, de Gα11, de PLCβ1 et de PLCβ2 induite par l’hyperglycémie. De plus, la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 était plus élevée dans les CMLV exposée à 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec l’Ang II et l’ET-1 augmente également les niveaux d’expression des protéines Gα q/11 et PLCβ. Cette augmentation de l’expression est restaurée au niveau des CMLV témoins par les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ dans les CMLV induite par l’hyperglycémie est attribuée à l’activation des récepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde étude, nous avons examiné l’implication du stress oxydatif dans l’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. Nous avons également déterminé le mécanisme responsable de l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie. L’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ des CMLV A10 exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec l’antioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chélateur du peroxyde d’hydrogène, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par l’acide urique, des chélateurs du peroxynitrite. De plus, l’augmentation de la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 dans les CMLV exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec le DPI et la catalase. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie contribue à l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq. De plus, l’augmentation de la production d’anion superoxyde (O2-), de l’activité de la NADPH oxydase et de l’expression des protéines p22(phox) et p47(phox) induite par l’hyperglycémie est revenue à un niveau basal après un traitement avec les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie augmente les niveaux endogènes de l’Ang II et de l’ET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation d’O2- et de H2O2 et peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gq/11α et de leurs molécules de signalisation. Puisqu’il a été observé que l’hyperglycémie transactive les récepteurs aux facteurs de croissance tels que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-R) et le récepteur au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris d’examiner, dans la troisième étude, l’implication d’EGF-R et de PDGF-R dans l’augmentation des niveaux de Gαq/11, de PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. L’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 induite par l’hyperglycémie est revenue au niveau basal après un traitement avec les inhibiteurs d’EGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par l’inhibiteur de c-Src, PP2. L’augmentation de la phosphorylation d’EGF-R et de PDGF-R induite par l’hyperglycémie a été abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, l’augmentation des niveaux de Gαq/11, et de PLCβ induite par l’hyperglycémie est atténuée par l’inhibiteur des MAPK, le PD98059, et par l’inhibiteur d’AKT, le wortmannin. L’augmentation de la phosphorylation d’ERK et d’AKT était également atténuée par AG1478 et AG1295. Ces résultats suggèrent que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gα q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les études présentées dans cette thèse indiquent que l’hyperglycémie augmente les niveaux de Gαq/11 et de PLCβ. Nous avons émis des évidences qui démontrent que l’augmentation endogène de l’Ang II et de l’ET-1 par l’hyperglycémie peut contribuer à l’augmentation de la production d’O2- et de H2O2 résultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions d’hyperglycémie. Finalement, nous avons démontré que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par l’hyperglycémie peut être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabète et d’hyperglycémie.

Le diabète maternel influence la morphogenèse rénale et la programmation périnatale

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel.

Validation des effets antidiabétiques de Rhododendron groenlandicum, une plante médicinale des Cri de la Baie James, dans le modèle in vitro et in vivo : élucidation des mécanismes d’action et identification des composés actifs

Le diabète est un syndrome métabolique caractérisé par une hyperglycémie chronique due à un défaut de sécrétion de l’insuline, de l’action de l’insuline (sensibilité), ou une combinaison des deux. Plus d'un million de canadiens vivent actuellement avec le diabète. La prévalence de cette maladie est au moins trois fois plus élevée chez les autochtones que dans la population canadienne en général. Notre équipe vise à étudier les effets potentiellement antidiabétiques de certaines plantes médicinales utilisées par les Cris d'Eeyou Istchee (Baie James, Québec) où l’adhérence aux traitements médicamenteux est faible, en partie à cause de la déconnection culturelle de ces derniers. Grâce à une approche ethnobotanique, notre équipe a identifié 17 plantes médicinales utilisées par cette population pour traiter des symptômes du diabète. Parmi ces plantes, l’extrait éthanolique de Rhododendron groenlandicum (Thé du Labrador) a montré un fort potentiel antidiabétique chez plusieurs lignées cellulaires, notamment les adipocytes (3T3-L1). Cette plante induit la différenciation adipocytaire probablement par l’activation du peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR γ). Cette stimulation améliore la résistance à l’insuline et constitue un mécanisme privilégié pour une classe de médicaments antidiabétiques, les thiazolidinediones. Le but de la présente étude est de valider l’efficacité et l’innocuité de R. groenlandicum in vivo, dans un modèle animal de résistance à l’insuline, d’élucider les mécanismes par lesquels cet extrait exerce ses effets antidiabétiques et d’identifier les principes actifs responsables de son activité. L'isolation et l'identification des constituants actifs ont été réalisées à l’aide d'une approche de fractionnement guidé par bioessai; en l'occurrence, l'adipogénèse. Cette approche, réalisée dans la lignée adipocytaire 3T3-L1, a pour but de mesurer leur teneur en triglycérides. Des études in vivo ont été réalisées sur le modèle de souris DIO (diet induced obesity). L'extrait éthanolique du R. groenlandicum a été incorporé à la nourriture grasse (35% d’apport calorique lipidique) à trois doses différentes (125, 250 et 500 mg / kg) sur une période de 8 semaines. Des tissus cibles de l’insuline (foie, muscle squelettique et tissus adipeux) ont été récoltés afin de faire des analyses d’immunobuvardage de type western. La quercétine, la catéchine et l’épicatéchine ont été identifiées comme étant les composés actifs responsables de l'effet antidiabétique du R. groenlandicum. Seules la catéchine et l’épicatéchine activent l’adipogénèse uniquement à forte concentration (125-150 M), tandis que la quercétine l’inhibe. L’étude in vivo a montré que le traitement avec R. groenlandicum chez les souris DIO réduit le gain de poids de 6%, diminue l'hyperglycémie de 13% et l’insulinémie plasmatique de 65% et prévient l’apparition des stéatoses hépatiques (diminution de 42% de triglycéride dans le foie) sans être toxique. Les analyses d’immunobuvardage ont montré que R. groenlandicum stimule la voie de l’insuline via la phosphorylation de l’Akt et a augmenté le contenu protéique en Glut 4 dans les muscles des souris traitées. Par contre, dans le foie, le R. groenlandicum passerait par deux voies différentes, soit la voie insulino-dépendante par l’activation de l’AKT, soit la voie insulino-indépendante par la stimulation de l’AMPK. L’amélioration observée des stéatoses hépatiques chez les souris DIO traitées, a été confirmée par une baisse du facteur de transcription, SREBP-1, impliqué dans la lipogénèse de novo, ainsi qu’une diminution de l’inflammation hépatique (diminution de l’activité d’IKK α/β). En conclusion, l’ensemble de ces résultats soutiennent le potentiel thérapeutique de Rhododendron groenlandicum et de ses composants actifs dans le traitement et la prévention du diabète de type 2. Nous avons validé l'innocuité et l'efficacité de cette plante issue de la médecine traditionnelle Cri, qui pourrait être un traitement alternatif du diabète de type 2 dans une population ayant une faible adhérence au traitement pharmacologique existant.

Rôle de l'estérification des acides gras dans la régulation de la sécrétion d'insuline et le stress métabolique induits par le glucose

Le diabète est une maladie chronique de l’homéostasie du glucose caractérisée par une hyperglycémie non contrôlée qui est le résultat d’une défaillance de la sécrétion d’insuline en combinaison ou non avec une altération de l’action de l’insuline. La surnutrition et le manque d’activité physique chez des individus qui ont des prédispositions génétiques donnent lieu à la résistance à l’insuline. Pendant cette période dite de compensation où la concentration d’acides gras plasmatiques est élevée, l’hyperinsulinémie compense pleinement pour la résistance à l’insuline des tissus cibles et la glycémie est normale. Le métabolisme du glucose par la cellule pancréatique bêta entraîne la sécrétion d’insuline. Selon le modèle classique de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, l’augmentation du ratio ATP/ADP résultant de la glycolyse et de l’oxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dépendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi d’un influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet l’exocytose des granules de sécrétion contenant l’insuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la sécrétion d’insuline. Cependant, le modèle classique ne permet pas d’expliquer cette potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Pour expliquer l’effet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a proposé un modèle complémentaire où le malonyl-CoA dérivé du métabolisme anaplérotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransférase-1, l’enzyme qui constitue l’étape limitante de l’oxydation des acides gras favorisant ainsi leur estérification et donc la formation de dérivés lipidiques signalétiques. Le modèle anaplérotique/lipidique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose prédit que le malonyl-CoA dérivé du métabolisme du glucose inhibe la bêta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilité des acyl-CoA ou des acides gras non-estérifiés. Les molécules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du métabolisme des acides gras à l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux réalisés par notre laboratoire ont démontré qu’en augmentant la répartition des acides gras vers la bêta-oxydation, la sécrétion d’insuline induite par le glucose était réduite suggérant qu’un des dérivés de l’estérification des acides gras est important pour la potentialisation sur la sécrétion d’insuline. En effet, à des concentrations élevées de glucose, les acides gras peuvent être estérifiés d’abord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycérol (DAG) et subséquemment en triglycérides (TG). La présente étude a établi l’importance relative du processus d’estérification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la sécrétion d’insuline. Nous avions émis l’hypothèse que des molécules dérivées des processus d’estérification des acides gras (ex : l’acide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux métaboliques et sont responsables de la modulation de la sécrétion d’insuline en présence d’acides gras. Afin de vérifier celle-ci, nous avons modifié le niveau d’expression des enzymes clés contrôlant le processus d’estérification par des approches de biologie moléculaire afin de changer la répartition des acides gras dans la cellule bêta. L’expression des différents isoformes de la glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT), qui catalyse la première étape d’estérification des acides gras a été augmenté et inhibé. Les effets de la modulation de l’expression des isoenzymes de GPAT sur les processus d’estérifications, sur la bêta-oxydation et sur la sécrétion d’insuline induite par le glucose ont été étudiés. Les différentes approches que nous avons utilisées ont changé les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altérer la sécrétion d’insuline induite par le glucose. Ainsi, les résultats de cette étude n’ont pas associé de rôle pour l’estérification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la sécrétion d’insuline. Cependant, l’estérification des acides gras fait partie intégrante d’un cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. D’ailleurs, des études parallèles à la mienne menées par des collègues du laboratoire ont démontré un rôle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Parallèlement à nos études des mécanismes de la sécrétion d’insuline impliquant les acides gras, notre laboratoire s’intéresse aussi aux effets négatifs des acides gras sur la cellule bêta. La glucolipotoxicité, résultant d’une exposition chronique aux acides gras saturés en présence d’une concentration élevée de glucose, est d’un intérêt particulier vu la prépondérance de l’obésité. L’isoforme microsomal de GPAT a aussi utilisé comme outil moléculaire dans le contexte de la glucolipotoxicité afin d’étudier le rôle de la synthèse de novo de lipides complexes dans le contexte de décompensation où la fonction des cellules bêta diminue. La surexpression de l’isoforme microsomal de la GPAT, menant à l’augmentation de l’estérification des acides gras et à une diminution de la bêta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification métabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicité.

Dissection du rôle fondamental de l'hyperglycémie sur la morphogenèse rénale

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.