Heteroplasmy in mammal mitochondrial deoxyribonucleic acid

La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire.

Étude du système endocannabinoïde et ses implications dans la schizophrénie

La schizophrénie est une maladie complexe et a une prévalence approximative de 1% dans la population générale. Au sein des paradigmes neurochimiques, la théorie étiologique de la dopamine est celle qui prévaut alors que sont de plus en plus impliqués d’autres circuits de neurotransmission comme celui du glutamate. En clinique, les patients atteints de schizophrénie ont une grande propension à consommer des substances, particulièrement du cannabis. Nous avons cherché à étayer l’hypothèse d’un désordre du système cannabinoïde endogène, un important neuromodulateur. Ce mémoire propose d’abord dans un premier article une revue exhaustive de la littérature explorant le système endocannabinoïde et ses implications dans la schizophrénie. Puis, nous exposons dans un second article les résultats d’une recherche clinique sur les endocannabinoïdes plasmatiques dans trois groupes de sujets avec schizophrénie et/ou toxicomanie, pendant 12 semaines. Nous avons observé un effet miroir de deux ligands endocannabinoïdes, l’anandamide et l’oleylethanolamide, qui étaient élevés chez les patients avec double diagnostic et abaissés chez les toxicomanes, au début de l’étude. Au terme de l’étude, l’élévation des endocannabinoïdes s’est maintenue et nous avons supposé un marqueur de vulnérabilité psychotique dans un contexte de consommation. Finalement, nous avons analysé les résultats en les intégrant aux connaissances moléculaires et pharmacologiques ainsi qu’aux théories neurochimiques et inflammatoires déjà développées dans la schizophrénie. Nous avons aussi tenu compte des principales comorbidités observées en clinique: la toxicomanie et les troubles métaboliques. Cela nous a permis de proposer un modèle cannabinoïde de la schizophrénie et conséquemment des perspectives de recherche et de traitement.

Implication des protéines RECA dans le maintien de la stabilité du génome des chloroplastes d’Arabidopsis thaliana.

La stabilité génomique des organelles de plantes suscite un grand intérêt dans le domaine de la biologie végétale. En effet, plusieurs études récentes suggèrent que ce type d’instabilité génomique pourrait mener à l’isolation de traits intéressants en l’agronomie. Plusieurs protéines sont d’ailleurs déjà été identifiés comme étant impliqués dans le maintien de la stabilité de ces génomes, tels que MSH1, la famille des POLI, OSB1, les protéines Whirly et les Recombinases A (RECA). Le génome nucléaire d’Arabidopsis thaliana encode trois protéines s’apparentant à la Recombinase A bactérienne et qui sont ciblées à la mitochondrie et/ou au chloroplaste, soit RECA1, RECA2 et RECA3. Globalement, ces gènes partagent une similarité de séquence de 61% avec leur homologue bactérien chez Escherichia coli. Chez les bactéries ces protéines jouent un rôle essentiel dans la recombinaison homologue et sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Chez Arabidopsis, il a été démontré que RECA2 et RECA3 sont nécessaires au maintien de l’intégrité du génome mitochondriale. Toutefois leur contribution à la stabilité du génome chloroplastique ainsi que le rôle de RECA1 restent obscures. Le but de ce projet est donc de déterminer la contribution éventuelle des protéines RECA d’Arabidopsis dans la réparation de l’ADN chloroplastique et plus précisément le rôle du gène RECA1. Nous énonçons l’hypothèse que les RECA de plantes se comportent effectivement comme leurs orthologues bactériens en étant impliqués dans la recombinaison homologue. Dans le cadre de ce projet, nous avons tenté d’isoler des lignées mutantes pour chacun des gènes RECA d’Arabidopsis. En somme, nous avons pu obtenir des lignées convenables pour notre étude que dans le cas du gène RECA1. Ces lignées ont été utilisées pour évaluer la contribution de ce gène à la stabilité du génome du chloroplaste. Ensuite, pour étudier la relation épistatique des gènes RECA1, WHY1 et WHY3, un croisement des différentes lignées mutantes pour ces gènes a été réalisé. Nous avons ensuite étudié la sensibilité de toutes ces lignées mutantes à la ciprofloxacine, un agent causant des bris double brin exclusivement dans les organelles de plantes. Finalement, iii nous avons testé la présence de réarrangements dans le génome du chloroplaste en condition normal ou en présence de stress génotoxique. Nos résultats démontrent que les protéines Whirly et RECA1 sont impliquées dans deux voies de réparation de l’ADN différentes et que les Whirly sont suffisantes pour s’occuper des bris d’ADN double brin en l’absence de RECA1. Nous démontrons également que l’absence de Whirly et RECA1 entraine une forte augmentation de la quantité de réarrangements dans le génome du chloroplaste. De plus nous proposons que la polymérase POLIB est impliquée dans la même voie de réparation que RECA1. Finalement nous proposons un modèle pour expliquer nos résultats et impliquons RECA1 dans un mécanisme de réparation d’ADN et aussi un rôle potentiel dans la réplication.

Vitamine K et fonctions cognitives chez la personne âgée en santé : une approche épidémiologique nutritionnelle

La vitamine K fait l’objet d’un intérêt croissant en regard du rôle qu’elle peut jouer dans la santé humaine hormis celui bien établi dans la coagulation sanguine. De plus en plus d’études expérimentales lui confèrent des fonctions dans le système nerveux central, particulièrement dans la synthèse des sphingolipides, l’activation de la protéine vitamine K-dépendante Gas6 et la protection contre les dommages oxydatifs. Toutefois, il demeure beaucoup moins bien établi si la perturbation de ces fonctions peut conduire à des déficits cognitifs. L’objectif principal de cette thèse est de vérifier l’hypothèse selon laquelle le statut vitaminique K des personnes âgées en santé est un déterminant de la performance cognitive. En vue de la réalisation de cet objectif, une meilleure compréhension des indicateurs du statut vitaminique K s’avérait nécessaire. Chacune des études présentées vise donc un objectif spécifique : 1) évaluer le nombre de rappels alimentaires de 24 heures non consécutifs nécessaire pour mesurer l’apport habituel de vitamine K des personnes âgées; 2) évaluer la valeur d’une seule mesure de la concentration sérique de vitamine K comme marqueur de l’exposition à long terme; et 3) examiner l’association entre le statut vitaminique K et la performance cognitive des personnes âgées en santé de la cohorte québécoise NuAge. Trois dimensions cognitives ont été évaluées soient la mémoire épisodique verbale et non-verbale, les fonctions exécutives et la vitesse de traitement de l’information. Cette thèse présente la première étude appuyant l’hypothèse d’un rôle de la vitamine K dans la cognition chez les personnes âgées. Spécifiquement, la concentration sérique de vitamine K a été associée positivement à la performance en mémoire épisodique verbale, et plus particulièrement au processus de consolidation de la trace mnésique. En accord avec les travaux chez l’animal et l’action de la protéine Gas6 dans l’hippocampe, un rôle spécifique de la vitamine K à l’étape de consolidation est biologiquement plausible. Aucune association significative n’a été observée avec les fonctions exécutives et la vitesse de traitement de l’information. Parallèlement, il a été démontré qu’une mesure unique de la concentration sérique de vitamine K constitue une mesure adéquate de l’exposition à long terme à la vitamine K. De même, il a été établi que six à 13 rappels alimentaires de 24 heures sont nécessaires pour estimer précisément l’apport de vitamine K des personnes âgées en santé. Collectivement, les résultats de ces deux études fournissent des informations précieuses aux chercheurs permettant une meilleure interprétation des études existantes et une meilleure planification des études futures. Les résultats de cette thèse constituent une avancée importante dans la compréhension du rôle potentiel de la vitamine K dans le système nerveux central et renforce la nécessité qu’elle soit considérée en tant que facteur nutritionnel du vieillissement cognitif, en particulier chez les personnes traitées par un antagoniste de la vitamine K.

Le peptide natriurétique auriculaire induit la différenciation cardiaque dans les cellules souches embryonnaires carcinomateuses de souris P19

Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP. Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western. Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels. Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire.

Les prostanoïdes contrôlent la circulation placentaire : implication dans la prééclampsie

Au cours de la grossesse, une perfusion placentaire adéquate est indispensable au bon développement du fœtus. Dans certaines maladies comme la prééclampsie, celle-ci est altérée, compromettant ainsi la vie du fœtus, mais aussi celle de sa mère. Le retrait du placenta mène à la disparition des symptômes de la prééclampsie, suggérant un rôle central de ce dernier dans la maladie. Le placenta étant dépourvu d’innervation autonome, le tonus vasculaire placentaire doit être sous le contrôle de facteurs humoraux et tissulaires. Les vaisseaux placentaires sont très réactifs aux prostanoïdes. Le rapport thromboxane A2 (TXA2)/prostacycline (PGI2) est fortement augmenté dans les placentas de grossesses avec prééclampsie. De plus, le taux d’isoprostane, marqueur du stress oxydatif, est accru dans les placentas de femmes avec prééclampsie. Finalement, la prééclampsie s’accompagne d’un stress oxydatif placentaire marqué. Les espèces réactives de l’oxygène sont connues d’une part, pour oxyder l’acide arachidonique (AA), formant ainsi des isoprostanes et d’autre part, pour augmenter la production de TXA2 dans différents tissus, suite à l’activation des cyclooxygénases (COXs). Nous proposons que : 1. les prostanoïdes sont parmi les molécules endogènes qui contrôlent le tonus vasculaire placentaire. 2. la maladie modifie la réponse aux isoprostanes dans les vaisseaux placentaires. 3. l’induction d’un stress oxydatif placentaire entraîne une réponse vasoactive par activation de la voie du métabolisme de l’AA. Nous avons tout d’abord montré, dans des placentas obtenus de grossesses normotensives, que l’U-46619, un mimétique de la TXA2, de même que l’isoprostane, 8-iso-prostaglandine E2 (8-isoPGE2), ont augmenté fortement la pression de perfusion dans les cotylédons perfusés in vitro et la tension dans les anneaux d’artères chorioniques suspendus dans des bains à organe isolé. En revanche, dans les artères chorioniques de placentas obtenus de grossesses avec prééclampsie, ces réponses étaient modifiées puisque la réponse maximale à l’U-46619 était augmentée et celle à la 8-isoPGE2 diminuée. D’autre part, nous avons montré que les réponses maximales aux deux prostanoïdes étaient augmentées dans les vaisseaux placentaires de grossesse normale ou avec prééclampsie issus d’une délivrance prématurée par rapport à ceux d’une délivrance à terme. Ceci suggère une évolution de la réactivité des artères placentaires au cours du 3e trimestre de grossesse. En outre, les vaisseaux placentaires ont répondu aux prostanoïdes de façon semblable qu’ils aient été issus d’un accouchement vaginal ou d’une césarienne élective. Ceci indique que les prostanoïdes placentaires n’interviennent pas dans le processus de délivrance. D’un autre côté, l’utilisation de bloqueurs spécifiques des récepteurs TP à la TXA2, le SQ29,548 et l’ICI192,605, et des récepteurs EP à la prostaglandine E2, l’AH6809, nous ont permis de mettre en évidence le fait que l’U-46619 et la 8-isoPGE2 pouvaient agir de façon non-sélective sur l’un ou l’autre des récepteurs. Ces résultats supportent donc nos 2 premières hypothèses : les prostanoïdes font partie des molécules endogènes qui peuvent contrôler le tonus vasculaire placentaire et la prééclampsie modifie la réponse aux isoprostanes dans les artères chorioniques d’une manière compatible avec l’augmentation de la production de ces substances qui elle, est probablement le résultat du stress oxydatif. En revanche, en ce qui concerne les substances capables de jouer la contrepartie vasodilatatrice, l’utilisation d’un inhibiteur des synthases de monoxyde d’azote, le L-NAME, et celle d’inhibiteurs des COXs, l’ibuprofène, l’indométacine et le N-2PIA, ne nous a pas permis de mettre en évidence un quelconque rôle du monoxyde d’azote ou des prostanoïdes vasodilatatrices à ce niveau. Finalement, nous avons montré que l’induction d’un stress oxydatif dans les cotylédons perfusés in vitro et les artères chorioniques entraînait une vasoconstriction marquée. Celle-ci semble résulter de l’action des prostanoïdes puisqu’un blocage des récepteurs TP ou des COXs diminuait significativement la réponse maximale au peroxyde d’hydrogène. Les prostanoïdes impliquées dans la réponse au stress oxydatif proviendraient essentiellement d’une activation des COXs puisque l’étude ne nous permet pas de conclure à une quelconque implication des isoprostanes dans cette réponse. Ces observations confirment donc notre hypothèse que, dans le placenta, le stress oxydatif possède des propriétés vasoactives par activation du métabolisme de l’AA. En résumé, les résultats obtenus dans les placentas de grossesses normotensives et avec prééclampsie suggèrent que les prostanoïdes sont des molécules d’importance dans la régulation du tonus vasculaire placentaire. Le fait que la prééclampsie modifie la réponse aux prostanoïdes pourrait expliquer pourquoi la perfusion placentaire est altérée chez ces patientes. En outre, il apparaît évident qu’il existe un lien étroit entre le stress oxydatif et la voie de synthèse des prostanoïdes placentaires. Cependant d’autres études sont nécessaires pour mieux comprendre la nature de ce lien, qui pourrait, d’une certaine façon, jouer un rôle important dans le développement de la prééclampsie.

Des relations entre les structures musicales et les contextes sociaux dans un répertoire de "sessions" instrumentales irlandaises

La version intégrale de ce mémoire [ou de cette thèse] est disponible uniquement pour consultation individuelle à la Bibliothèque de musique de l’Université de Montréal (www.bib.umontreal.ca/MU)

Facteurs de risque de calcifications vasculaires en insuffisance rénale constituant une contre-indication à la greffe rénale

On estime que des calcifications vasculaires (CVs) sont présentes chez 60% des patients avec insuffisance rénale terminale (IRT) et que ces CVs contribuent à l’augmentation de la maladie cardiovasculaire chez ces patients. La maladie cardiovasculaire est la première cause de mortalité chez les patients en IRT. La transplantation rénale est le traitement de choix en IRT mais peut être contre-indiquée pour des raisons chirurgicales liées au CVs ou en raison d’un risque de complications cardiovasculaires postopératoires trop élevé associé à la présence de CVs sévères. Il est donc primordial de déterminer quels facteurs sont associés à la présence de CVs qui rendraient le patient non-éligible pour une greffe rénale. En particulier il serait intéressant de vérifier si un produit phosphocalcique élevé est un facteur de risque de non-éligibilité pour une greffe rénale en raison de CVs. L’étude actuelle utilise la base de données de transplantation du CHUM. C’est une étude de type cas-témoins avec une cohorte de 1472 patients de 1992 à 2009. Les cas sont les patients jugés non-éligibles pour une transplantation rénale en raison de la présence de CVs sévères. Les contrôles sont les patients jugés éligibles: 80 cas et 80 contrôles ont été inclus. Les facteurs de risque qui ont été identifiés pour la non-éligibilité en raison de CVs sont le diabète (adjusted Odds Ratio (OR): 5.55 (1.98 - 15.59)), l’âge (OR: 1.14 (1.09 – 1.2)), le tabagisme (OR: 9.51 (2.55 – 35.51)) et la dialyse (OR: 6.83 (2.33 – 20.05)). La durée de la dialyse a aussi été identifiée comme facteur de risque (OR : 8.61 (2.34-31.68) pour une durée de dialyse de 8 mois et plus, OR : 4.57 (1.42-14.65) pour une durée de dialyse de 1 à 7 mois. Bien que significatif en univarié, le produit phosphocalcique n’a pas été identifié comme facteur de risque significatif dans les analyses multivariées. En conclusion, cette étude montre que le produit phosphocalcique pourrait être un marqueur d’une insuffisance rénale prolongée et moins bien contrôlée plutôt qu’un facteur de risque de calcifications rendant le patient non-éligible à la greffe. De plus cette étude met de l’emphase sur la notion qu’il est primordial 1) de référer précocement les patients à haut risque de CVs vers un centre de transplantation pour une évaluation et 2) de prendre en charge agressivement l’arrêt du tabac chez tous les patients qui sont potentiellement éligibles pour une transplantation.

Caractérisation de nouveaux mécanismes transcriptionnels impliqués dans la biologie osseuse

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin.

Effet de la surexpression du gène Hoxb4 sur la prolifération homéostatique des cellules T mémoires

Les cellules T mémoires (Tm) protègent l’organisme contre les réinfections de pathogènes qu’il a déjà combattu. Les Tm possèdent plusieurs propriétés en commun avec les cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment la capacité de se différencier, de s’auto-renouveler et de maintenir une population relativement constante au sein de l’organisme via des mécanismes homéostatiques. Il a été démontré que Hoxb4, un membre de la famille des facteurs de transcription Hox, était capable d’induire l’expansion des CSH in vivo et in vitro de façon rapide. Au vu de ces parallèles, nous avons posé l’hypothèse que la surexpression de Hoxb4 pourrait induire l’expansion de populations de Tm. Nous avons analysé les populations de Tm et lymphocytes T naïfs (Tn) dans les organes lymphoïdes de souris transgéniques surexprimant Hoxb4 et les avons comparées à des souris de type sauvage (wt). Alors que la fréquence des cellules T matures Hoxb4 diminuait avec l’âge, leur phénotype ainsi que leur viabilité demeuraient inchangés. Ensuite, nous avons procédé à des transplantations en compétition de Tm (CD4+CD44hi) Hoxb4 et wt chez des hôtes dépourvus de lymphocytes T (CD3-/-) dans le but d’évaluer leur contribution à la reconstitution du compartiment T après 2 mois. Au final, les Tm wt avait contribué un peu plus que les Tm Hoxb4 à la reconstitution (~60%). Des analyses fonctionnelles et phénotypiques ont montré que les Tm Hoxb4 possédaient une fonctionnalité normale, mais se distinguaient des Tm wt par la présence d’une faible population qui présentait un phénotype « mémoire central » (Tcm), conférant habituellement une longévité accrue. Les cellules des ganglions lymphatiques totaux des hôtes furent transplantées de façon sérielle chez trois générations de nouveaux hôtes. Le phénotype Tcm observés chez les Tm Hoxb4 était récapitulé chez les hôtes secondaires uniquement. Les ratios sont demeurés en faveur des Tm wt lors des deux transplantations suivantes, mais les Tm Hoxb4 ont commencé à montrer un avantage compétitif chez certains hôtes quaternaires. Une transplantation en compétition à court terme de Tm Hoxb4 et wt marqués avec un marqueur cytoplasmique ont démontré la présence chez les Tm Hoxb4 seulement d’une faible population CD62Lhi proliférant lentement. Ainsi, l’expansion préférentielle de Tcm CD4 par le biais d’une sélection ou d’une différenciation induite par la surexpression de Hoxb4 pourrait potentiellement leur permettre de maintenir un état de quiescence leur permettant de persister plus longtemps suite à des transplantations sérielles.

Mécanismes moléculaires de la réplication préférentielle du VIH-1 dans les cellules à polarisation Th1Th17 versus Th1 : rôle de PPARG dans la régulation négative de la réplication virale

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires.

The DPRK in China's post-cold war foreign policy - a neoclassical realist analysis

Avec l’échec des négociations entre les États-Unis et la Corée du Nord, menées depuis le début des années 1990, sur la question du nucléaire, le problème est devenu graduellement l’affaire des pays voisins, tous soucieux de l’avenir de la région du sud-est asiatique. Présentée comme le seul allié de la Corée du Nord, la China a été invitée à participer à des négociations à trois, à quatre (1997-1998), et à six (2003-2007), dans l’espoir de faire entendre raison au régime isolé, mais jusqu’à maintenant, aucune des tentatives n’est parvenue à satisfaire chacun des membres à la table. Alors que la tension monte et que la politique américaine se fait de moins en moins flexible, la Chine quant à elle, continue d’encourager le retour des négociations à six (Six-Party Talks) dans l’optique de dénucléariser la péninsule coréenne, tout en travaillant à maintenir ses liens avec la Corée du Nord. Le fil conducteur de cette présente recherche est d’abord d’essayer de comprendre pourquoi la Chine continue de soutenir la Corée du Nord, fournissant dons alimentaires et financiers. L’idée est donc d’analyser, selon les principes du réalisme néoclassique, la politique étrangère de la Chine. L’hypothèse principale de cette théorie renvoie à l’idée que la distribution du pouvoir dans le système international influence la politique étrangère des États, mais que des variables au niveau de l’état et/ou de l’individu interviennent dans la formulation et l’application de celle-ci. Il est proposé ici que le lien entre l’unipolarité du système international et la politique nord-coréenne de la Chine, est façonné par des variables intermédiaires telles que : a) la perception des leaders de la distribution du pouvoir et de leur place dans le système international; b) l’idéologie du régime politique, et; c) le type d’unité responsable de la prise de décision en politique étrangère. L’analyse de chacune des variables permettra de faire la lumière sur les intérêts politiques et économiques de la Chine dans l’entretien de cette relation avec la Corée du Nord.

Novel non phospholipid liposomes with high sterol content : development and characterization

Les liposomes sont des nanovecteurs polyvalents et prometteurs quant à leur utilisation dans plusieurs domaines. Il y a une décennie, un nouveau type de liposome constitué d’amphiphiles monoalkylés et de stérols est né fortuitement dans notre groupe. Ils sont nommés Stérosomes puisqu’ils contiennent une grande proportion de stérols, entre 50 et 70 mol %. Les objectifs de cette thèse sont de développer de nouvelles formulations de Stérosomes ayant des caractéristiques spécifiques et d’acquérir une compréhension plus profonde des règles physicochimiques qui dictent leur comportement de phase. Nous avons spécifiquement examiné le rôle de motifs moléculaires des stérols, de la charge interfaciale et de la capacité à former des liaisons H dans les interactions intermoléculaires menant à l’autoassemblage. Le comportement de phase a été caractérisé par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), par spectroscopie infrarouge (IR) et par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du deutérium (²H NMR). Premièrement, nous avons établi certaines corrélations entre la structure des stérols, leur tendance à former des bicouches fluides en présence d'amphiphile monoalkylé et la perméabilité des grandes vésicules unilamellaires (LUV) formées. La nature des stérols module les propriétés de mélange avec de l’acide palmitique (PA). Les stérols portant une chaîne volumineuse en position C17 sont moins aptes à induire des bicouches fluides que ceux qui ont une chaîne plus simple, comme celle du cholestérol. Un grand ordre de la chaîne alkyle de PA est un effet commun à tous les stérols investigués. Il a été démontré que la perméabilité des LUV peut être contrôlée en utilisant des stérols différents. Cependant, ces stérols n’ont aucun impact significatif sur la sensibilité des Stérosomes au pH. Afin de créer des liposomes qui sont sensibles au pH et qui ont une charge positive à la surface, des Stérosomes composés de stéarylamine et de cholestérol (Chol) ont été conçus et caractérisés. Il a été conclu que l’état de protonation de l’amine, dans ce travail, ou du groupe carboxylique, dans un travail précédent, confère une sensibilité au pH et détermine la charge à la surface du liposome. Les premiers Stérosomes complètement neutres ont été fabriqués en utilisant un réseau de fortes liaisons H intermoléculaires. Le groupe sulfoxyde est capable de former de fortes liaisons H avec le cholestérol et les molécules d’eau. Une bicouche fluide métastable a été obtenue, à la température de la pièce, à partir d'un mélange équimolaire d’octadécyl méthyl sulfoxyde (OMSO) et de Chol. Ce comportement distinct a permis d’extruder le mélange pour former des LUV à la température de la pièce. Après 30 h, le temps de vie de la phase métastable, des Stérosomes stables et imperméables existaient toujours sous une forme solide. Un diagramme de température-composition a été proposé afin de résumer le comportement de phase des mélanges d’OMSO/Chol. Finalement, nous avons élaboré des Stérosomes furtifs en incorporant du polyéthylène glycol (PEG) avec une ancre de cholestérol (PEG-Chol) à l’interface de Stérosomes de PA/Chol. Jusqu’à 20 mol % de PEG-Chol peut être introduit sans perturber la structure de la bicouche. La présence du PEG-Chol n’a aucun impact significatif sur la perméabilité de la LUV. L'encapsulation active de la doxorubicine, un médicament contre le cancer, a été réalisée malgré la faible perméabilité de ces LUV et la présence du PEG à l’interface. L’inclusion de PEG a modifié considérablement les propriétés de l’interface et a diminué la libération induite par la variation de pH observée avec des LUV nues de PA/Chol. Cette formulation inédite est potentiellement utile pour l’administration intraveineuse de médicaments.

Nur77 au sein des désordres dopaminergiques inhérents à la schizophrénie, la maladie de Parkinson ou la dépendance aux drogues d'abus

Cette thèse vise à mieux comprendre le rôle du facteur de transcription Nur77 au sein des fonctions physiologiques et pathologiques des voies de neurotransmission dopaminergiques des gaglions de la base. Nous basant sur une implication motrice de Nur77 au sein des dyskinésies induites à la L-DOPA (LIDs), nous avons voulu tester in vivo son implication éventuelle dans les phénomènes moteurs et de sensibilisation associés à l’amphétamine ainsi qu’une implication possible du récepteur nucléaire aux rétinoïdes RXR dont nous avons déjà démontré une implication dans les effets moteurs des antipsychotiques. Un deuxième volet de la recherche à consisté en l’étude de l’implication des extracellular signal-regulated kinase (ERK) et de la protéine kinase C (PKC) dans l’induction de l’ARNm des membres de la famille des Nurs suite à l’activation des cascades de signalisation des récepteurs dopamiergiques D1 et D2 in vivo pour une meilleure compréhension des mécanismes physiopatholoiques liés aux désordres dopaminergiques. Pour ce faire, nous avons, premièrement, soumis des souris sauvages et Nur77-/- à un paradigme de sensibilisation à l’amphétamine ainsi qu’a différents agonistes antagonistes RAR/RXR afin de tester l’implication de Nur77 et d’un éventuel complexe Nur77/RXR dans les effets de l’amphétamine. Deuxièmement, soumis des souris sauvages à une combinaison d’agonistes D1/D2 ou une injection d’antagoniste D2 avec ou sans inhibiteur (ERK1/2 ou PKC) afin de tester l’implication de ces kinases sur l’induction de l’ARNm des membres de la famille des Nurs par hybridation in situ. Nous avons ainsi pu démontrer 1- un rôle moteur de Nur77 dans les effets liés à l’amphétamine notamment avec une absence de stéréotypies et un allongement de la durée de la phase de locomotion chez les souris Nur77-/-; ainsi qu’un rôle éventuel du complexe potentiel Nur77/RXR dans les D1 à mieux définir. 2- un rôle des kinases ERKs et PKCs dans les cascades de signalisation des récepteurs dopaminergiques D1 et D2 menant à l’induction des ARNms de Nur77, Nor-1 et Nurr-1. En perspective, ces résultats nous ouvrent la voie vers une implication éventuelle de Nur77 dans les mécanismes d’apprentissage que sont le Long Terme Potentiation (LTP) et la Long Terme Depotentialisation (LTD) liés aux LIDs et à l’amphétamine.

Elementary steps in aqueous proton transfer reactions : a first principles molecular dynamics study

La nature des acides dans un environnement aqueux est primordiale dans de nombreux aspects de la chimie et de la biologie. La caractéristique principale d'un acide est sa capacité à transférer un proton vers une molécule d'eau ou vers n'importe quelle base, mais ce procédé n'est pas aussi simple qu'il y paraît. Il peut au contraire être extrêmement complexe et dépendre de manière cruciale de la solvatation des différents intermédiaires de réaction impliqués. Cette thèse décrit les études computationnelles basées sur des simulations de dynamique moléculaire ab initio qui ont pour but d'obtenir une description à l'échelle moléculaire des divers procédés de transferts de proton entre acide et bases dans un milieu aqueux. Pour cela, nous avons étudié une serie de système, dont l'acide hydrofluorique aqueux, l'acide trifluoroacétique aqueux, et un système modèle constitué d'un phénol et d'une entité carboxylate reliés entre eux par une molécule d'eau en solution aqueuse. Deux états intermédiaires ont été identifiés pour le transfert d'un proton depuis un acide. Ces intermédiaires apparaissent stabilisés par un motif local de solvatation via des ponts H. Leurs signatures spectroscopiques ont été caractérisées au moyen de la spectroscopie infrarouge, en utilisant le formalisme de la dynamique moléculaire ab initio, qui inclut l'effet quantique nucléaire de manière explicite. Cette étude a aussi identifié trois chemins de réaction élémentaire, qui sont responsable pour le transfert d'un proton d'un acide à une base, ainsi que leurs échelles de temps caractéristiques. Les conclusions tirées de ces études sont discutées dans les détails, au niveau moléculaire, avec une emphase sur les comparaisons entre les résultats théoriques et les mesures expérimentales obtenues dans a littérature ou via des collaborateurs.