Immunotherapy with the saponin enriched-Leishmune (R) vaccine versus immunochemotherapy in dogs with natural canine visceral leishmaniasis

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

microRNA evaluation of unknown primary lesions in the head and neck

Unknown primary malignancy in the head and neck is not an infrequent diagnosis for patients with metastatic cervical lymph nodes. Although linked with a relatively good prognosis following radiation treatment, widespread radiation is coupled with significant morbidity. Altered microRNA (miRNA) expression has been associated with both cancer progression and metastasis. We sought to determine whether miRNA expression analysis could be used as a diagnostic tool to discover the primary site of malignancy, within the head and neck. We used quantitative real-time PCR to identify miRNA expression profiles of squamous cell carcinoma of the tonsil, base of tongue and post-nasal space, as well as their corresponding metastatic lymph nodes, from 6 patients. Our results revealed that each cancer maintained its expression profile between the primary site and the nodal metastasis (r = 0.82, p < 0.0001). In addition, each anatomical sub-site maintained a distinct miRNA profile between individual patients (r = 0.79, p < 0.0001). Finally, between sub-sites, the miRNA profiles were distinct (p < 0.0001). As proof of principle, our study provides an indication that miRNA expression analysis may be useful to compare the primary lesion and local metastatic disease. This may be clinically relevant to predict the primary site of origin of metastatic disease, when the primary site remains obscure.

Experimental paracoccidioidomycosis of the Syrian hamster: fungicidal activity and production of inflammatory cytokines by macrophages

Phagocytic cells play an important role in nonspecific resistance to fungal infection by mediating an inflammatory response and by a direct fungicidal action. In this study, the functional activity of peritoneal macrophages obtained from hamsters experimentally infected with strain Pb18 of Paracoccidioides brasiliensis was evaluated during 16 weeks of infection. The results showed that macrophages had a higher spreading ability associated with increased production of tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and enhanced fungicidal activity during the early periods of infection. TNF-alpha levels remained elevated during all periods studied, while low levels of interleukin-1 beta (IL-1 beta) were produced during the infection. A necrotic area with dead fungi was observed at the inoculation site and the infection disseminated only to liver and lymph nodes in a few animals. These results suggest that during the early stages of infection with P. brasiliensis, macrophage activation by the high levels of TNF-alpha limited fungal dissemination. In contrast, in the later stages of infection, high levels of TNF-alpha were observed while the fungicidal activity of macrophages was lower and the animals presented loss of vitality resulting in their death. These observations suggest a complex role of TNF-alpha in experimental paracoccidioidomycosis of Syrian hamsters, involving not only resistance but also pathogenesis.

Search for Mycobacterium leprae in wild mammals

Leprosy is still a worldwide public health problem. Brazil and India show the highest prevalence rates of the disease. Natural infection of armadillos Dasypus novemcinctus with Mycobacterium leprae has been reported in some regions of the United States. Identification of bacilli is difficult, particularly due to its inability to grow in vitro. The use of molecular tools represents a fast and sensitive alternative method for diagnosis of mycobacteriosis. In the present study, the diagnostic methods used were bacilloscopy, histopathology, microbiology, and PCR using specific primers for M. leprae repetitive sequences. PCR were performed using genomic DNA extracted from 138 samples of liver, spleen, lymph nodes, and skin of 44 D. novemcinctus, Euphractus sexcinctus, Cabassous unicinctus, and C. tatouay armadillos from the Middle Western region of the state of São Paulo and from the experimental station of Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) Pantanal, located in Pantanal da Nhecolândia of Mato Grosso do Sul state. Also, the molecular analysis of 19 samples from internal organs of other road killed species of wild animals, such as Nasua nasua (ring-tailed coati), Procyon cancrivoros (hand-skinned), Cerdocyon thous (dog-pity-bush), Cavia aperea (restless cavy), Didelphis albiventris (skunk), Sphigurrus spinosus (hedgehog), and Gallictis vittata (ferret) showed PCR negative data. None of the 157 analyzed samples had shown natural mycobacterial infection. Only the armadillo inoculated with material collected from untreated multibacillary leprosy patient presented PCR positive and its genomic sequencing revealed 100% identity with M. leprae. According to these preliminary studies, based on the used methodology, it is possible to conclude that wild mammals seem not to play an important role in the epidemiology of leprosy in the Middle Western region of the São Paulo state and in the Pantanal of Mato Grosso do Sul state.

Modulatory effects of tuberculosis vaccines on experimental autoimmune encephalomyelitis

Although BCG is the only accepted vaccine against tuberculosis (TB), its protective ability is very limited. Therefore, many new vaccines are being evaluated. Our group has been working on DNAhsp65 - a genetic construction containing the hsp65 gene from Mycobacterium leprae. In previous experimental works, we demonstrated that both DNAhsp65 alone or associated with BCG, in a prime-boost regimen, were effective to control TB. A possible deleterious effect related to autoimmunity needed to be tested because hsp65 is highly homologous to the correspondent mammalian protein. In this investigation we tested the effect of a previous immunization with DNAhsp65 alone or associated with BCG in a rat model of multiple sclerosis. Female Lewis rats were immunized with three doses of DNAhsp65 or primed with BCG followed by two DNAhsp65 boosters. The animals were, then, immunized with myelin associated with complete Freund's adjuvant to develop experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The following parameters were evaluated: weight loss, clinical score, central nervous system (CNS) inflammation and anti-myelin immune response. No deleterious effect was associated with these immunizations schedules. Immunized animals equally lost weight, the clinical scores were similar and CNS inflammation did not increase. Interestingly, both procedures determined decreased inflammation in the brain and lumbar spinal cord. This was concurrent with a modulatory effect over cytokine production by peripheral lymphoid organs. Cell cultures from spleen and lymph nodes in vitro stimulated with myelin produced less IFN-gamma and IL-10, respectively. This phenomenon was more clear in rats immunized with the genetic vaccine alone than with the prime-boost strategy. Together the results suggest that these strategies for TB prophylaxis would not accelerate or aggravate multiple sclerosis, being therefore, safe in this aspect. In addition, they indicate that these vaccination regimens have a potential anti-inflammatory activity that could be better explored in the future.

Experimental autoimmune encephalomyelitis evolution was not modified by multiple infections with Strongyloides venezuelensis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Is the BCG Vaccine Safe for Undernourished Individuals?

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Cytokine gene expression in response to Haemonchus placei infections in Nelore cattle

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Polymerase chain reaction and real-time PCR for diagnosing of Leishmania infantum chagasi in dogs

A importância do cão como reservatório de L. infantum chagasi no meio urbano tem estimulado a realização de inúmeros trabalhos de avaliação de técnicas de diagnóstico, uma vez que este procedimento, quando realizado corretamente, torna-se um importante passo na prevenção da doença em humanos. Dentre os métodos de diagnóstico, as técnicas moleculares têm adquirido destaque. Objetivou-se neste trabalho verificar o desempenho da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e da PCR em tempo real (qPCR) para diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) utilizando diferentes amostras biológicas. Para tanto foram utilizados 35 cães provenientes de uma área endêmica para LVC, onde foram utilizados para o diagnóstico molecular, aspirado de medula óssea, fragmentos de linfonodo e baço. Neste estudo a qPCR foi capaz de detectar um maior número de animais positivos quando comparada com a PCR. Já entre as diferentes amostras biológicas utilizadas não foi observada diferença significativa na detecção de DNA de L. infantumchagasi por meio da PCR e qPCR. Mesmo assim, considerando a facilidade de obtenção, o linfonodo pode ser considerada como a melhor amostra para diagnóstico molecular da infecção por L. infantum chagasi.

Toxoplasma gondii in experimentally infected Bos taurus and Bos indicus semen and tissues

Dezoito bovinos foram inoculados com Toxoplasma gondii e distribuídos aleatoriamente em três grupos de seis bovinos cada: GI (2,5x10(5) oocistos da cepa P), GII (5,0x10(6) taquizoítos da cepa RH) e GIII (controle). Exames clínicos, sorológicos e parasitêmicos foram realizados. Pesquisas do parasito, por meio da bioprova e pela técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), foram realizadas no sêmen e em fragmentos de musculatura esquelética, linfonodos, cérebro, retina, baço, fígado, pulmão, testículo, epidídimo e vesícula seminal. Amostras de sangue e sêmen foram colhidas nos dias -2, -1, 1, 3, 5, 7, 14 e, semanalmente, até o 84º dia pós-infecção (DPI). Os bovinos inoculados (GI e GII) apresentaram hipertermia do 3º ao 16º DPI. Anticorpos contra T. gondii foram detectados (IFI) no 5º DPI (1:16), em ambos grupos inoculados (oocistos e taquizoítos), atingindo picos de 1:4096 no 7º DPI. Surtos parasitêmicos ocorreram em todos os bovinos infectados, principalmente do 7º ao 28º DPI, independente da cepa e inóculo utilizados. O bioensaio revelou a presença do parasito em amostras seminais dos bovinos infectados com oocistos (GI) e taquizoítos (GII), em diversas datas experimentais, entre o 7º e 84º DPI. Parasitismo tissular por T. gondii foi diagnosticado por meio da bioprova e pela técnica da PCR, em vários fragmentos de tecidos e/ou órgãos. Os achados sugerem a possibilidade da ocorrência da transmissão sexual do T. gondii na espécie bovina.

Intoxicação por veneno de sapo em um canino

O sapo do gênero Bufo possui nas suas glândulas paratóides uma secreção mucóide contendo toxinas como bufaginas e Bufotoxinas, que são esteróides cardiogênicos. Os cães podem atacar os sapos, entrando em contato com o veneno por meio das mucosas. Um canino, da raça Bulldog Francês, foi encaminhado ao Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) para a necropsia com histórico de provável intoxicação por veneno de sapo. Na necropsia o canino apresentava pulmões aumentados de volume, avermelhados e com edema, e rins de coloração vermelho-escura. As alterações microscópicas indicaram congestão, hemorragia e edema pulmonar. Nos rins, no baço e nos linfonodos foi observada congestão. As análises toxicológicas para os venenos de rotina foram negativas. Porém, a investigação do veneno de sapo a partir de cromatografia por camada delgada e gasosa demonstrou resultado positivo, revelando ser esta a causa da morte do canino.

Linfadenectomia laparoscópica em cadela com neoplasia mamária

A linfadenectomia laparoscópica é realizada de forma rotineira na medicina, contudo é pouco utilizada na veterinária. Neste relato, um canino fêmea apresentando tumores na cadeia mamária esquerda (M4 e M5), foi submetido à aplicação intradérmica do azul de metileno estéril, ao redor do maior tumor (M5), buscando-se demarcação dos vasos linfáticos e linfonodos regionais. Após 15 minutos, iniciou-se a linfadenectomia abdominal videolaparoscópica na região inguinal esquerda, seguida da ovário-histerectomia (OVH) lapararoscópica com três portais. Realizou-se ainda mastectomia total unilateral esquerda. Pela histologia, obtiveram-se dois linfonodos abdominais livres de células tumorais. A paciente não apresentou recidiva em 60 dias.

Mitose como fator prognóstico para biópsia de linfonodo sentinela em melanoma fino

Paciente, sexo feminino, 23 anos, com melanoma extensivo superficial em dorso, Breslow 0,35 mm, Clark II, sem ulcerações e com 2 mitoses / mm². Foi submetida à ampliação de margem e biópsia de dois linfonodos sentinela (axila esquerda). O exame anatomopatológico mostrou micrometástases, no seio subcapsular de ambos. Seguindo a recomendação do American Joint Commitee on Cancer 2009, a paciente foi submetida à linfadenectomia axilar total, sem outros linfonodos metastáticos. A aplicação da dermatoscopia vem permitindo maior precisão diagnóstica de melanoma cutâneo, contribuindo para maior proporção de melanoma fino ao diagnóstico. A taxa mitótica foi incluída como um importante fator prognóstico para melanomas finos pelo American Joint Commitee on Cancer 2009, sugerindo biópsia para esses pacientes

Aplicação da técnica de imunofluorescência direta para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina em aspirado de linfonodo

Recentemente, foco de leishmaniose visceral canina (CVL) foi descrito na região noroeste do Estado de São Paulo - Brasil. O Hospital Veterinário - UNESP - Araçatuba, no ano de 2.000, desenvolveu 60 testes citopatológicos de casos suspeitos de leishmaniose usando aspirado por agulha fina (FNA). Os esfregaços de linfonodo foram corados pelo método de Romanowsky (Diff-Quik®) e observados em microscopia de luz. Os casos positivos mostraram formas amastigotas típicas de Leishmania livres ou em vacúolos de macrófagos. Sinais citopatológicos de reatividade do sistema linfo-histiocitário com ausência de parasitos foram também observados. Com o objetivo de implementar o diagnóstico da CVL, detectando parasitos e material antigênico nos esfregaços, aplicou-se a reação de imunofluorescência direta (IFD) usando anticorpo policlonal anti-Leishmania produzido em camundongo. Comparamos o método de IFD com a pesquisa direta do parasito em esfregaços corados pelo método de Romanowsky. Dos 60 cães com sinais clínicos da doença, o exame direto foi positivo em 50% (n=30), duvidoso em 36,7% (n=22) e negativo com reatividade do linfonodo em 13,3% (n=8). Quando os linfonodos foram submetidos a reação de IFD observamos reação positiva em 93,3% (n=56) e reação negativa em 6,7% (n=4). Nossos resultados mostraram que a reação de IFD apresentou alta sensibilidade quando comparada a pesquisa direta do parasito pela coloração de Romanowsky. A reação de IFD pode ser um método útil para confirmar os casos duvidosos da doença, onde as formas amastigotas não são identificadas com facilidade.

Cellular immune responses in mice immunized with Anisakis simplex larval antigens

Cellular immune responses to Anisakis simplex L3 antigens were investigated in BALB/c mice injected subcutaneously with a homologous crude extract (CE). Popliteal lymph nodes (PLN) were found to be increased in size and weight after A. simplex CE footpad injection. The effects of A. simplex CE in vitro proliferation were assayed with non-fractionated PLN cells or nylon-wool purified T cells derived from pooled lymph node cells of mice subcutaneously injected with CE. Spleen cells from immunized animals (antigen alone, or larva alone, or antigen plus larva) were studied by flow cytometry. The immunization induced a high proportion of CD4 + and TCR alpha beta + T cells. The number of B cells (CD45 + and TCR alpha beta-) in pre-immunized and infected mice was lower than that observed in animals subjected to infection only. The number of CD4 + T cells increased in the infected and in the pre-immunized and infected mice. In the latter, a decrease of CD8a + T cells was noted. The greatest increase in CD8a+ and TCR alpha beta- T cells was found in mice that had been subjected to infection only. Histological analysis showed that the most prominent lesions were gastric and intestinal in animals infected orally with one larva.