Interactions of tumor necrosis factor (TNF) and TNF receptor family members in the mouse and human.

Ligands of the tumor necrosis factor superfamily (TNFSF) (4-1BBL, APRIL, BAFF, CD27L, CD30L, CD40L, EDA1, EDA2, FasL, GITRL, LIGHT, lymphotoxin alpha, lymphotoxin alphabeta, OX40L, RANKL, TL1A, TNF, TWEAK, and TRAIL) bind members of the TNF receptor superfamily (TNFRSF). A comprehensive survey of ligand-receptor interactions was performed using a flow cytometry-based assay. All ligands engaged between one and five receptors, whereas most receptors only bound one to three ligands. The receptors DR6, RELT, TROY, NGFR, and mouse TNFRH3 did not interact with any of the known TNFSF ligands, suggesting that they either bind other types of ligands, function in a ligand-independent manner, or bind ligands that remain to be identified. The study revealed that ligand-receptor pairs are either cross-reactive between human and mouse (e.g. Tweak/Fn14, RANK/RANKL), strictly species-specific (GITR/GITRL), or partially species-specific (e.g. OX40/OX40L, CD40/CD40L). Interestingly, the receptor binding patterns of lymphotoxin alpha and alphabeta are redundant in the human but not in the mouse system. Ligand oligomerization allowed detection of weak interactions, such as that of human TNF with mouse TNFR2. In addition, mouse APRIL exists as two different splice variants differing by a single amino acid. Although human APRIL does not interact with BAFF-R, the shorter variant of mouse APRIL exhibits weak but detectable binding to mouse BAFF-R.

Leishmania major: Parasite Interactions Suggesting Sexuality

In five experiments, Leishmania (Leishmania) major (MRHO/SU/59/P-strain) grew poorly when seeded in FYTS medium supplemented with 15% fetal calf serum, but presented several peculiar pairs of promastigotes diametrically opposed and attached at their posterior ends (5.8-13.5%). As seen in Giemsa-stained smears, a ring-like line and/or an enlargement, generally occurred at the parasite junction. A close proximity of nuclei, which sometimes were difficult to distinguish from each other, was also observed at this junction. Several of these pairs appeared to be composed of fused cells in which the nuclei could be apparently fused, as shown by fluorescence microscopy to detect ß-tubulin and DNA, and by scanning electron microscopy. Under other culture conditions these pairs were absent or occurred at very low rates (0.2-2.2%). Such pairs differ markedly from longitudinally dividing cells and resemble those described in two other Leishmania species, as well as in Herpetomonas megaseliae and Phytomonas davidi, suggesting steps of a putative sexual process

Human eosinophil-lymphocyte interactions

While the eosinophil's effector functions clearly can contribute to the pathogenesis of allergic diseases, the evolutionary benefit to having eosinophils as a distinct class of leukocytes is not clear, especially if one must reconsider the nominally beneficial role of eosinophils in parasite host defense. Eosinophils are equipped to respond to lymphocytes and their cytokines (and not solely the eosinophil growth factor cytokines), but the functional consequences of such eosinophil responses need to be defined. Conversely, eosinophils, as antigen-presenting cells (APCs) or sources of lymphocyte-active cytokines, may stimulate and effect lymphocyte functioning. Eosinophils share with CD4+ lymphocytes expression of a number of receptors, including CD4 and IL-2R, and specific alpha4 integrins that may help in their common recruitment and activation. Further, elucidation of the interactions between lymphocytes and eosinophils will contribute to a broader understanding of the functioning of eosinophils in "normal" ongoing immune responses and in allergic disorders.

Selectin ligands on leukemic cells

RESUME L'infiltration tissulaire par les cellules leucémiques, responsable de leucostase, est une complication grave de la leucémie aiguë hyperleucocytaire. Elle peut entraîner une détresse respiratoire et des troubles neurologiques de mauvais pronostic. Pendant longtemps, la prolifération intravasculaire des cellules leucémiques et l'augmentation de la viscosité étaient considérées comme en étant responsables, et le traitement reposait sur une cytoréduction rapide par leucaphérèse. Actuellement, l'interaction entre les cellules leucémiques et l'endothélium vasculaire est plutôt considérée comme la cause de ce phénomène. En effet, les cellules leucémiques peuvent induire l'expression des sélectives endothéliales. Les sélectives initient le roulement des leucocytes avant leur adhésion ferme et leur migration dans les tissus. Elles reconnaissent des ligands spécifiques exprimés à la surface des leucocytes, comme PSGL-1 qui est un ligand commun des sélectives. Cependant, plusieurs études suggèrent que d'autres ligands de la E-sélective soient exprimés par les leucocytes. L'interaction des cellules leucémiques avec la E- et la P- sélective est corrélée avec l'expression de la molécule CLA, reconnue par l'anticorps HECA-452. L'immunopurification des ligands de la E-sélective avec cet anticorps a permis d'isoler, des cellules THP1 et U937, une protéine de 170 kDa, ainsi qu'une autre protéine de 250 kDa des cellules U937, en plus de PSGL-1. Ces protéines ont également été purifiées avec la protéine de fusion Esélective/IgM. CD43 et CD44 semblent être des ligands de la E-sélective sur certaines lignées, mais leur interaction avec la E-sélective n'est pas toujours retrouvée. De plus, cette étude a permis de montrer que ces ligands de la E-sélectiné sont exprimés dans les rafts lipidiques, comme PSGL-1 et la L-sélective des neutrophiles. Ces deux nouveaux ligands sont en cours d'identification. Ils pourraient représenter une nouvelle cible dans le traitement de la leucostase, mais aussi lors d'inflammation chronique ou de métastases. ABSTRACT Leukostasis is alife-threatening complication of acute leukemia, that results from tissue infiltration of leukemic blasts that migrate out of blood flow and interfere with normal tissue functions. The process leading to these complications has been attributed to the overcrowding of leukemic cells in the microcirculation. However, leukostasis more likely results from the adhesive interactions between leukemic blasts and the endothelium. Activated endothelium express adhesion molecules like P- and E-selectin, and leukemic cells themselves can induce the expression of E-selectin on endothelial cells. Selectins are essential in initiating the rolling of intravascular cells on endothelium before firm adhesion and transmigration outside of blood vessels. They interact with specific ligands on leukocyte cell surface. P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) is common ligand for E-, P- and L-selectin. Recently, CD44, ESL-1 and CD44 were shown to cooperate. ìn supporting mouse neutrophil adhesion to E-selectin. Other E-selectin ligands remain to be identified in humans. Leukemic cells were screened in order to characterize human E-selectin ligands. The interactions of E- and P-selectin correlate with the expression of CLA epitope. Therefore, HECA-452 mAb that recognizes CLA was used for immunopurification. Aglycoprotein of 170 kDa was purified from THP1 and U937 cells, and a protein of 250 kDa from U937 cells. These proteins were also purified by affinity binding to E-selectin/IgM chimera. PSGL-1 bound to E-selectin as expected, but CD43 and CD44 were not always adsorbed on E-selectin chimera, depending on cell types. E-selectin ligands were also shown to be in lipid rafts in leukemic cells, like PSGL-1 and L-selectin in human neutrophils. The 170 kDa protein has been sequenced, and three interesting ligands were among the candidates: ESL-1, CD44 and podocalyxin. These ligands are under investigation, and may represent a new therapeutic target in leukostasis, inflammation or cancer metastasis.

Interactions between learning and immunity in Drosophila melanogaster

Learning and immunity are two adaptive traits with roles in central aspects of an organism's life: learning allows adjusting behaviours in changing environments, while immunity protects the body integrity against parasites and pathogens. While we know a lot about how these two traits interact in vertebrates, the interactions between learning and immunity remain poorly explored in insects. During my PhD, I studied three possible ways in which these two traits interact in the model system Drosophila melanogaster, a model organism in the study of learning and in the study of immunity. Learning can affect the behavioural defences against parasites and pathogens through the acquisition of new aversions for contaminated food for instance. This type of learning relies on the ability to associate a food-related cue with the visceral sickness following ingestion of contaminated food. Despite its potential implication in infection prevention, the existence of pathogen avoidance learning has been rarely explored in invertebrates. In a first part of my PhD, I tested whether D. melanogaster, which feed on food enriched in microorganisms, innately avoid the orally-acquired 'novel' virulent pathogen Pseudomonas entomophila, and whether it can learn to avoid it. Although flies did not innately avoid this pathogen, they decreased their preference for contaminated food over time, suggesting the existence of a form of learning based likely on infection-induced sickness. I further found that flies may be able to learn to avoid an odorant which was previously associated with the pathogen, but this requires confirmation with additional data. If this is confirmed, this would be the first time, to my knowledge, that pathogen avoidance learning is reported in an insect. The detrimental effect of infection on cognition and more specifically on learning ability is well documented in vertebrates and in social insects. While the underlying mechanisms are described in detail in vertebrates, experimental investigations are lacking in invertebrates. In a second part of my PhD, I tested the effect of an oral infection with natural pathogens on associative learning of D. melanogaster. By contrast with previous studies in insects, I found that flies orally infected with the virulent P. entomophila learned better the association of an odorant with mechanical shock than uninfected flies. The effect seems to be specific to a gut infection, and so far I have not been able to draw conclusions on the respective contributions of the pathogen's virulence and of the flies' immune activity in this effect. Interestingly, infected flies may display an increased sensitivity to physical pain. If the learning improvement observed in infected flies was due partially to the activity of the immune system, my results would suggest the existence of physiological connections between the immune system and the nervous system. The basis of these connections would then need to be addressed. Learning and immunity are linked at the physiological level in social insects. Physiological links between traits often result from the expression of genetic links between these traits. However, in social insects, there is no evidence that learning and immunity may be involved in an evolutionary trade-off. I previously reported a positive effect of infection on learning in D. melanogaster. This might suggest that a positive genetic link could exist between learning and immunity. We tested this hypothesis with two approaches: the diallel cross design with inbred lines, and the isofemale lines design. The two approaches provided consistent results: we found no additive genetic correlation between learning and resistance to infection with the diallel cross, and no genetic correlation in flies which are not yet adapted to laboratory conditions in isofemale lines. Consistently with the literature, the two studies suggested that the positive effect of infection on learning I observed might not be reflected by a positive evolutionary link between learning and immunity. Nevertheless, the existence of complex genetic relationships between the two traits cannot be excluded. - L'apprentissage et l'immunité sont deux caractères à valeur adaptative impliqués dans des aspects centraux de la vie d'un organisme : l'apprentissage permet d'ajuster les comportements pour faire face aux changements de l'environnement, tandis que l'immunité protège l'intégrité corporelle contre les attaques des parasites et des pathogènes. Alors que les interactions entre l'apprentissage et l'immunité sont bien documentées chez les vertébrés, ces interactions ont été très peu étudiées chez les insectes. Pendant ma thèse, je me suis intéressée à trois aspects des interactions possibles entre l'apprentissage et l'immunité chez la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster, qui est un organisme modèle dans l'étude à la fois de l'apprentissage et de l'immunité. L'apprentissage peut affecter les défenses comportementales contre les parasites et les pathogènes par l'acquisition de nouvelles aversions pour la nourriture contaminée par exemple. Ce type d'apprentissage repose sur la capacité à associer une caractéristique de la nourriture avec la maladie qui suit l'ingestion de cette nourriture. Malgré les implications potentielles pour la prévention des infections, l'évitement appris des pathogènes a été rarement étudié chez les invertébrés. Dans une première partie de ma thèse, j'ai testé si les mouches, qui se nourrissent sur des milieux enrichis en micro-organismes, évitent de façon innée un 'nouveau' pathogène virulent Pseudomonas entomophila, et si elles ont la capacité d'apprendre à l'éviter. Bien que les mouches ne montrent pas d'évitement inné pour ce pathogène, elles diminuent leur préférence pour de la nourriture contaminée dans le temps, suggérant l'existence d'une forme d'apprentissage basée vraisemblablement sur la maladie générée par l'infection. J'ai ensuite observé que les mouches semblent être capables d'apprendre à éviter une odeur qui était au préalable associée avec ce pathogène, mais cela reste à confirmer par la collecte de données supplémentaires. Si cette observation est confirmée, cela sera la première fois, à ma connaissance, que l'évitement appris des pathogènes est décrit chez un insecte. L'effet détrimental des infections sur la cognition et plus particulièrement sur les capacités d'apprentissage est bien documenté chez les vertébrés et les insectes sociaux. Alors que les mécanismes sous-jacents sont détaillés chez les vertébrés, des études expérimentales font défaut chez les insectes. Dans une seconde partie de ma thèse, j'ai mesuré les effets d'une infection orale par des pathogènes naturels sur les capacités d'apprentissage associatif de la drosophile. Contrairement aux études précédentes chez les insectes, j'ai trouvé que les mouches infectées par le pathogène virulent P. entomophila apprennent mieux à associer une odeur avec des chocs mécaniques que des mouches non infectées. Cet effet semble spécifique à l'infection orale, et jusqu'à présent je n'ai pas pu conclure sur les contributions respectives de la virulence du pathogène et de l'activité immunitaire des mouches dans cet effet. De façon intéressante, les mouches infectées pourraient montrer une plus grande réactivité à la douleur physique. Si l'amélioration de l'apprentissage observée chez les mouches infectées était due en partie à l'activité du système immunitaire, mes résultats suggéreraient l'existence de connections physiologiques entre le système immunitaire et le système nerveux. Les mécanismes de ces connections seraient à explorer. L'apprentissage et l'immunité sont liés sur un plan physiologique chez les insectes sociaux. Les liens physiologiques entre les caractères résultent souvent de l'expression de liens entre ces caractères au niveau génétique. Cependant, chez les insectes sociaux, il n'y a pas de preuve que l'apprentissage et l'immunité soient liés par un compromis évolutif. J'ai précédemment rapporté un effet positif de l'infection sur l'apprentissage chez la drosophile. Cela pourrait suggérer qu'une relation génétique positive existerait entre l'apprentissage et l'immunité. Nous avons testé cette hypothèse par deux approches : le croisement diallèle avec des lignées consanguines, et les lignées isofemelles. Les deux approches ont fournies des résultats similaires : nous n'avons pas détecté de corrélation génétique additive entre l'apprentissage et la résistance à l'infection avec le croisement diallèle, et pas de corrélation génétique chez des mouches non adaptées aux conditions de laboratoire avec les lignées isofemelles. En ligne avec la littérature, ces deux études suggèrent que l'effet positif de l'infection sur l'apprentissage que j'ai précédemment observé ne refléterait pas un lien évolutif positif entre l'apprentissage et l'immunité. Néanmoins, l'existence de relations génétiques complexes n'est pas exclue.

The tumour suppressor LATS2 interacts with both Signalosome and E3 ubiquitin ligases : implications in control of cell cycle progression

SUMMARY LATS2 is a member of the Lats tumour suppressor gene family. The human LATS2 gene is located at chromosome 13q11-12, which has been shown to be a hot spot (67%) for LOH in nonsmall cell lung cancer. Both lats mosaic flies and LATS1 deficient mice spontaneously develop tumours, an observation that is explained by the function of LATS1 in suppressing tumourigenesis by negatively regulating cell proliferation by modulating Cdc2/Cyclin A activity. LATS1 also plays a critical role in maintenance of ploidy through its action on the spindle assembly checkpoint. Initial insights into the function of LATS2 reveals that the protein is involved in the G2/M transition of the cell cycle, whereby it controls the phosphorylation status of Cdc25C. The aim of the present study was to identify LATS2 interacting partners that would provide a more thorough understanding of the molecular pathways in which the protein is involved. The yeast two-hybrid system identified a number of candidate genes that interact with LATS2. Most of the interactions were confirmed biochemically by GST-pull down assays that enabled us to demonstrate that LATS2 is an integral component of the Signalosome complex. The Signalosome is thought to be required for the establishment of functional Cullin-based E3 ubiquitin ligases, the substrate-recognition elements of the ubiquitin-mediated protein proteolytic pathway. The findings that LATS2 also interacts with all of the components of the E3 enzymes allows us to postulate that LATS2 is probably involved in the regulation of this Signalosome-E3 super-complex. In addition, the discovery that LATS2 associates with multiple protein kinases localised at the cellular membrane and in various signalling cascades supports the idea that LATS2 functions as an integrator of signals which allows it to monitor the activity of these pathways and translate these signals through its action on the Signalosome. Furthermore, the observation that a kinase-dead LATS2 mutant arrests at the G2/M phase of the cell cycle, demonstrates that the protein, through the action of its kinase domain, is crucial for progression through the cell cycle, an action in accordance to its proposed role as a regulator of E3 ubiquitin ligases. The findings presented herein provide evidence that LATS2 associates with the Signalosome-E3 ubiquitin ligases super-complex which governs protein stability. Any alteration of the protein would have a strong impact on pathways that modulate cell proliferation, as shown by its implication in tumourigenesis. RESUME LATS2 est un membre de la famille de gènes suppresseurs de tumeurs LATS. Le gène humain LATS2 est situé sur le chromosome 13q11-12, une région qui s'est avérée être un point sensible (67%) dans la perte d'hétérozigosité (LOH) notamment pour le cancer du poumon. Le fait que des tumeurs se développent spontanément chez les souris qui sont déficientes pour le gène LATS1 ainsi que dans des cellules mutantes pour LATS chez la Drosophile, est expliqué Par la fonction de LATS1, qui est de supprimer l'apparition de tumeurs en réprimant la prolifération cellulaire à travers sa capacité à réguler l'activité de Cdc2/Cyciine A. LATS1 joue également un rôle important au niveau du maintient de la ploïdie de la cellule, au travers de son action sur les points de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique. Les premières études du gène LATS2 indiquent que la protéine est, par son contrôle des réactions de phosphorylation de la Cdc25C, impliquée dans la transition 021M. Le but de cette étude était d'identifier les protéines qui interagissent avec LATS2, en vue d'obtenir une compréhension plus approfondie des mécanismes moléculaires dans lesquels LATS2 se trouve engagée. Le système de double-hybride chez la levure a permis l'identification d'un grand nombre de gènes qui interagissent avec LATS2. La plupart des interactions ont été confirmées par GST «pull clown», une technique in vitro qui a permis de démontrer que LATS2 est un composant intégral du Signalosome. Ce complexe est supposé réguler l'activité des E3 ubiquitine-rigases, les éléments responsables du recrutement des substrats qui doivent être recyclés par la voie de dégradation ubiquitine-dépendante. Les résultats obtenus indiquent également que LATS2 interagit avec tous les composants des enzymes E3, ce qui nous permet de soumettre l'idée selon laquelle la protéine LATS2 est en fait impliquée dans la régulation du complexe Signalosorne-E3. De plus, la découverte que LATS2 se trouve associée à plusieurs protéines kinases localisées au niveau de la membrane cellulaire, ainsi que dans diverses voies de transduction, confirment l'idée que LATS2 fonctionne en tant que molécule qui intègre les signaux en provenance de ces différentes voies cellulaires. De ce fait, il lui serait possible de coordonner la destruction des protéines au moyen du complexe Signalosome, permettant ainsi de réprimer l'activité des voies de signalisation. En outre, l'introduction d'une mutation dans le domaine kinase de LATS2 résulte en l'arrêt du cycle cellulaire en G2/M, ce qui montre que la protéine, au travers de son domaine kinase, est cruciale pour le bon fonctionnement du cycle cellulaire, ceci en accord avec son rôle proposé comme régulateur des E3 ubiquitine-ligases. Les résultats présentés dans ce manuscrit démontrent que la protéine LATS2 se trouve associée au complexe Signalosome-E3 qui régule la dégradation des protéines. La moindre modification de la protéine engendrerait des répercussions importantes au niveau des voies de transduction qui contrôlent fa prolifération ceilulaire, ce qui atteste du rôle déterminant que joue LAT32 dans la tumorigénèse.

Hierarchy of Notch-Delta interactions promoting T cell lineage commitment and maturation.

Notch1 (N1) receptor signaling is essential and sufficient for T cell development, and recently developed in vitro culture systems point to members of the Delta family as being the physiological N1 ligands. We explored the ability of Delta1 (DL1) and DL4 to induce T cell lineage commitment and/or maturation in vitro and in vivo from bone marrow (BM) precursors conditionally gene targeted for N1 and/or N2. In vitro DL1 can trigger T cell lineage commitment via either N1 or N2. N1- or N2-mediated T cell lineage commitment can also occur in the spleen after short-term BM transplantation. However, N2-DL1-mediated signaling does not allow further T cell maturation beyond the CD25(+) stage due to a lack of T cell receptor beta expression. In contrast to DL1, DL4 induces and supports T cell commitment and maturation in vitro and in vivo exclusively via specific interaction with N1. Moreover, comparative binding studies show preferential interaction of DL4 with N1, whereas binding of DL1 to N1 is weak. Interestingly, preferential N1-DL4 binding reflects reduced dependence of this interaction on Lunatic fringe, a glycosyl transferase that generally enhances the avidity of Notch receptors for Delta ligands. Collectively, our results establish a hierarchy of Notch-Delta interactions in which N1-DL4 exhibits the greatest capacity to induce and support T cell development.

Current millennium biotechniques for biomedical research on parasites and host-parasite interactions

The development of biotechnology in the last three decades has generated the feeling that the newest scientific achievements will deliver high standard quality of life through abundance of food and means for successfully combating diseases. Where the new biotechnologies give access to genetic information, there is a common belief that physiological and pathological processes result from subtle modifications of gene expression. Trustfully, modern genetics has produced genetic maps, physical maps and complete nucleotide sequences from 141 viruses, 51 organelles, two eubacteria, one archeon and one eukaryote (Saccharomices cerevisiae). In addition, during the Centennial Commemoration of the Oswaldo Cruz Institute the nearly complete human genome map was proudly announced, whereas the latest Brazilian key stone contribution to science was the publication of the Shillela fastidiosa genomic sequence highlythed on a Nature cover issue. There exists a belief among the populace that further scientific accomplishments will rapidly lead to new drugs and methodological approaches to cure genetic diseases and other incurable ailments. Yet, much evidence has been accumulated, showing that a large information gap exists between the knowledge of genome sequence and our knowledge of genome function. Now that many genome maps are available, people wish to know what are we going to do with them. Certainly, all these scientific accomplishments will shed light on many more secrets of life. Nevertheless, parsimony in the weekly announcements of promising scientific achievements is necessary. We also need many more creative experimental biologists to discover new, as yet un-envisaged biotechnological approaches, and the basic resource needed for carrying out mile stone research necessary for leading us to that "promised land"often proclaimed by the mass media.

Phytohormone collaboration: zooming in on auxin-brassinosteroid interactions.

Similar to animal hormones, classic plant hormones are small organic molecules that regulate physiological and developmental processes. In development, this often involves the regulation of growth through the control of cell size or division. The plant hormones auxin and brassinosteroid modulate both cell expansion and proliferation and are known for their overlapping activities in physiological assays. Recent molecular genetic analyses in the model plant Arabidopsis suggest that this reflects interdependent and often synergistic action of the two hormone pathways. Such pathway interactions probably occur through the combinatorial regulation of common target genes by auxin- and brassinosteroid-controlled transcription factors. Moreover, auxin and brassinosteroid signaling and biosynthesis and auxin transport might be linked by an emerging upstream connection involving calcium-calmodulin and phosphoinositide signaling.

Ablation of caterpillar labial salivary glands: technique for determining the role of saliva in insect-plant interactions.

There has been an ardent interest in herbivore saliva due to its roles in inducing plant defenses and its impact on herbivore fitness. Two techniques are described that inhibit the secretion of labial saliva from the caterpillar, Helicoverpa zea, during feeding. The methods rely on cauterizing the caterpillar's spinneret, the principal secretory structure of the labial glands, or surgically removing the labial salivary gland. Both methods successfully inhibit secretion of saliva and the principal salivary enzyme glucose oxidase. Caterpillars with inhibited saliva production feed at similar rates as the untreated caterpillars, pupate, and emerge as adults. Glucose oxidase has been suggested to increase the caterpillar's survival through the suppression of inducible anti-herbivore defenses in plants. Tobacco (Nicotiana tabacum) leaves fed on by caterpillars with ablated salivary glands had significantly higher levels of nicotine, an inducible anti-herbivore defense compound of tobacco, than leaves fed upon by caterpillars with intact labial salivary glands. Tomato (Lycopersicon esculentum) leaves fed upon by caterpillars with suppressed salivary secretions showed greatly reduced evidence of hydrogen peroxide formation compared to leaves fed upon by intact caterpillars. These two methods are useful techniques for determining the role that saliva plays in manipulating plant anti-herbivore defenses.

Preliminary results on the effects of CD40/CD40L interactions and SAC-induction on IFN-gamma expression in human schistosomiasis

In this communication the authors analyzed the pattern of expression of IFN-gamma as a surrogate type 1 response in different clinical forms of schistosomiasis in response to stimulation involving T-cell dependent and T-cell independent pathways, to investigate which pathways were functional in human schistosomiasis, and to further characterize the nature of Th1 response impairment in this parasitic disease.

Characterization of high osmolarity-induced vacuole fragmentation in "Saccharomyces c."

La majorité des organelles d'une cellule adaptent leur nombre et leur taille pendant les processus de division cellulaire, de trafic vésiculaire ou suite à des changements environnementaux par des processus de fusion et de fragmentation membranaires. Ceci est valable notamment pour le golgi, les mitochondries, les péroxisomes et les lysosomes. La vacuole est le compartiment terminal de la voie endocytaire dans la levure Saccharomyces cerevisiae\ elle correspond aux lysosomes des cellules mammifères. Suite à un choc hyperosmotique, la vacuole se fragmente en plusieurs petites vésicules. Durant ce projet, cette fragmentation a été étudiée en utilisant la technique de microscopie confocale in vivo. J'ai observé que la division de la vacuole se produit d'une façon asymétrique. La première minute après le choc osmotique, les vacuoles rétrécissent et forment des longues invaginations tubulaires. Cette phase est dépendante de la protéine Vps1, un membre de la famille des protéines apparentées à la dynamine, ainsi que d'un gradient transmembranaire de protons. Pendant les 10-15 minutes qui suivent, des vésicules se détachent dans les régions où l'on observe les invaginations pendant la phase initiale. Cette deuxième phase qui mène à la fission des nouveaux compartiments vacuolaires dépend de la production du lipide PI(3,5)P2 par la protéine Fab1. J'ai établi la suite des événements du processus de fragmentation des vacuoles et propose la possibilité d'un rôle régulateur de la protéine kinase cycline-dépendante Pho85.¦En outre, j'ai tenté d'éclaircir plus spécifiquement le rôle de Vps1 pendant la fusion et fission des vacuoles. J'ai trouvé que tous les deux processus sont dépendants de l'activité GTPase de cette protéine. De plus l'association avec la membrane vacuolaire paraît régulée par le cycle d'hydrolyse du GTP. Vps1 peut lier la membrane sans la présence d'un autre facteur protéinique, ce qui permet de conclure à une interaction directe avec des lipides de la membrane. Cette interaction est au moins partiellement effectuée par le domaine GTPase, ce qui est une nouveauté pour un membre de cette famille de protéines. Une deuxième partie de Vps1, nommée insert B, est impliquée dans la liaison à la vacuole, soit par interaction directe avec la membrane, soit par régulation du domaine GTPase. En assumant que Vps1 détienne deux régions capables de liaison aux membranes, je conclus qu'elle pourrait fonctionner comme facteur de « tethering » lors de la fusion des vacuoles.¦-¦La cellule contient plusieurs sous-unités, appelées organelles, possédant chacune une fonction spécifique. Dépendant des processus qui s'y déroulent à l'intérieur, un environnement chimique spécifique est requis. Pour maintenir ces différentes conditions, les organelles sont séparées par des membranes. Lors de la division cellulaire ou en adaptation à des changements de milieu, les organelles doivent être capables de modifier leur morphologie. Cette adaptation a souvent lieu par fusion ou division des organelles. Le même principe est valable pour la vacuole dans la levure. La vacuole est une organelle qui sert principalement au stockage des aliments et à la dégradation des différents composants cellulaires. Alors que la fusion des vacuoles est un processus déjà bien décrit, la fragmentation des vacuoles a jusqu'ici été peu étudiée. Elle peut être induit par un choc osmotique: à cause de la concentration de sel élevé dans le milieu, le cytosol de la levure perd de l'eau. Par un flux d'eau de la vacuole au cytosol, la cellule est capable d'équilibrer celui-ci. Quand la vacuole perd du volume, elle doit réadapter le rapport entre surface membranaire et volume, ce qui se fait efficacement par une fragmentation d'une grande vacuole en plusieurs petites vésicules. Comment ce processus se déroule d'un point de vue morphologique n'a pas été décrit jusqu'à présent. En analysant la fragmentation vacuolaire par microscopie, j'ai trouvé que celle-ci se déroule en deux phases. Pendant la première minute suivant le choc osmotique, les vacuoles rétrécissent et forment des longues invaginations tubulaires. Cette phase dépend de la protéine Vps1, un membre de la famille des protéines apparentées à la dynamine, ainsi que du gradient transmembranaire de protons. Ce gradient s'établit par une pompe membranaire, la V-ATPase, qui transporte des protons dans la vacuole en utilisant l'énergie libérée par hydrolyse d'ATP. Après cette phase initiale, la formation de nouvelles vésicules vacuolaires dépend de la synthèse du lipide PI(3,5)P2.¦Dans la deuxième partie de l'étude, j'ai tenté de décrire comment Vps1 lie la membrane pour effectuer un remodelage de la vacuole. Vps1 est nécessaire pour la fusion et la fragmentation des vacuoles. J'ai découvert que tous les deux processus dépendent de sa capacité d'hydrolyser du GTP. Ainsi l'association avec la membrane est couplée au cycle d'hydrolyse du GTP. Vps1 peut lier la membrane sans la présence d'une autre protéine, et interagit donc très probablement avec les lipides de la membrane. Deux parties différentes de la protéine sont impliquées dans la liaison, dont une, inattendue, le domaine GTPase.¦-¦Numerous organelles undergo membrane fission and fusion events during cell division, vesicular traffic, or in response to changes in environmental conditions. Examples include Golgi (Acharya et al., 1998) mitochondria (Bleazard et al., 1999) peroxisomes (Kuravi et al., 2006) and lysosomes (Ward et al., 1997). In the yeast Saccharomyces cerevisiae the vacuole is the terminal component of the endocytic pathway and corresponds to lysosomes in mammalian cells. Yeast vacuoles fragment into multiple small vesicles in response to a hypertonic shock. This rapid and homogeneous reaction can serve as a model to study the requirements of the fragmentation process. Here, I investigated osmotically induced fragmentation by time-lapse microscopy. I observe that the small fragmentation products originate directly from the large central vacuole by asymmetric scission rather than by consecutive equal divisions and that fragmentation occurs in two distinct phases. During the first minute, vacuoles shrink and generate deep invaginations, leaving behind tubular structures. This phase requires the dynamin-like GTPase Vps1 and the vacuolar proton gradient. In the subsequent 10-15 minutes, vesicles pinch off from the tubular structures in a polarized fashion, directly generating fragmentation products of the final size. This phase depends on the production of phosphatidylinositol- 3,5-bisphosphate by the Fab1 complex. I suggest a possible regulation of vacuole fragmentation by the CDK Pho85. Based on my microscopy study I established a sequential involvement of the different fission factors.¦In addition to the morphological description of vacuole fragmentation I more specifically aimed to shed some light on the role of Vps1 in vacuole fragmentation and fusion. I find that both functions are dependent on the GTPase activity of the protein and that also the membrane association of the dynamin-like protein is coupled to the GTPase cycle. I found that Vps1 has the capacity for direct lipid binding on the vacuole and that this lipid binding is at least partially mediated through residues in the GTPase domain, a complete novelty for a dynamin family member. A second stretch located in the region of insert Β has also membrane-binding activity or regulates the association with the vacuole through the GTPase domain. Under the assumption of two membrane-binding regions I speculate on Vps1 as a possible tethering factor for vacuole fusion.